Bu protokol, kültür adımlarını düzene sokmak, yüksek kaliteli eksplantlar elde etmek için basit bir yaklaşım içerir ve koklear hücrelerin moleküler mekanizmalarının araştırılmasına ve ortaya çıkarılmasına katkıda bulunur. Bu tekniğin ana avantajı, diseksiyon adımlarını, uygun polimer yüzey kaplamasını, optimize edilmiş orta hacmi ve eksplantların bağlanma süresini koordine ederek minimum doğrudan organ kullanımıdır. Bu teknik, sensörinöral işitme kaybını incelemek için popüler bir in vitro yaklaşımı temsil eder.
Bu, ototoksik modeller oluşturmak, yapısal analiz yapmak, sinyal yollarını değerlendirmek ve ilaç tarama çalışmaları yapmak için kullanılabilir. Prensip olarak, bu yöntem farklı doku eksplantlarına uygulanabilir. Embriyonik gelişim aşamaları hakkında fikir edinmek için iç kulak araştırmalarında da kullanılabilir.
Başlamak için, kafası kesilmiş farenin kafasını steril pedin üzerine yerleştirin. Mandibulayı çıkarmak için makas ve forseps kullanın, ardından cildi kaldırın ve kafatasından geri soyun. Kafatasını tutmak için forsepsleri yörünge boşluklarına yerleştirin.
Keskin bir neşter bıçağı kullanarak, kokleaya zarar vermeden kafatasını sagital sütür boyunca ve ardından koronal sütür alanı boyunca dikkatlice kesin. Şimdi, beyni iki kafatası yarısından çıkarın. Mikroskop altında, kokleayı temporal kemikte lokalize edin ve koklea ile temporal kemik arasındaki çevre dokuyu gevşetin.
Ardından forsepsleri üst yarım daire kanalına yerleştirin. Temporal kemiği yavaşça kokleadan uzaklaştırın ve girişe bağlı kokleayı temporal kemikle tutun. Forseps uçlarını beyaz bir çizgi olarak görünen apeks bölgesine yerleştirin ve koklear kanalı ortaya çıkarmak için kıkırdaklı koklear kapsülü parça parça çıkarın.
Forsepsleri kokleanın altına yerleştirin ve vestibüler organ ve temporal kemikten ayırın. Kokleayı buz gibi soğuk PBS içeren 60 milimetrelik yeni bir kaba aktarın. Corti eksplant organlarını izole etmek için, organı tabanda ve koklear kanalı bazal kanca bölgesinde tutun ve koklear kanalı yırtmadan modiolustan nazikçe gevşetin.
Ardından koklear kanalı tabanda tutun ve spiral ligament ve stria vaskularisi çekin. Koklear eksplantları izole etmek için, spiral ganglionu kemik spiral laminadan ayırmak için forseps kullanın ve dekolman sırasında modiolusu gevşetin. Forseps ile kanca bölgesini kavrayın ve stria vaskularis ile spiral ligamenti çıkarın.
Ayrıca, Reissner'in zarını parça parça çıkarın. Koklear eksplantları aktarmak için, eksplantın bulunduğu tabağa bir laboratuvar spatulası batırın. Bir spatula sallayarak birkaç mikrolitre PBS ile birlikte saç hücreleri yukarı bakacak şekilde eksplantı kaldırın.
Spatulayı ortamda hafifçe sallayarak eksplantını sekiz oyuklu bir hazne slaytına yerleştirin. Eksplantın odaya kaymasına izin verin. 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak 80 mikrolitre ortamı çıkarın ve atın.
Mikroskop altında saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöron hücrelerinin görünürlüğünü kontrol edin. Gerekirse, üst üste binen dokuyu ayırmak için forseps kullanın. Kalan ortamı kuyudan çıkarın.
Eksplant şimdi odanın yüzeyinde daha düz duracaktır. 10 saniye sonra, eksplantın hemen yanındaki ortamdan bir veya iki damla geri pipetleyin ve eksplant ayrılmasını önlemek için kalan ortamı biraz uzağa pipetleyin. Ortamı eklerken eksplantların hareket etmediğinden emin olun.
Organları odanın tabanına sıkıca tutturmak için odayı iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin. Ve 100 veya 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, dikkatlice 300 mikrolitre taze, önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin.
Dönen disk konfokal mikroskobik görüntüler, Corti eksplantlarının sıçan organının hem normal hem de stresli koşullar altında yapılarını ve toplam uzunluklarını koruduğunu gösterdi. Ek olarak, bir taramalı konfokal mikroskop, apoptoz geçiren saç hücreleri ile birlikte fare organlarından eksplantların hayatta kalan saç hücrelerini gösterdi. Protokol, uygun hücre geçirgen problar ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak canlı koklear hücrelerdeki biyolojik işlemcilerin izlenmesini sağladı.
Bu koklear eksplantların kültürü, tüy hücreleri ve spiral ganglion hücreleri arasındaki etkileşimin analizini geliştirir. Koklear implantların saç hücreleri, saç hücresi belirteci MYO7A ile tespit edildi. Benzer şekilde, sağlıklı ve hasarlı spiral ganglion hücre gövdeleri ve nöritler, nöronal belirteç Tuj 1 kullanılarak tanımlandı.
Büyütülmüş genel bakışta, MYO7A antikoru ile etiketlenmiş saç hücrelerinin hücre gövdeleri görüldü. Dış saç hücresi stereosilileri ve falloidin ile etiketlenmiş bireysel iç saç hücresi stereosilyalarının evrişimsiz görüntüleri tanımlandı. Mikroskop altında yapılan işlemlerde, özellikle spiral ganglionu kemiksi spiral laminadan ayırırken dikkatli olunmalıdır.
Sağlam eksplantlar dikkatli bir şekilde aktarılmalı ve hizalanmalıdır. Bu protokol, iç kulak eksplantları üzerinde yapılan in-vitro çalışmaları optimize etmiştir. Sinyal yolakları ve ilaç toksisitesi gibi bu çalışmaların sonuçları, daha ileri in-vivo çalışmaların tasarımına rehberlik edebilir.
