Biz pSil-GFP yapı, Şekil 1 resimde Dr Alper Uzun ve konfokal mikroskopi için Leduc biyogörüntüleme kolaylığı sağlanması için Dr Şirin Bonni teşekkür ederim. EMM Burroughs Wellcome Fonu, bir NARSAD Genç Araştırmacılar Ödülü ve NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 Tıp Bilim Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 tarafından desteklenen ve PHS NRSA 5T32MH019118-20 destek aldı.

1. (Değil video) Kültür ve Medya Çözümleri hazırlanması <ol><li> 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH7.4), 30 mM D-glukoz, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4 ve 4 mM NaHCO 3 içeren Complete Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 1 litre hazırlayın. Çift distile su (GKD 2 O) ekleyin. 4 at 0.2-mikron filtre ve mağaza ° C ile sterilize filtreleme </li><li> Bazal ortam Eagle Medium, 35 mL kültür ortamı kullanılarak dilim, Complete HBSS 12.9 mL, 20 mM D-glikoz (1 M çözeltiden 1.35 mL), 1 mM Glutamax (200 mM a çözeltisi 0.25 mL), 0.5 ml penisilin hazırlamak -streptomisin 100x stok. Bir 0.2-mikron filtre ile sterilize filtre uygulayın, sonra% 5 oranında bir son konsantrasyon serum ısı ile inaktive edilmiş at ekleyin. </li><li> 1 mg / distile deiyonize su ile Laminin mL stok çözelti yaparak Laminin çalışma çözeltisi hazırlayın. -80 Az 0,5 ml Eppendorf tüplerinde 100 mcL alikotları hazırlayın ve dondurma ° C </li><li> Böylece poli-L-lizin çalışma hazırlamakbir 1 mg / mL stok solüsyonu yapmak için poli-L-lizin 5 mg steril H2O 5 mL ekleyerek Direkt Ekspres. -20 ° C&#39;de 1 ml hacimde ve dondurma hazırlayın </li><li> Steril su ile 12 ml nihai hacme poli-L-lizin, 1 ml ve laminin 100 uL seyreltilmesi ile kaplama çözeltisi hazırlayın. Her defasında taze bu çözüm olun. </li></ol> 2. Organotipik Dilim Uçlar (değil video) hazırlanması <ol><li> Tek bir kültür insert başına iyi steril forseps kullanarak iki adet altı-iyi plakaları hazırlayın. Kültür ekler altında steril GKD 2 O 2 mL ekleyin. </li><li> Ponksiyonu ile membran bakımı olmayan alarak membran üst kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir. 37 nemlendirilmiş bir inkübatörde gece inkübe ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Kaplama ortamı çıkarın ve steril H 2 0 üç kez membran yıkayın. Kullanmadan önce kuru ekler edelim. ° C inkübatör 37 kesit kültürü, orta ve yerin 1.8 mL ekleyin. Parafilm ile kullanılmayan tabak sarınve 4 haftaya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. (Değil video) Elektroporasyon için hazırlanıyor <ol><li> Elektroporasyon için RNAi yapıları hazırlayın. Çift dallı RNA firkete ekler pSilencer vektörünün içine klonlandı. Plazmid içerir: 1) çift bükümlü RNA&#39;nın kuşak süren bir U6 promotör, ve 2), bir GFP ifade kaseti CMV promotör 8,9 tarafından tahrik. Bu plazmid önceden Konishi ve arkadaşları, 9 ve diğerleri 7,8 tarafından tarif edilmiştir. Plazmidler, bir Qiagen Maxi-hazırlık kiti kullanılarak saflaştırıldı, ve 1 mg / mL &#39;lik bir konsantrasyonda kullanılır. </li><li> Enjekte ederken DNA canlandırmak için,% 0.5 &#39;lik hızlı yeşil boya solüsyonu hazırlamak ve (genellikle hızlı yeşil 1 uL sahip DNA 20 ul) enjekte edilecek olan DNA ile 01:20 olarak kullanılabilir. Arta kalan DNA&#39;nın hızlı yeşil bir boya karışımı bir hafta boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Temiz disseksiyon alanında, dissecting araçları ve% 70 etanol ile vibratome gemi. O buz gibi soğuk olacak şekilde tam HBSS soğutun. Hızlı soğutma için bir miktar su ile vibratome içinde etrafına buz paketleyip Chill vibratome gemi. Tam HBSS kullanılarak% 3 düşük erime noktası agaroz hazırlayın. 1 dakikalık mikrodalga. Kaynar kaçının. Kullanımı kadar 42 ° C su banyosunda tutun. </li><li> Elektroporasyon parametreleri aşağıdaki gibi ayarlanır. Bir E15 embriyo kullanımı 35 V için 5 bakliyat, 100 ms uzunluğu, darbeler arasında 900 ms aralığı. Yaşlı hayvanlar için elektroporasyon sağlamak için, 50 V yüksek voltaj kadar kullanmak veya 8 darbeleri darbe sayısını artırmak. Genç hayvanlarda doku zarar vermemek için, 25 ya da daha az darbeler veya en fazla 2 bakliyat ve düşük voltaj kadar kullanmak V. Bu parametreler çeşitlidir ve ampirik hayvanın yaşına bağlı olarak belirlenebilir. </li></ol> 4. Diseksiyon ve Elektroporasyon (video) <ol><li> Hamile bir kadın euthanizing sonra, buz gibi tam HBSS içine embriyo dışarı incelemek. Kebireysel plasental keseler her embriyo ep. </li><li> Embriyo dışarı inceleyin ve ilk vertebra sonra kafasını kesti. Buz gibi tam HBSS tutun. </li><li> Enjeksiyon için, petri üstüne parafilm parçasının üzerine kafa yerleştirin. Kortikal veziküller her iki lateral ventrikül doldurmak için üçüncü ventrikül ile hızlı yeşil boya karışımı: Özel kullanarak Hamilton enjektörü DNA 8 ila yaklaşık 6 uL enjekte (Tablo I bakınız) yaptı. Alternatif olarak, enjeksiyon her lateral ventrikül doğrudan yapılabilir. </li><li> Ex vivo elektroporasyon için BTX-cımbız platin elektrot kullanın. Eğer dorsal korteks için kafa yani üst electroporate istediğiniz korteksin tarafına doğru pozitif elektrot yerleştirin. </li><li> Elektroporasyon sonra diseksiyon önce en az 5 dakika buz üzerinde kafaları inkübe. </li><li> Buz HBSSby baş tarafında küçük bir kesi yapmak ve baş tarafı kapalı cilt soyma beyinde parçalara ayır. Ile, bir sonrakiyavaşça sıyırın ince forseps beyinden pia. Kortekse zarar vermemeye özen, kafatası sağlam beyin çıkarın. </li></ol> 5.. (Video) gömme ve Electroporated korteksleri Kesit <ol><li> Buz üzerine yerleştirilmiş büyük bir kalıp içine% 3 düşük erime noktası agaroz aktarın. Kalıbın tabanındaki hızlı kalıbın alt aşağı batmasını beyinleri önleyecek olan katılaşmaya başlayacaktır. Nazikçe, ince forseps bir Kimwipe veya filtre kağıdı ile aşırı tamponu çıkardıktan sonra tek tek ile beyni aktarın. Agaroz ve beyin dokusu arasında maksimum arayüz sağlamak için kalıbın içerisine girdap beyinlerine 10 uL pipet ucu kullanın. </li><li> Tüm beyinleri sağlamak için yönlendirmek beyinleri aynı yönde ve agaroz yaklaşık aynı seviyededir. Agaroz yaklaşık 5 dakika süreyle katılaşmaya edelim. Olfaktör ampuller ayakta böylece agaroz blokları eklemek yapıştırma (deli yapıştırıcı) kullanın. Bloklar tutturulur hemen sonra, i eklemece soğuk HBSS ve emin tek tek dilimler için agaroz kırpmak her beyin için elde edilmiştir. </li><li> , Dilim bloklar düşük hızlı (yarı maksimum hakkında) için vibratome hızına ayarlayın ve en yüksek ayarda bıçak titreşim frekansı ayarlamak için. 250 mikron kalınlığında koronal dilimleri oluşturun. Boynu bükük ince spatula ile dilim almak ve ince bir fırça veya forseps ile doku kuyu aktarabilirsiniz. </li><li> Doku kültürü kaputu, kaplamalı uçlar içine dilimlerini aktarabilir. Transferi kolaylaştırmak için her ekleme için kesit kültürü medya 500 uL ekleyin. En fazla 5 dilimleri eklemek için başına yerleştirilebilir. Dilimleri üst fazla olan ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de nemli inkübatörde inkübe. </li></ol> 6. Kültür ve Organotipik Dilimler Analizi (video) <ol><li> Sağlıklı dilimler korumak amacıyla, taze ortam ortam her yarım değiştirerek membranı altında en az iki günde ilave edilmelidir. </li><li> D sonra dilimleri analiz etmek içinkültür esired gün, membran dilimleri düzeltin. ° C üç kez 10 dakika, her sefer için 37 1x fosfat salin tamponu (PBS) ile yıkayın. Sonra, 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 1 saat için gece boyunca 4% paraformaldehit (PFA) ile sabitlemek. </li><li> Dilimler, farklı hücresel belirteçleri ile analiz veya electroporated ve non-electroporated hücreleri canlandırmak için tek başına Hoechst ile boyanmış olabilir. Geçirgenliği ve% 10 serum keçi, yumuşak çalkalama ile 1x PBS içinde% 0.1 Triton ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca dilimleri bloke eder. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Hoechst ile lekesi, her seferinde nazik çalkalanarak 1x 10 dakika PBS ile 3 defa yıkanır. </li><li> Dilimleri bir neşter ile membran kesilerek monte ve buzlu cam dilim içeren membran aktarmak için güzel bir forseps kullanmak için bir su haznesi içinde kayar. Kadar 5 dilim cam slayt başına yerleştirilebilir. Fazla suyu uzaklaştırınız, ve her beyin dilime Flourmount bir damla ekleyin. Yavaşça beyin dilimleri üstünde coverslip yerleştirin ve bir kaldırmay hava kabarcıklar. Bir konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri analiz edin. </li></ol> 7. Organotipik Dilimler Alternatif Parafin Gömme (değil video) <ol><li> Organik tip dilimler da bu amaçla, daha ince bir morfolojik analizi için parafin için gömülebilir organotipik dilim içeren membran PFA yukarıda açıklandığı gibi% 4 sabitlenebilir. </li><li> Sabit bir dilim% 1 agaroz (37 ° C ila önceden ısıtılmış) içine gömülü, ve 30 dakika süreyle buz içinde katılaştırılmış edilir. Agaroz bloklar daha sonra 30 dakika süreyle 4 ° C&#39;de% 4 PFA post-tespit edilebilir. </li><li> Organotipik dilim içeren agaroz blok sonra parafine gömüldü ve daha önce açıklandığı gibi 10 immünfloresan için işlenecektir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Organotipik dilimlerin murin korteks ve kültür elektroporasyon şematik bir temsilini Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu yöntem, rapi için yararlı bir stratejiNöronal gelişimi 11 yer genlerin işlevine d değerlendirmesi. DNA electroporated miktarını ve elektroporasyon azından embriyonik aşamada bağlı olarak, transfeksiyon verim olarak değişecektir. Dilimler en az 8 saat sonrası elektroporasyon ve hücrelerin kültür nörojenik olaylar (proliferasyon, göç, ve erken nöronal farklılaşma) normal sırasını uğrayacaktır GFP ifade başlayacaktır. Şekil 2 pSilencer-GFP bir kontrol ifade edilen bir electroporated beyin kesit gösterir vektör ve bir nöronal ataları, göç nöronlar ve dilim farklı nöronların gözlemleyebilirsiniz. Bu membranlar iyi bir ortam hava arayüzü tutulur ve kültür alanında en az 5 gün öncesine kadar kullanılabileceği gibi Organotipik dilim sürece kendi morfolojisi devam edecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> Şekil 1.. Ex vivo elektroporasyon ve organotipik dilim İllüstrasyonkültür testi. E14.5 embriyosu çıkarılmış, ve ayrı ayrı enjeksiyon görselleştirmek için hızlı yeşil boya ile karıştırılır DNA ile enjekte edilir. Lateral ventrikül doldurmak için resimde veya üçüncü ventrikül de tasvir edildiği gibi DNA lateral ventrikül hem enjekte edilebilir. Enjeksiyon sonrası, beyin beynin istenilen tarafında pozitif elektrot yerleştirerek, bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. Beyinler% 3 düşük erime noktası agaroz ve vibratome kullanarak kesitli gömülür. 250 mikron beyin kesitleri 0,4 mikron ekler yerleştirilir ve bir hafta kadar kültürlenmiştir. GFP 8 saat sonra transfeksiyon sonrasında görülebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> Şekil 2. Electroporated beyin kesitleri analizi. Electroporated beyin kesitleri Hoescht için boyandı. Dorsal korteks ventriküler zon (vz) at electroporated nöronal ataları gösterir. Ulna dia nöronlarıncal plakası (cp) marjinal zon (mz) tarafından sınırlandırılır. Beyaz oklar göç nöronlar göstermektedir. Bu durumda, beyin E15.5 enjekte edildi ve bir pSilencer GFP kontrol vektörü ile electroporated. Bölümlerde 4 gün elektroporasyon sonra kortikal eksplantları temsil eder. Ölçek çubuğu 100 mikron. Sorun Giderme: <ol><li> Düşük transfeksiyon verim: en az 1 mg / ml için kullanılan DNA konsantrasyonu ayarlayın. Gerekiyorsa bir endo-free Quiagen kiti DNA arındırmak için ise her zaman bir maxi hazırlık çok temiz DNA kullanın. </li><li> Bir istenenden daha farklı bir beyin bölgesinde transfekte edilmiş hücrelerin: elektrotlar electroporated edilecek beyin tarafına doğru pozitif elektrot pozisyonu ile düzgün bir şekilde konumlandırılır dikkat ediniz. </li><li> Her gün Değişim medya ve dilimler medya yüzen kalmamalarını sağlamak: Organotipik dilimleri morfolojisi kaybetmek </li><li> Onlar vi kesiliyorlar olarak Dilimleri agaroz dökülmekbratome: düşük erime noktası agaroz in beyinleri gömerken iyi bir hale arayüz olmasına dikkat ediniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Çift sarmallı RNA hairpins 8 ve 4 çok özel avantajlar sağlar organotipik dilim kültürü kodlayan plazmidlerin ex vivo elektroporasyon içeren bu yöntemleri. İlk olarak, bu yöntemler RNAi-türevi fenotip hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Çift RNA firkete tahrik U6 promot.örünü içerir, aynı pSilencer vektör içinde bir ifade kaseti kodlama GFP dahil edilmesi RNAi vektörü ile electroporated hücrelerinin hızlı bir tanımlama ve karakterizasyonu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Hamilton enjektörü </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 0.5 inç uzunluğunda 31 gauge, PT-4 (nokta beveling düzeyi), 10μl hacmi </td></tr><tr><td> Platin tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm boyutu </td></tr><tr><td> ECM830 elektroporatörün </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Ayak Pedalı </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> ECM830 elektroporatörün ile kullanım için </td></tr><tr><td> Bıçak mikrotom Titreşimli </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - ekler ile kullanmak için iyi çanak </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Ekler uyacak çentikler içerir </td></tr><tr><td> Doku kültürü ekler </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0.4 mikrometre </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük Erime Agaroz </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNA notu </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Bazal Orta Kartal </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> Ca ve Mg olmadan 10x HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-serbest asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

Serebral korteks yüksek bilişsel fonksiyonları yönlendirir. Bu altı tabakalı yapı son doğan nöronlar beyin 1 yüzeyine doğru ilk doğan nöronlar geçen geçiş sırasında ilk doğan nöronlar ventrikül yakın kalır olan bir içten-birinci dış-son şekilde, oluşturulur. Nöronal migrasyon 2 ek olarak, normal kortikal işlev için bir anahtar işlemi nöronal morfojenezini 3 arasında bir düzenlemedir. Nöronal morfogenez primer kültürlerinde in vitro okudu olabilir iken, bu süreçleri doku ortamlarda nasıl düzenlendiği öğrenilecek çok şey var. Biz serebral korteks 4,6 organotipik dilimler halinde nöronal migrasyon ve / veya morfonogenezi analiz teknikleri anlatıyoruz. Bir pSilencer modifiye vektör çift zincirli RNA firkete süren bir U6 organizatörü ve b tahrik GFP protein kodlar ayrı bir ifade kaseti hem de içerir kullanılırya CMV organizatörü 7-9. Bizim yaklaşımımız aday genler belirli devirme üzerine akson uzantısı kusurların hızlı değerlendirme sağlar ve başarılı bir akson uzantısı 8 düzenleyiciler için bir ekran kullanılmıştır. Hücrelerin sadece bir alt kümesini RNAi yapıları ifade Çünkü, organotipik dilim potansiyeli fenotipleri bir mozaik analizi için izin verir. Bu analizin in vivo ortamda bir yanında yaklaşık yapılır, çünkü Dahası, bu bilinmeyen kortikal fonksiyonunun genleri için düşük maliyetli ve transjenik hayvanların ya da boşaltma üretimi için hızlı bir alternatiftir. Son olarak, in vivo elektroporasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, ex vivo elektroporasyon deneylerin başarıya yetkin cerrahi beceri geliştirme bağımlı değildir ve kısa bir eğitim süresi ve beceri ile yapılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex at JoVE.com

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler açıklanmaktadır<em&gt; Ex vivo</emPlazmit&gt; elektroporasyon inhibitör RNA (RNAi) ve fare embriyonik kortekste GFP ortak dile getirdi. Bu protokol, nörogenez, nöronal migrasyon ve dendrit ve akson akıbet de dahil olmak üzere nöronal morfonogenezi gibi nörogelişimsel çeşitli yönleriyle incelenmesi için uygundur.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

methods-for-study-neuronal-morphogenesis-ex-vivo-rnai-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K Görüntüleme.  Brown University. Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler açıklanmaktadır Ex vivo elektroporasyon inhibitör RNA (RNAi) ve fare embriyonik kortekste GFP ortak dile getirdi. Bu protokol, nörogenez, nöronal migrasyon ve dendrit ve akson akıbet de dahil olmak üzere nöronal morfonogenezi gibi nörogelişimsel çeşitli yönleriyle incelenmesi için uygundur.

Video: Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...