Biz kafesli floresein-dekstran sentezi protokolü sağlayan J. Chen ederim. Bu araştırma Dimes ödülü 5-FY09-78, Amerikan Kalp Derneği ödülünü 09BGIA2090075 yılının Mart tarafından desteklenen ve SS NIH / NHLBI ödülü R01 HL107369-01 özel yaptığı mikroskopi yardım için C. Closson için teşekkür ederim. Edildi

1. Kafesli floresein-dekstran sentezi (Ref uyarlanmıştır. 14) <ol><li> Sodyum ve bir 0.1 M çözelti hazırlayın GKD 2 O. içinde seyreltilmiş bor </li><li> 10 kDa aminodextran 4 mg ölçün ve CMNB-kafesli floresein tüpüne ekleyin. </li><li> CMNB-kafesli floresein tüpüne hazırlanmış sodyum borat çözeltisi (adım 1.1) 500 mcL ekleyin. Karışım çözünmesi için 30 saniye için tüp ve girdap kapak takın. </li><li> Karışım, oda sıcaklığında bir gece boyunca reaksiyona nutator izin verir. Ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün. </li><li> Alt kapağı kapalı bir Zeba desalt spin kolon ve büküm edinin. Santrifüj zaman yönlendirmek için kolon kullanılır sütun üzerinde bir nokta işaretleyin. Bir 15 mL konik Falcon tüp içinde sütun yerleştirin. Not: spin kolon içinde çözüm sütunu tampon olduğunu. </li><li> Desalt spin kolon üzerine üst kapağını gevşetin. Bir centr yılında desalt spin kolon evler 15 ml konik Falcon tüp yerleştirinifuge. Orient işaretlenmiş nokta ile spin kolon (adım 1.4) santrifüj rotor merkezine bakan. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin tüp. </li><li> Santrifüj sonra, Falcon tüp desalt spin kolon çıkarın. Yoluyla toplanmış akış ve 15 ml konik boru her ikisi de atın. Yeni bir 15 ml konik Falcon tüp alın ve yeni Falcon tüp desalt spin kolon yerleştirin. Not: santrifüjleme sonra, reçine yatağının kolon sıkıştırılmış olmalıdır görünür. Hemen sütunu kullanın. </li><li> Adım 1.3 reaksiyon karışımı (floresein-dekstran kafesli) edinin. Spin kolon kapağını çıkarın ve reaksiyon karışımı aspirat ve desalt spin kolon merkezine yavaşça uygulayın. Reaksiyon karışımı uyguladıktan sonra, spin kolon üzerindeki kapağı değiştirin. </li><li> Bir santrifüj desalt spin kolon evler Falcon tüp yerleştirin. Gibi adım 1.5, santrifüj rotor merkezine bakan İşaretli nokta ile şark spin kolon yapılır. Centrifuge oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g&#39;de tüpü. </li><li> Santrifüjlemeden sonra, sarı bir karışım (fluorescein-dekstran kafesli) 15 ml Falcon tüp içinde (yaklaşık 400 ul) alınır. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne kafesli floresein-dekstran karışımı aktarın. </li><li> Hemen ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp kapağı. Bir Speedvac olarak kafese fluoresein-dekstran karışım Lyophilize. 350 mcL Liyofilizasyon yaklaşık 4 saat sürer. </li><li> Liyofilizasyon tamamen sonra, yaklaşık olarak% 1 arasında bir nihai konsantrasyona GKD 2 O toz (yaklaşık 3 mg) tekrar süspansiyon w / v Kısaca toz askıya vorteks karıştırın. </li><li> Tablet ayrı metal folyo kaplı tüpler içine floresein-dekstran kafesli ve -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol> 2. Embriyoların Hasat ve kafesli floresein-dekstran mikroenjeksiyon * Bu işlem zebrafish kullanırhayvan modeli sistem olarak. <ol><li> Gününde enjeksiyon öncesi, zebrafish haçlar 01:01 erkek-kadın veya bölücüler ile tanklarda yetiştiriciliği 2:1 erkek-kadın ya yukarı ayarlayın. </li><li> Ertesi sabah yetiştirme tankı su değiştirmek ve bölücüler çıkarın. Ardından bir 5 mcL 1 X Danieau medya ya da kafes floresein-dekstran, 1/10 seyreltilmiş çalışma çözeltisi (Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız) ya da GKD 2 O. hazırlamak Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile çalışma çözüm tüp örtün. </li><li> Iğne içine hazırlanmış kafesli fluoresein-dekstran çözeltisi (adım 2.2) pipet. Diseksiyon mikroskop altında uygun bir boyuta iğne ucu kesim önce, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf sarı filtre bir parça yerleştirin. Sarı filtre enjeksiyonlar sırasında flöresein-dekstran spontan uncaging önleyecektir. Oküler göz parça ile bakıldığında, ışık kaynağı sarı görünmesi gerekir. </li><li> Embriyolar toplayın ve bir microi içine Pipetinjection kalıp tepsisi. Floresein-dekstran kafesli 4 nL 3 sunmak için mikroenjeksiyon saati ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, şark forseps ile embriyoların ve enjekte (3 ila 4 nL) blastomer hücreleri (blastomer sarısı arabirimi) üssü haline flöresein-dekstran kafesli. Enjeksiyon için embriyo 1 olmalıdır - 2-hücreli aşamada. </li><li> Enjeksiyon sonrası, mikroenjeksiyon kalıp tepsiden embriyolar kaldırmak ve taze balık su içeren temiz bir petri kabına koyun. Metilen mavi% 0.02 az bir nihai konsantrasyonda mantar gelişimini önlemek için balık suyu ilave edilebilir w / v Floresein-dekstran kafesli enjekte arasında uncaging önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün. </li><li> İlgi hücreleri fotoaktive gerektiğinde bir aşama için enjekte edilen embriyolar kaldırın. Fotoaktivasyon için GKD 2 O. bir% 0.6 düşük erime agaroz solüsyon hazırlanır Tricaine (MS222), embriyo bağlı olarak, düşük erime noktalı agaroz için ilave edilebilir. Bunu yapmak için, 0.0 sulandırmak% 0.0014 arasında bir nihai konsantrasyona kadar düşük erime noktalı agaroz içinde% 2 Tricaine. </li><li> Embriyoların uygun gelişimsel aşamada ulaşır ulaşmaz, forseps ile 1 X Danieau medya dechorionate embriyolar. Dechorionating zaman, şeffaf sarı filtre (adım 2.3) beyaz ışık kaynağının yolunu yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li><li> 37 ° C&#39;ye% 0.6 düşük erime agaroz çözüm ısıtın Bir LABTEK odalı coverglass slayt kuyuya düşük erime agaroz pipetle 1 mL. Dikkatlice alt lamel karşı aşağı bakacak fotoaktive gereken hücreler ile forseps ile düşük erime agaroz ve yönlendirilmesi 4 embriyoların 3 monte. </li><li> Agaroz katılaşmaya bırakın. Katılaşma sonra pipet agaroz üzerinde 1 X Danieau medyanın 1 ml. </li><li> Daha embriyo için 2.9 adımları 2.8 tekrarlayın. </li></ol> 3. Kafesli floresein-dekstran İki fotonun aktivasyon * Bu işlem embriyonun reporte ifade ettiğini varsayarr GFP. Embriyo LSM 510 META NLO mikroskop bağlı argon iyon (488 nm) lazer kaynağı kullanılarak görüntülenebilir. Tek bir GFP pozitif hücre seçilir ve LSM 510 birleştiğinde Mai Tai lazer (femtosaniye lazer) kullanılarak fotoaktive edilir. Prosedür floresan olmayan embriyolar için aynıdır. Alternatif olarak, beyaz ışık Mai Tai lazer kaynağı kullanarak etkinleştirme ve ardından aktive edilmesi, hücre, bulmak için de kullanılabilir. <ol><li> LSM 510 yazılımı yükleyin. Beyaz ışık ışın yolu bir şeffaf sarı filtre yerleştirin. </li><li> Tarama Yeni Resim seçin ve Uzman Modu Başlat&#39;ı tıklatın. </li><li> Lazer sekmesini seçin. Argon iyon (488 nm) ve Mai Tai (femtosecond) lazer kaynağı açın. </li><li> 740 nm Mai Tai dalgaboyu ayarlayın. </li><li> Yapılandırma sekmesini seçin. Argon iyon ve Mai Tai lazer optik yol yapılandırmasını ayarlayın. </li><li> Tara sekmesini seçin. 20X/0.8 için objektif değiştirin. </li><li> Max tıklayarak maksimum tarama hızı ayarlayın. </li><li> Set Mode, Yöntem ve Hat Numara, Ortalama ve 1. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai dışında tüm lazer kaynaklarının altında. </li><li> Optik ışın yolu bir güç ölçer yerleştirin. </li><li> Sürekli tarama etkinleştirmek için Devam düğmesini seçin. </li><li> Güç metre 47 mW ortalama bir lazer güç okuyana kadar iletim% ayarlayın. </li><li> Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai lazer kaynağı ve argon iyon (488 nm) altında seçin. </li><li> Hızlı xy düğmesini seçin. Kanallar sekmesinin altında iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, ve en iyi görüntü kalitesini elde etmek için argon iyon lazer yükselteç kazancı ayarlayın. </li><li> Sahne denetleyici kullanarak, bulmak ve etkinleştirmek için hücre odaklanmak. </li><li> Durdur düğmesine tıklayın. </li><li> Mod sekmesi altında yakınlaştırma faktörü 50 ile 70 görüntüler kadar aktif hücre üzerinde yakınlaştırma aracı, yakınlaştırma kullanma. </li><li> Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın argon iyon las altındave er (488 nm) Mai Tai lazer seçin. </li><li> Mod sekmesi altında 31.46 sn tarama hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Seçilen hücrenin floresein-dekstran Kafeste iki-foton aktivasyonu için tarama başlatmak için tek düğmesini seçin. </li><li> Sonra aktivasyon seçimini kaldırın Mai Tai Kanallar sekmesi altında lazer ve yeniden seçme argon iyon lazer (488 nm). </li><li> 1 Mod altında yakınlaştırma faktörünü ayarlayın ve hızlı tarama hızını ayarlamak için başlığı Hız altında Max düğmesini tıklatın. </li><li> Fotoaktive bölgeyi incelemek için Hızlı xy seçin. Fotoaktive bölgeye lazer ablasyon olmadığını kontrol edin. Lazer ablasyon hakkında daha fazla bilgi için, tartışma bölümüne bakın. </li><li> Diğer embriyolar için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Uncaged floresein-dekstran İmmuno (Ref uyarlanmıştır. 16) <ol><li> Photoativation sonra, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf bir sarı filtre yerleştirin ve elle l her bir embriyo çıkarınkeskin forseps kullanarak ow erime agaroz. Taze 1 X Danieau medya içeren yeni bir petri tüm kaldırıldı embriyolar yerleştirin. Işığa embriyoların maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün. </li><li> Gerekirse istenen gelişim aşamasına embriyolar, arka. Bu arada, (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız)% 4 paraformaldehid solüsyon hazırlanır. Bir mikrosantrifüj tüp içine hazırlanmış paraformaldehid arasında kısım 1.5 ml. </li><li> Embriyoların ilgi gelişim aşamasına ulaşmış sonra, mikrosantrifüj tüp (adım 4.2 &#39;dan itibaren) içine embriyolar Pipeti. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün. </li><li> 4. gece boyunca tüp Nutate ° C. Ertesi gün için fosfat tamponu (PBS) ve GKD 2 O derecelendirildi etanol (EtOH) çözümler hazırlamak;% 30 EtOH: PBS,% 50 EtOH: PBS,% 70 EtOH: GKD 2 O ve% 100 EtOH. </li><li> Ertesi gün, 4 ° C arasında embriyolar çıkarmak Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı para kapalı aspireformaldehye (embriyolar kaplayacak kadar küçük bir hacim geride bırakmak). % 30 lik EtOH pipetle 1.5 mL: tüp içine PBS ile yıkandı. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate. </li><li> 4,5, 70 50 ile ve% 100 EtOH çözümler derecelendirildi adımı yineleyin. % 100 EtOH yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 EtOH içinde yeniden embriyolar durulayın. </li><li> Yıkamadan sonra, -20 ° C&#39;de gece boyunca embriyolar depolamak Ertesi gün için fosfat (PBT; Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) aranın tamponlu hazırlamak, 5 X engelleme tampon (Hazırlık üreticisi protokol bakın), maleik asit (Hazırlık protokolü engelleme tampon protokol bulunabilir), 10 mg / ml proteinaz K, ve bir 10 x antikor çözeltisi (Anti-florosin AP-; Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız). </li><li> PBT seyreltilir; Ayrıca kuzu serum (Çözeltilerin Hazırlanması bkz. LS)% 2 hazırlar. 4 de antikor Mağaza ° C gecede bir nutator sallayarak. % 2 LS 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir </li><li> Ertesi gün embriyolar kaldırmak-20 ° C&#39;den Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı% 100 EtOH kapalı aspire. Tüp GKD 2 O:% 70 EtOH 1.5 mL ekleyin. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate. </li><li> 4.8 kullanılarak 50 ve% 30 EtOH çözümleri derecelendirildi ve% 100 PBT adımı yineleyin. % 100 PBT yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 PBT olarak embriyolar daha fazla 3 kez yıkayın. </li><li> Embriyoların 24 saatten daha yaşlı iseniz, proteinaz K onları tedavi. Değilse, 4.13 adıma geçin. Bunu yapmak için, PBT Hazırlanan proteinaz K (adım 4.7) 1:1000 sulandırmak. Embriyoların büyükseniz 10 dakika veya daha uzun süre proteinaz K embriyolar inkübe edin. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun. </li><li> Proteinaz K tedaviden sonra, 10 dakika için PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, bir nutator oda sıcaklığında 30 dakika için% 4 paraformaldehit içinde embriyolar düzeltmek. Daha sonra, hemen 10 dakika PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Embriyolar tutunışığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır. </li><li> 1 X. PBT gelen embriyolar çıkarın ve 1 X tampon engelleme yerleştirmek için maleik asit tampon tampon engelleme 5 X sulandırarak engelleme tampon yapın. Metal folyo ile, embriyoları örtün ve 5-6 saat için oda sıcaklığında onları nutate. </li><li> 65 de ısı şoku, embriyolar engelleme 15-20 dakika için ° C. 5-6 saat sonra </li><li> Antikor çözeltisi ve bir önceki gün hazırlandı% 2 LS elde edilir. Max rpm antikor çözüm santrifüjleyin. % 2 LS tüp için sulu faz transfer edin. Karıştırmak için Tüpü ters çevirin. </li><li> LS-antikor karışımı tampon engelleme embriyolar transfer. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun. 4 ° C&#39;da gece boyunca embriyolar Nutate. </li><li> Ertesi gün, 6 kez, PBT içinde 15 dakika için oda sıcaklığında embriyolar yıkayın. AP tamponu (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın. </li><li> AP met içinde 10 dakika için oda sıcaklığında 2 kez yıkayın embriyolarffer. NBT / BCIP gelişmekte çözeltisi (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın. </li><li> NBT / BCIP için embriyolar transfer. Leke karanlıkta geliştirmek için izin ver. </li><li> 5 dakika her embriyolar PBT 3 kez yıkanarak gelişimini durdurur. </li><li> Görüntü alımı için% 0.6 düşük erime agaroz veya% 3 metilselüloz embriyolar monte ve bir ters veya dik bileşik mikroskop kullanılarak görüntü elde. </li><li> Fotoaktive örnekleri derecelendirilmiş bir EtOH yıkama onları dehydrating gelecek analizi (boyama sabit kalır) saklanabilir. Örnekleri dehydrating 4.7 adımları 4.4 izleyin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Floresein-dekstran kafesli bir Fotoaktivasyona. (A, B) ve aydınlık fotoaktivasyon önce 13/14-somite aşamada bir yan görünümdür zebrafish embriyo floresan imaj. (C, D) Embriyo fotoaktive edildi740 nm dalga boyuna sahip Somitlerin (ok) bir t the13/14-somite aşamasında, 31 saniye saati ve 47 mW ortalama bir lazer güç tarayın. Post-aktivasyonu, (d) Uncaged floresein-dekstran dan floresan gözlemlenmiştir. Oryantasyon: Dorsal (sağda), ventral (solda). Ölçek çubuğu 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Floresein-dekstran kafesli bir İmmuno. Şekil 2 18/19 hpf zebrafish embriyo Uncaged floresein-dekstran immün gösteriyor. 10-somite aşamada embriyo küçük bir bölgeye Şekil 1&#39;de belirtilen aynı lazer parametreleri kullanarak lateral plaka mezoderm faaliyete geçmiştir. İmmuno prosedürü kullanarak, ok en az arka plan boyama yöntemi ile, aktive edilmiş bölgesini tanımlar. Oryantasyon: Dorsal (üst), ventral (alt). Ölçek çubuğu 100 mikron.

<ol>
	<li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants.">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 .</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion.">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li><li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish:+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation.">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li><li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling.">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model.">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li><li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery.">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li><li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula.">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li><li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran.">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+and+gene+expression.">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu kağıt floresein-dekstran kafesli bir fotoaktivasyon dayalı tek bir hücre kaderi haritalama için çok yönlü bir yöntem açıklanır. Tek hücreler içinde floresein-dekstran kafesli bir Uncaging Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskop ile birleştiğinde bir Mai Tai femtosaniye lazer iki-foton soğurma kullanılarak elde edilir. Fotoaktive hücrelerinde Uncaged floresein-dekstran basit immünohistokimya prosedürü kullanarak hızla görüntülenmiştir. Bu protokolde kafesli floresein-dekstran fotoaktivasyon için iki foton soğurma dalga boyu 740 nm. Bu dalga boyu deneysel olarak kafese floresein-dekstran enjekte yabani-tip embriyolar photoactivating ile tespit edilmiştir. Lazer uyarma dalga boyu 600 ila 800 nm arasında değişiyordu, floresein floresan sonrası aktivasyonunun varlığı veya yokluğu niteliksel olarak tespit edilmiştir. Biz 740 nm güçlü flöresein sinyal aşağıdaki aktivasyon ürettiğini bulundu. İdeal olarak, 740 nm herkes için çalışması gerektiğinimodel sistemler, ancak biz örnek için en uygun iki foton uyarma dalgaboyu belirlemek için dalga boyu bir dizi test öneriyoruz. Her iki foton uyarma dalgaboyu biz de ortalama lazer gücü zengindir test için kafesli olarak floresein-dekstran, yabani-tip embriyolar enjekte. 740 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu için, 47 arasında bir ortalama lazer güç mW ortalama lazer güçler düşürmek ile karşılaştırıldığında, aktif bölge de daha kuvvetli bir fluoresein sinyal üretti. Yükseköğretim ortalama lazer güçler güçlü floresan sinyalleri üretmek, ancak doku kaynaklı ablasyonu vermedi. Femtosaniye lazer darbeleri ablasyonu biyolojik doku 15 verimli olduğundan, biz doku ablasyonu önler fotoaktivasyon için eşik ortalama lazer gücünün belirlenmesinde öneririz. İki foton soğurma küçük bir etkileşim hacmi içinde gerçekleşir. Kafesli floresein-dekstran uygun aktivasyon sağlamak için, hücrenin uygun odak noktasına getirilmelidir. Thprotokolü yukarıdaki e, GFP pozitif hücreler aynı anda hücre odak onaylamak için beyaz ışık altında görüntülendi. Bu nedenle, beyaz ışık toplama diğer kanallarına ek olarak tavsiye edilir. Hücre odak onayladıktan sonra, bizim protokolü aktif hücre büyütme göstermektedir. 50 ila 70 arasında bir büyütme faktörü tavsiye edilmektedir, bununla birlikte, bu değer hücre seçilmiş büyüklüğüne bağlıdır. Zum arttırılması bitişik hücrelerin aktive olan hücre izole etme, ve iki-fotonlu aktivasyonu için tarama alanı sınırlar. İdeal olarak, tarama alanının hücre geniş bir alanı kapsamalıdır. Tek aktif hücrelerin saptanması plan boyama minimal olmasını gerektirir. Yukarıdaki İmmuno protokolde bu örnek 5 ila 6 saat (adım 4.13) için tampon engelleme engellenmiş olduğunu önemlidir. NBT / BCIP ile geliştirirken, Uncaged floresein-dekstran 10 ila 20 dakika içinde görünür hale gelmelidir. Arka plan boyama güçlü ise, anti-kaldırmak için uzun bir engelleme süre ve ek yıkar öneririzvücut (adım 4.17). Şekiller 1 ve 2 fotoaktivasyon ve İmmuno temsili sonuçlar sağlar. Şekil 1, erken 1 - 2-hücreli aşamada yabani-tip embriyolar floresein-dekstran kafesli enjekte edildi. Embriyolar orta somitogenesis kaldırdı ve yanal yönde düşük erime agaroz monte edildi. Şekil 1. (a, b) fotoaktivasyon önce Aydınlık ve embriyo floresan görüntüler betimliyor. Embriyo Uncaged kalmıştır dair kanıt Şekil 1 (b) &#39;de floresan floresan olmaması ile ortaya konmuştur. Bir somite içinde küçük bir bölge 47 ortalama bir lazer güç mW, Şekil 1 (; ok c) kullanarak 31 saniye için 740 nm dalga boyu ile aktive edildi. Floresein-dekstran Post-aktivasyon, iki-fotonlu uncaging olarak etkin alan, Şekil 1 (; ok d) floresan ile gösterilen oluştu. Somitic dokusu bozulmadan, Şekil 1 (c) kalmıştır Aktivasyon, lazer ablasyon eşlik etmemişti. Şekil 2, Uncaged florun İmmuno göstermektedir<html> -dekstran escein. 10 somite aşama embriyo yan plaka mezoderm içinde küçük bir bölge Şekil 1 &#39;de belirtildiği gibi aynı lazer parametreleri kullanarak fotoaktive edildi. Embriyo kaldırdı ve 4.20 arasındaki adımları 4.1 kullanılarak işlendi. Şekil 2 bulur ok aktif bölge olarak mavi çökelti birikimi ile gösterilir. Sadece aktif konum açıkça arka plan boyama müdahale olmadan tespit edilir. Çözeltilerin Hazırlanması: 1 X PBT (1 L) 100 ml 10 X PBS 2 g BSA 10 mL% 20 Tween 10 x PBS (1 L) 80 g NaCl 2 g KCI 6.1 g Na 2 HPO 4 1.9 g KH 2 PO 4 1 L GKD 2 O 7.3 pH % 4 paraformaldehit (160 mL) % 32 Paraformaldehyde (iki 10 ml flakon) 8 ml 20 X PBS 132 ml GKD 2 O jove_content &quot;&gt; AP Tamponu (50 mL) 1 mL 5 M NaCl 2,5 ml 1 M MgCl2 5 mL 1 M Tris, pH 9.5 250 ul% 20 Tween 41.25 ml GKD 2 O Antikor çözeltisi (1 numune için) 5.5 mcL Aseton tozu 40 ul PBT 0.8 mcL LS 0.1 mcL Anti-florosin AP-antikor % 2 LS (1 numune için 360 mcL) 7.2 mcL% 100 LS 352,8 mcL PBT 1 X Danieau ortamı (1 L) ‡ 11.6 ml 5 M NaCI 700 mcL 1 M KCl 400 ul 1 M MgSO4 600 ul 1 M Ca (NO 3) 2 5 mL 1 M HEPES 1 L GKD 2 O pH 7,6 ayarlamak ‡ Danieau dechorionated zebrafish embriyolar yetiştirme için ideal bir tuz bir çözümdür. Diğer medya kullanılıyor olabilir, bunlar pro ile izotonik çözeltiler şartıylaPerly ozmolarite (zebrafish için ~ 300 mOsm) NBT stok (1 mL) 50 mg Nitro Blue Tetrazolium 0.7 ml dimetil formamid anhidrid 0.3 ml GKD 2 O BCIP stok (1 mL) 50 mg 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat 1 ml dimetil formamid anhidrid NBT / BCIP gelişmekte çözümü 1 mL AP tampon 4.5 mcL NBT stok 3.5 mcL BCIP stok Aseton tozu <ol><li> 20 erişkin balık seçin ve sıvı azot içinde bunları dondurmak. </li><li> Bir harçla dondurulmuş balık Grind ve toz pestle. </li><li> Bir 50 mL konik bir tüp içine balık tozu aktarın. </li><li> % 100 aseton ile konik boru doldurun. Vorteks tüpü. </li><li> 10 dakika için maksimum devirde tüp Spin. Süpernatantı atın. </li><li> % 100 aseton pelet 3 kez yıkayın ve 10 dakika için maksimum devirde tüp dönerler. By son yıkama süpernatantı açıkça görünmelidir. </li><li> Tekrar pelet% 100 aseton ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bekletin. Ince parçacıkların süspansiyon kalır ise daha yoğun parçacıklar, razı olacak. </li><li> Yeni bir tüp içine ince parçacıklar süzün. Tablet toz ayrı tüpleri içine çözelti ve -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> CMNB-kafesli floresein SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba desalt Spin Kolon </td><td> Delmek </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Düşük erime agaroz </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Sodyum Borat </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonate / MS222 </td><td> Araştırma Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-florosin AP- </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Tampon Engelleme </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Maleik Asit </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> ElektrMikroskopi Bilimler </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Mikroenjektör </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LABTEK Chambered coverglass slaytlar </td><td> Nalge Nunc Uluslararası </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Kuzu Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0.8 NA Hava apochromatic hedefi </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Şeffaf sarı filtre </td><td> Tiyatro House Inc </td><td> Roscolux filtre levha Renk: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

Ayirt tek hücre etiketlemek için yeteneği gelişimsel biyoloji açısından önemli olmaktadır. Örneğin, nasıl hematopoetik belirlenmesi, lenf ve kan damarı soy embriyolar gelişmekte ortaya farklılaşmamış prekürsör hücrelerinin izleme kaderi haritalama ve soy gerektirir. Son zamanlarda, photoactivatable proteinler içerir: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, 8 pKindling, ve KikGR 9, 10 hücre izleme probları olarak büyük ilgi gördü. Bu proteinlerin ışığa duyarlı floresan spektrum kolayca hücre popülasyonunun bitişik olanları ayırt edilmesi için izin UV uyarma ile dönüştürülebilir. Bununla birlikte, aktif protein photoefficiency 11 izleme uzun süreli hücre sınırlayabilir. Photoactivatable proteinlerin bir alternatif olarak, kafes floresein-dekstran yaygın olarak embriyo model sistemler 7, 12-14 olarak kullanılmıştır. Geleneksel olarak, floresein-dekstran, UV excit uncage içinBir floresan lamba ev veya tek bir foton UV lazer ation kullanılır olmuştur, ancak bu tür kaynaklardan fotoaktivasyon mekansal çözünürlüğü sınırlar. İşte kader haritası, soy izleme ve tek etiketli hücreleri algılamak için bir protokol rapor. Floresein-dekstran kafesli ile enjekte edilen embriyolar tek hücrelerin bir titanyum safir femtosaniye lazer üretilen yakın-kızılötesi lazer darbeleri ile fotoaktive edilir. Bu lazer gibi bu çalışmada kullanılan LSM 510 META NLO mikroskop gibi tüm iki-foton konfokal mikroskoplar gelenektir. Biyolojik doku yakın kızılötesi radyasyon 15 şeffaf olduğundan, lazer darbeleri Seçilen odak düzlemi üzerinde veya altında hücreler uncaging olmaksızın embriyonun içinde derin odaklı olabilir. Bu nedenle, non-lineer iki-foton soğurma tek bir hücrede floresein-dekstran uncage için geometrik odak sadece indüklenir. Floresein-dekstran Uncaged içeren hücre algılamak için, biz hızla visua basit bir immünhistokimya protokolü 16 tarifaktive edilmiş hücre lize. Bu çalışmada sunulan aktivasyon ve algılama protokolü yönlü ve herhangi bir model sistem uygulanabilir. Not: Bu protokolde kullanılan reaktifler madde sonunda ekteki tabloda bulunabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Fate Mapping in Zebrafish at JoVE.com

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Video: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...