Los sueldos y apoyar la investigación fueron proporcionados por el United Soybean Board, y por fondos estatales y federales asignados a la Universidad Estatal de Ohio / Ohio Agricultural Research and Development Center. Esta investigación fue parcialmente financiado por una beca del CONACYT, México, a cmHg. La mención de marcas o productos de esta naturaleza no constituye una garantía o la garantía del producto por OSU / OARDC y no implica la aprobación a la exclusión de otros productos que también pueden ser adecuados. Artículo de Revista No HCS 09-17.

La siguiente metodología describe un protocolo para el análisis de la imagen de la expresión génica mediante un sistema de recogida automatizada de imágenes. Para facilitar la explicación, el planteamiento general se divide en cuatro pasos: 1) la preparación de semillas, 2) la introducción de genes mediante el bombardeo de partículas, 3) colección de imágenes de robots, y 4) el análisis de imágenes. Aunque esta metodología general se puede utilizar para una amplia gama de otras aplicaciones, los conjuntos de la actualidad de los protocolos se basan en el uso de la proteína verde fluorescente (GFP) de genes, que es un gen útil para el seguimiento de la expresión de genes en la misma pieza de los tejidos vivos con el tiempo. I. Preparación de la semilla <ol><li> Frijol de Lima (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) se pueden comprar semillas o, idealmente, cosecha de las plantas cultivadas en una cámara de crecimiento (50% de humedad relativa, 16 / 8 h luz: oscuridad, 25/23 ° C día / noche). Después de la cosecha de semillas de calidad puede ser mantenido por el almacenamiento de semillas a -20 ° C. </li><li> Prepare Magenta GA7 contenedores para la germinación de las semillas. Doble el papel de filtro o servilletas de papel para que quepa en la parte inferior de las cajas de Magenta. Añadir aproximadamente 25 ml de agua desionizada a cada contenedor para humedecer las toallas de papel, y vierta el agua absorbida. Autoclave humedecido de papel que contienen las cajas durante 20 minutos. </li><li> Utilizando tubos de 50 ml centrífuga desechables, esterilización de las semillas en una solución de lejía al 10% comerciales (20 semillas de 20-40 ml) durante 20 minutos con agitación en un agitador giratorio a 60 rpm. Nota: Todos los pasos posteriores se deben realizar en una campana de flujo laminar. </li><li> Enjuague las semillas 4-7 veces con agua estéril desionizada agitando suavemente durante 30 segundos en cada lavado. </li><li> Coloque 5-6 semillas estériles entre las capas de papel doblado encuentra en cada caja Magenta estéril. </li><li> Incubar las semillas durante 4 días bajo las siguientes condiciones: 25 ° C, 16 / h de luz 8: oscura y el 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Introducción de genes con el bombardeo de partículas <ol><li> Construir construcciones de genes utilizando el vector de expresión favorita con un gen que puede ser controlada en los tejidos vivos. Hemos desarrollado un gran número copia vector de expresión útil para el promotor y el promotor de análisis de elementos. Este vector contiene el gen de la GFP, que se utiliza para visualizar el promotor / la función de promotor elemento en los tejidos transformados. </li><li> Alrededor de 1-2 horas antes del bombardeo, los cotiledones al consumo de habas la germinación de semillas y retire la cubierta de la semilla. Cotiledones adecuado para el bombardeo debe ser de color amarillo a verde claro, liso y libre de cualquier daño que pueda interferir con el análisis de imágenes más. </li><li> Cotiledones lugar en medio de cultivo que contienen sales de OMS MS 1, 2 vitaminas B5, 3% de sacarosa y 0,2% Gelrite (pH 5,7) inmediatamente después de ser extirpado. </li><li> Precipitar el constructo de ADN en M10 partículas de tungsteno (Sylvania, Towanda, PA, EE.UU.). En un tubo de 0,6 ml de microfuga, añadir 25 partículas de tungsteno l (partículas se resuspenden en agua destilada, 100 mg ml -1, a la derecha antes de su uso), 5 l de ADN (1 mg l -1), 25 l de cloruro de calcio 2,5 M (Sigma -Aldrich cat. C3881-500G) y 10 l 100 mM espermidina (Cat. Sigma. S-2626). Vortex brevemente para mezclar bien todos los componentes. </li><li> Incubar la preparación de ADN en hielo durante 5 min. Luego, retirar y desechar el sobrenadante 50 microlitros. </li><li> Resuspender las partículas recubiertas de ADN por agitación e inmediatamente retirar una alícuota de 2 l. Repita este paso agitación cada vez que se elimina una parte alícuota del tubo. Partículas recubiertas se deben mantener en hielo y se utiliza dentro de los 15 min. </li><li> A través de la parte superior de un filtro de jeringa, coloque dos partículas recubiertas l en el centro de la malla del filtro. Coloque la unidad de filtro que contiene las partículas recubiertas en la unidad de la celebración de filtro en la cámara de cañón de partículas. </li><li> Colocar una haba lado adaxial cotiledón hasta en un bafle y colocar el deflector en la cámara de cañón de partículas. El deflector, que consiste en una pantalla fundida en el fondo de un vaso de precipitados, se utiliza como una plataforma para apoyar a los tejidos durante el bombardeo. </li><li> Bombardear a los tejidos, utilizando un cañón de partículas (en esta metodología, se utiliza un cañón de partículas flujo de entrada sencilla y económica 3, PIG, diseñado en nuestro laboratorio) de la siguiente manera: a) abrir la válvula que lleva a la de vacío para evacuar la cámara, b) después de el vacío llega a 760 mm (30 pulgadas) de Hg, activar el solenoide y liberar el helio para propulsar las partículas, c) después del bombardeo de partículas, cierre la válvula de la línea de vacío y liberar el vacío con la válvula de escape. La presión de helio utilizado para acelerar las partículas es de 50 PSI. </li><li> Después de que el vacío se libera, abre la puerta de la cámara para recuperar los cotiledones bombardeados y volver el cotiledón, el lado adaxial arriba, al medio de cultivo OMS. Nota: Para la cuantificación y el perfil de expresión, por lo general bombardean a un mínimo de tres cotiledones de cada constructo de ADN. Un control positivo, que suele ser un ADNconstructo que da un perfil genético bien estudiado expresión, se incluye como referencia. </li></ol> III. Colección de imágenes automatizado <ol><li> Encienda la lámpara de mercurio y esperar 30 minutos para que la lámpara se caliente. </li><li> A su vez en las fuentes de alimentación para la cámara CCD Spot RT (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, Michigan, EE.UU.) y la plataforma robótica controlador de motor, que impulsa el movimiento de la plataforma robótica. </li><li> Establecer el conjunto de filtros para la detección de buenas prácticas agrarias (GFP2 conjunto de filtros,.. Ex 480/40 nm, Em 510 LP) en un microscopio de disección MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Suiza). </li><li> Esterilizar el engrosamiento de policarbonato tapas de caja de Petri por pulverización con etanol al 70%. Las tapas especializados, que se utiliza para cubrir la base de una placa de Petri evitar la condensación durante la recolección de la imagen 4. </li><li> Coloque las placas que contienen los cotiledones bombardeados en la plataforma robótica (Arrick Robótica, Hurst, Texas, EE.UU.) del sistema de recogida automatizada de imágenes. La plataforma robótica está impulsada por un conjunto de motor paso a paso y consiste en una mesa para la fijación de 8 cajas de Petri. La plataforma está construida en policarbonato, polipropileno y aluminio. Las placas se fijan en su posición apretando un plástico lateral tornillo de ajuste. </li><li> Abra la aplicación de software a medida que controla tanto la plataforma robótica y la adquisición de imágenes. Además, abre el software de controlador de luz blanca cambiar. </li><li> En el &quot;movimiento del motor&quot;, haga clic en &quot;motor encendido&quot; y &quot;casa rodante&quot;. Después de que el software de la plataforma se orienta a la posición inicial, estamos listos para comenzar a introducir las posiciones de todos los cotiledones. </li><li> En el &quot;movimiento del motor&quot;, seleccione la primera placa. La plataforma será la posición del centro de la placa de Petri en el objetivo del microscopio. Con los botones de distancia en movimiento, precisamente, la posición del cotiledón primera colección de imágenes. Con el controlador de la luz blanca en la región de destino puede ser observada a través de la pantalla del ordenador mediante la activación del &quot;modo en vivo&quot;. </li><li> Para el cotiledón en primer lugar, establecer el enfoque y la ampliación (aumento de 1,6 x se prefiere) con los mandos manuales en el microscopio de disección. Enfoque ajustes para el resto de los cotiledones en la misma placa se realiza mediante tres tornillos de nivelación que se encuentra debajo de cada plato, en la plataforma robótica. </li><li> Una vez que la región de interés se ha creado, haga clic en &quot;agregar esta posición&quot; botón. El software añade las coordenadas de esta región a un archivo de programación de la posición y la plataforma volverá al centro de la placa. </li><li> Coloque las posiciones y enfoque para todos los cotiledones quedan en los platos con los botones de distancia del movimiento y los tornillos manuales de nivelación. Después de todas las coordenadas de todos los cotiledones se han introducido, guardar las coordenadas del horario de posición. </li><li> Introduzca los parámetros de la colección de imágenes. En el &quot;ajuste de imagen&quot;, seleccione el tipo de luz deseado, blanco o azul. Para la detección de buenas prácticas agrarias, sólo la luz azul se debe utilizar. Por otra parte, entrar en el ajuste de la exposición. A pesar de que puede modificar el tiempo de exposición de manera independiente de color rojo, azul y verde, que suelen utilizar la misma configuración para las buenas prácticas agrarias documentación fotográfica (20, 14 y 14 segundos para el canal rojo, verde y azul, respectivamente) lo que nos permite realizar directa y comparar de forma homogénea entre los constructos de ADN diferente. </li><li> En el mismo &quot;ajuste de imagen&quot; ficha, especifique una carpeta vacía donde las imágenes se almacenarán. Cada serie de imágenes se guardarán en la carpeta principal en carpetas independientes, numeradas correlativamente según el orden de las posiciones de entrada de los cotiledones. </li><li> Ir al &quot;tiempo de tomar el control&quot; y configure la adquisición de la imagen intervalo de tiempo y el número total de ciclos de colección de imágenes. Las imágenes se suelen recoger cada hora durante 100 horas, lo que genera bien definidos los perfiles de expresión génica. </li><li> Iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el &quot;horario de correr!&quot; botón situado en el &quot;horario de posición&quot; ficha. </li><li> Al final de la colección de imágenes de 100 horas, la transferencia de todas las imágenes de la computadora que controla el robot a cualquier unidad de disco duro de gran capacidad o equipo de análisis de imágenes más. Imágenes de alta resolución (1600 x 1200 píxeles) se recogen como archivos TIF medir ~ 5 Mb cada uno. </li></ol> IV. Análisis de Imágenes <ol><li> Montar las 100 imágenes secuenciales de cada carpeta con Adobe ImageReady. <ol><li> Abrir ImageReady e importar todas las imágenes secuenciales que componen una serie de marcos. </li><li> Cambiar el tamaño de las imágenes originales de 800 x 600 píxeles. Imágenes recogidas son de alta resolución, que genera archivos de gran tamaño que pueden hacer lento el procesamiento de imágenes. </li><li> Desplácese por las imágenes y encontrar un punto (s) visible en la mayoría de las imágenes. </li><li> Zoom hasta 300% en el lugar seleccionado (s). Alineación de imágenes con un mayor aumento, permite un registro más preciso. </li><li> Insertar una capa en la parte superior de todas las imágenes y asegúrese de que está visible en todos los marcos. Marque el punto (s) localización usando el &quot;Pincel&quot; de herramientas. </li><li> Iniciar la aproximación de los marcos con el &quot;traslado&quot; de la herramienta y de tomar las marcas en la capa de referencia. </li><li> Cuando la alineación está completa, eliminar la capa utilizada como referencia y guardar las imágenes como una sola &quot;psd&quot; archivo. Por otra parte, las exportaciones de todos los fotogramas como una única &quot;mov&quot; archivo con la resolución más alta. La alineación manual de cada serie de imágenes lleva alrededor de 10 min. </li></ol></li><li> Realizar la cuantificación de la expresión génica utilizando ImageJ. <ol><li> Abra el software ImageJ y abrir el &quot;mov&quot; archivo guardado previamente en ImageReady. </li><li> Con la herramienta Seleccionar, elija un área de 400 x 300 píxeles y recortar la imagen. Este nuevo archivo debe ser guardado como un archivo &quot;AVI&quot;. </li><li> Separar las imágenes secuenciales, que se encuentra en el nuevo archivo &quot;AVI&quot; en los canales rojo, azul y verde, haga clic en &quot;imagen&quot;, &quot;color&quot; y &quot;split RGB&quot; en ImageJ. </li><li> Reste la fluorescencia de fondo de todas las imágenes de los canales verde y rojo. Utilizando la serie de imagen de canal verde, seleccione un área de 20 x 20 píxeles de una región con no expresan las células y registrar su ubicación en el &quot;Administrador de retorno de la inversión&quot; de la herramienta, por lo que la misma área serán seleccionados en ambos canales. Con el cuadrado de 20 x 20 píxeles activos en el canal verde, ir a los &quot;plugins&quot; comando ubicado en la barra de tareas de ImageJ y luego haga clic en el &quot;retorno de la inversión restar medida para cada sector&quot; plugin-herramienta. </li><li> En ImageJ, haga clic en &quot;Imagen&quot;, &quot;ajuste&quot; y luego &quot;umbral&quot; para definir o segmento de la GFP-expresando píxeles. Ajustar los niveles de umbral, arrastre la barra en la ventana de umbral para obtener un tamaño de spot promedio de 20 a 30 píxeles. </li><li> Determinar la expresión de GFP usando un plugin que hemos diseñado para medir la media en escala de grises por píxel valor y el número total de píxeles que expresan GFP. </li><li> Copia de la producción media en escala de grises valores en ImageJ y pegar en Microsoft Office Excel. Calcular la expresión de GFP para cada canal (rojo y verde), multiplicando la media en escala de grises por píxel valor por el número total de píxeles que expresan GFP para cada canal. La suma de los valores de expresión de ambos canales se obtiene la expresión de GFP. Los valores pueden ser utilizados para ilustrar los perfiles de expresión génica y hacer comparaciones directas. Time-lapse animaciones también pueden ser generados usando &quot;mov&quot; o archivos &quot;avi&quot;, proporcionando una visualización única y clara del perfil de expresión génica. </li></ol></li></ol> V. Los resultados representativos La colección de imágenes y robótica procedimiento de análisis (Fig. 1) que aquí permite la adquisición de una gran cantidad de datos cuantitativos sobre la expresión génica en un corto período de tiempo. Para la caracterización de la planta con el promotor del gen de la GFP, esta metodología no sólo es útil para crear perfiles de expresión transitoria (Fig. 2), sino también para realizar un seguimiento en una expresión de GFP-detallada en forma transitoria y tejidos de las plantas transformadas de forma estable 5,6. Corto lapso de tiempo, animaciones generadas con las imágenes recogidas secuencial son una herramienta valiosa para el análisis en profundidad de la expresión génica en el tiempo en los tejidos vegetales. Esta metodología también tiene gran aplicación para evaluar los factores que afectan directamente a la expresión génica. Por ejemplo, la expresión de GFP transitoria bajo la presencia de diferentes supresores del silenciamiento de origen viral ha sido estudiada con éxito con nuestra colección de imágenes automatizado y sistema de análisis de 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimiento de análisis de imagen consta de cuatro pasos principales. (A) La adquisición de una serie de imágenes utilizando el sistema robótico de la colección de imágenes, (b) la separación de las imágenes en los canales rojo, azul y verde, (C) distribución de los píxeles que expresan mediante el ajuste de los niveles de umbral, y (D) la obtención de los resultados de salida que contiene los valores de la escala de grises y el recuento de las buenas prácticas agrarias-que expresa el enfoque. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gráfico que muestra los diferentes perfiles de expresión transitoria impulsado por promotores de la planta fusionado a GFP. Los datos fueron recolectados a través de nuestro sistema robótico colección de imágenes y análisis con ImageReady y el software ImageJ.

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

El uso de la robótica tiene aplicaciones enormes en diferentes aspectos de la vida humana, en concreto, los robots han sido efectivamente utilizados para realizar actividades en ambientes peligrosos, para automatizar las actividades tediosas y complejas, y llevar a cabo las tareas de una manera más precisa. En la biología molecular, y analiza específicamente la expresión de genes, los robots pueden ayudar a rastrear no sólo las características de los genes, sino también el crecimiento del tejido y el desarrollo en el tiempo. Muchos fenómenos biológicos ocurren de forma dinámica, lo que puede ser difícil de seguir utilizando un solo punto de observación del tiempo. El uso del gen de la GFP para estudios de expresión ofrece ventajas adicionales para la observación de la respuesta del tejido y el crecimiento. Para nuestros procedimientos experimentales, las buenas prácticas agrarias que nos permite seguir la expresión de genes en el mismo pedazo de tejido en el tiempo como la detección de GFP es una organización no-destructiva. Por otra parte, nuestra versión de la proteína GFP es lo suficientemente estable para permitir la detección, pero también muestra una cierta rotación para minimizar la acumulación en los tejidos vegetales, lo que nos permite seguir tanto en el ascenso y la caída de la expresión génica. Ya hemos utilizado nuestra colección de imágenes robótico y un sistema de análisis para una amplia gama de aplicaciones. Prevemos un gran potencial para muchas aplicaciones biológicas donde se desea una comprensión dinámica de un fenómeno. Por ejemplo, el crecimiento y el desarrollo de tejidos de la planta puede seguir utilizando nuestro sistema de dar información valiosa / información sobre estos procesos. Además, la dinámica del transporte de proteínas utilizando genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, se puede visualizar fácilmente el uso del tiempo-lapso animaciones. La metodología descrita en este informe es técnicamente complejo, pero sencillo conceptualmente. Nuestros resultados son robustos y las nuevas aplicaciones están continuamente siendo descubierto.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

La expresión de genes en los tejidos vegetales suele ser estudiado por la extracción destructiva de los compuestos de tejidos de la planta de<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis. Los métodos que aquí utilizan la proteína verde fluorescente (<em&gt; Buenas prácticas agrarias</em&gt;) De genes para la vigilancia continua de la expresión génica en las mismas piezas de tejidos, con el tiempo. La<em&gt; Buenas prácticas agrarias</emGen&gt; fue puesto bajo control reglamentario de los diferentes promotores y se introduce en los tejidos de habas cotiledonares a través de bombardeo de partículas. Cotiledones fueron colocados en un sistema de recogida de la imagen robótica, que consistió en la disección de un microscopio de fluorescencia con una cámara digital y una plataforma de 2 dimensiones robótica diseñados para permitir una fijación segura de placas de cultivo. Las imágenes fueron recogidas de tejidos cotiledonares cada hora durante 100 horas para generar perfiles de expresión de cada promotor. Cada serie de recogidas de 100 imágenes fue sometido primero a la alineación manual de imagen con ImageReady para asegurarse de que las buenas prácticas agrarias-que expresa los focos se mantuvieron consistentemente dentro de los campos de análisis seleccionado. Regiones específicas de la serie de 300 x 400 píxeles, fueron seleccionados para su posterior análisis para obtener mediciones de intensidad GFP utilizando el software ImageJ. Imágenes por lotes fueron separados en los canales rojo, verde y azul y que expresan GFP áreas fueron identificadas utilizando la función de umbral de ImageJ. Después de restar la fluorescencia de fondo (la resta de los valores de gris de la no expresión de los píxeles de cada píxel) en los respectivos canales rojo y verde, la intensidad de las buenas prácticas agrarias se calculó multiplicando la media en escala de grises por píxel valor por el número total de píxeles que expresan GFP en cada canal, y luego añadir los valores para los canales rojo y verde. Los valores de intensidad de las buenas prácticas agrarias fueron recogidos por los 100 puntos de tiempo para obtener los perfiles de expresión. Las variaciones en los perfiles de expresión de GFP como resultado de las diferencias en factores tales como fuerza promotora, la presencia de un supresor de silenciamiento, o la naturaleza del promotor. Además de la cuantificación de la intensidad de las buenas prácticas agrarias, la serie de imágenes también se utilizaron para generar animaciones con lapso de tiempo con ImageReady. Time-lapse animaciones reveló que la gran mayoría de las células muestran un aumento relativamente rápido en la expresión de GFP, seguido por un lento declive. Algunas células de vez en cuando aparece una pérdida repentina de la fluorescencia, que puede estar asociada con la muerte celular rápida. Transporte aparente de las buenas prácticas agrarias a través de la membrana y pared celular de las células adyacentes también se observó. Lapso de tiempo las animaciones se brindó información adicional que de otro modo no se podría obtener utilizando los perfiles de las buenas prácticas agrarias de intensidad o de un solo punto de las colecciones de imágenes en tiempo.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Se presenta un método para la introducción, el seguimiento y el análisis cuantitativo de la expresión de GFP en las células vegetales. Este método utiliza un sistema diseñado a la robótica para la colección de imágenes semi-permanente de un gran número de muestras, con el tiempo. También demostrar el uso de ImageJ e ImageReady para el análisis de series de imágenes.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vistas.  The Ohio State University. Se presenta un método para la introducción, el seguimiento y el análisis cuantitativo de la expresión de GFP en las células vegetales. Este método utiliza un sistema diseñado a la robótica para la colección de imágenes semi-permanente de un gran número de muestras, con el tiempo. También demostrar el uso de ImageJ e ImageReady para el análisis de series de imágenes.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...