Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (ödül sayısı IOS-1031416) bir hibe ile finanse edildi ve Nathan Miller, Logan Johnson ve Wisconsin Üniversitesi&#39;nden Edgar Spalding ve Brian Bockelman, Carl Lundstedt ve David Swanson ile işbirliği içinde yapılmıştır Nebraska Holland Hesaplama Merkezi Üniversitesi.

1.. Görüntü Alma Protokolü Hususlar: Tek başına çalışması için mümkün olmasına rağmen, bu protokol, en verimli şekilde, iki kişi ile gerçekleştirilir. Bu laboratuvarda en iyi çalışan düzenleme tarayıcı kurulumu başka eserler, daha sonra her iki tarayıcılar tabak yerleştirin ve tarama işlemini başlatmak için birlikte çalışırken tarama plakaları hazırlamak için bir kişi için oldu. Bu projede tarayıcılar dikey tarayıcı kapakları tarayıcının arkasındaki dinlenme yönlenmişlerdir unutmayın de önemlidir. Bir özel destek bu dikey pozisyonda yemekleri tutmak için yapılmış ve 3M Command Şeritler ile dorse yüzey (Şekil 2) yapıştırılmış edildi. Bu protokol (bir Epson V700) kullanılan tarayıcı ile geliyor çıkarılabilir belge kapağı siyah keçe ile bir tarafta kaplı. Belge kapağı bir bungee kablosu ile Flatbed&#39;den karşı yerleştirildiyerinde tabak tutun ve görüntü kontrastını (Şekil 3) sağlamak için. Yeterli çözünürlükte herhangi bir tarayıcı görüntü yakalamak için kullanılan olabilir. Epson Perfection V700 çünkü yatak ve kapak hem tarama ve kızılötesi kanalını kullanmak için, kendi kare profil (kolay dikey pozisyon verme), yüksek çözünürlük ve ek seçenekler seçildi. Bu ek seçenekler bu protokolde kullanılan değildi. Plakalar, büyüme odasına kaldırıldı sonra, bu protokol sonuna kadar devam şarttır. Tabaka preparasyonu Şeffaf bir ortam 10 ml ve her bir levhanın ortasında ekilmiş 9 tohum içeren standart Petri kutuları kullanıldı. : Levha etiketleme, medya hazırlanması ve dikim için prosedürler bulunabilir <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; ilk agar plaka almak ve bir Kimwipe agar plaka kapağının, kapak ve jant üzerine toplanan yoğuşma emer. </li><li> Kimwipe ile kapak Triton X-100 (deterjan) uygulayın - cömert olmak. (Triton X-100 plaka tarama gibi kapağın üzerinde yoğunlaşma oluşumunu önlemeye yardımcı olur unutmayın. Cömert bir uygulama (yeterince kapak yüzeyinde bir film tabakası oluşturmak için) kapak tüm tarayıcı çalışma boyunca şeffaf kalır emin olun yardımcı olacaktır .) </li><li> Kapağı sabitlemek için mikro gözenekli bant ile plaka sarın ve havalandırma için. </li></ol> Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu Bu protokol daha 1 tarayıcı kullanılmakta olduğunu varsayar, ve tek bir bilgisayarda birden fazla tarayıcı başlatmak için gerekli talimatları içerir. <ol start="4"><li> Her tarayıcı görüntüleri depolamak için klasörler oluşturabilirsiniz. Her tarayıcı iki tabak tutun, böylece klasör oluştururken aklınızda bu devam edecektir. Bir, benzersiz her plaka için kimlikleri, fide yaş, tohum büyüklüğü ve dikilen stokların kimlikleri gibi dosya adının bileşenleri olarak meta kullanmayı seçebilirsiniz. Bu meta verileri içeren veri toplamada kullanılan bir klasör adının bir örnek &quot;1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161&quot; olduğunu. </li><li> Belirlenen toplama zaman çıkış sürelerini ayarlayın (9 saat bu laboratuvarda kullanılmıştır). Hazırlanması için ekstra zaman (bir saat ya da öylesine) ayarlamak için emin olun. VueScan yazılım bir kullanıcı tekrar tekrar görüntüleri toplamak için izin verir iken (. Tarayıcılar toplama süresini ayarlamak için çıkış sayaçları takılı olması gerektiğini unutmayın, bu kullanıcı belirtmek için izin vermiyor kaç toplamak için görüntü veya nasıl görüntüleri toplamak için uzun .) </li><li> İlk tarayıcı açın ve ilk sıcak-up geçmesi tarayıcı için yaklaşık 10 saniye bekleyin. </li><li> Kez VueScan programını açın. VueScan sürüm 9.0.20 (Malzeme bkz. Tablo) Bu protokolde kullanılan, ama daha yeni sürümleri küçük modific ile kullanılabilirtirme. &#39;Daha&#39; düğmesine aşağıda açıklanan menü seçeneklerini görüntülemek için kullanıcı arayüzünün alt panelinde basılı olduğundan emin olun. </li><li> Otomatik tekrar ayarlayın: açılır kutusunda none set Önizleme alanında Girdi sekmesi altında ve Crop sekmesi altında: Maximum (Şekil 4). Basın &#39;Önizleme&#39;. </li><li> Tıklayın ve önizleme görüntüsünün faiz bölgede sürüklemek için fareyi kullanarak ilgi bölgeyi ele verecek bir kırpma kutusu oluşturun. Ayarlar Crop sekmesine ilgi bölge için değişmiş olabilir. Kırpma kutusu için kullanılan tipik ayarları şu şekildedir: 0,675 x-ofset, y-telafi, bu her bir tarayıcı için fide alan yakalamak için ayarlandı se olarak 1,924. Kullanılan kırpma kutusu boyutu (Şekil 5) uzun boylu 1.1 genişliğinde yılında 7.246 oldu. </li><li> Fare ile sürüklerken Kırpma kutusunu taşımak için, Shift tuşunu basılı tutun. Kırpma kutusunun tüm taranacak fidan artı bir etiket (Şekil 5) içerdiği olabilecek herhangi bir istenen meta içerdiğinden emin olun. </li><li> Crop sekmesinde, Önizleme alanını ayarlayın: Mahsul kutusu ve basın &#39;Önizleme&#39; için. </li><li> Çıktı sekmesine gidin ve tarayıcı için doğru dosyayı (Şekil 5) seçin. </li><li> Tekrar bir bilgisayar için tüm tarayıcılar üzerinde 1,7-1,12 adımlar. VueScan birden fazla örneğini açmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda &#39;evet&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Her sekmede geçmesi ve ayarların doğru olduğunu doğrulamak. (Tüm özellikler görüntü renk, çözünürlük, vb dahil olmak üzere bireysel laboratuvar ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir olduğunu unutmayın. Ancak, bu protokolde kullanılan ayarlar doğrudan pa uygulanabilirrticular nedeniyle birisidir yazılımın ortak bir arayüz için belirli bir laboratuar tarama donanımı. VueScan 9.0.20 sürümünü kullanarak bu projede kullanılan parametreleri) görüntülemek için ekli özellikleri listesine bakın. </li><li> Giriş sekmesinde Otomatik tekrar Sürekli seçin: alanına, ya da istenirse daha uzun görüntüler arasında zaman aralığını seçin. Zaman aralığı tarayıcı son görüntü kaydetme ve sonraki görüntü koleksiyonu başladıktan sonra durakladığı sürenin uzunluğudur. Sürekli modda, 3-4 dk çözünürlük 4800 dpi elde edilebilir. </li><li> Tekrar tek bir bilgisayara bağlı tarayıcılar kalanı için 1,14-1,15 adımları. </li><li> Yatay odaklı fide ile doğru tarayıcılar (gravistimulate yok) hazırlanan tabak yerleştirin. </li><li> Geçici olarak pleksiglas şablondan düşmez böylece plakaların karşı arka keçe, bir siyah koyun. Tüm tarama için tekrarlayınners. (Not: Bu projede, keçe siyah adet belge parlamayı önlemek ve kök dokularına karşı kontrast sağlamak için ekipman ile sağlanan kapakları bağlanmıştır kullanılan spesifik bir arka plan rengi doku görüntülü rengine bağlıdır.). </li><li> Bir kişi (plakaları bu protokolde yönünün tersine döndü edildi) plakaları 90 ° çevirin ve hemen keçe arka plan değiştirmek var. </li><li> Hemen &#39;Tarama&#39; düğmesine basın böylece diğer kişinin bilgisayarında ayakta olmalıdır. </li><li> Bungee kablosu (Şekil 3) ile tarayıcıya arka sabitleyin. Bir kişi başka pozisyonları bungee kablosu süre yerde arka tutacak. (Not: Derhal gravistimulation (90 °, levhaların dönme) ve keçe arka yerleştirme sonra, &#39;Tarama&#39; basılmalıdır.) </li><li> Tekrar tek bilgisayarlar üzerindeki tarayıcılar kalanı için 1,17-1,21 adımlarıer. </li><li> Tekrar varsa tarayıcıların sonraki set için 1,6-1,22 adımları. </li><li> Birkaç görüntü, doğru tasarruf emin olmak için toplanıncaya kadar tarayıcılar bırakmayın. </li><li> Bu belirlenen tarama zamanı için rahatsızlıklarının ücretsiz olacak bir alanda tarayıcılar tutmak için idealdir. İdeal fenotipik yanıtları sağlamak için tarama alanında çevresel koşulların dikkate de isabetli olmuştur. </li><li> Veri toplama tamamlandığında, her tarayıcı ile çakışmaktadır her verenler pencerede yeşil iptal butonuna basın. </li><li> Bilgisayardaki tüm programları kapatmak. </li><li> Bilgisayarı yeniden başlatın ve görüntü koleksiyonun bir başka tur başlamadan önce tüm tarayıcıları kapatın. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+a+gravitropism+phenotype+in+glutamate+receptor-like+3.3+mutants+of+Arabidopsis+thaliana+using+machine+vision+and+computation.">Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation.</a> Genetics. 186, 585-593 (2010).</li><li>Clack, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Tracking+of+Whiskers+in+Videos+of+Head+Fixed+Rodents.">Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents.</a> PLoS Comp. Biol. 8, (2012).</li><li>Lussier, Y. A., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+approaches+to+phenotyping:+high-throughput+phenomics.">Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics.</a> Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).</li><li>Houle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloquium+Paper:+Numbering+the+hairs+on+our+heads:+The+shared+challenge+and+promise+of+phenomics.">Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).</li><li>Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+parental+environment+from+seed+size+effects+on+next+generation+growth+and+development+in+Arabidopsis.">Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis.</a> Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).</li><li>Silk, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Descriptions+of+Development.">Quantitative Descriptions of Development.</a> Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).</li><li>Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+of+C.+elegans+behavior.">Automated imaging of C. elegans behavior.</a> Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).</li><li>Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-vision+analysis+of+seedling+responses+to+light+and+gravity.">Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity.</a> Plant J. 52, 374-381 (2007).</li><li>Iyer-Pascuzzi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+Analysis+Platform+for+Automatic+Phenotyping+and+Trait+Ranking+of+Plant+Root+Systems.">Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems.</a> Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).</li><li>Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+Drosophila+wings.">Automated measurement of Drosophila wings.</a> BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).</li><li>Jahnke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions.">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> Plant J. 59, 634-644 (2009).</li><li>Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Arabidopsis+Root+Gravitropism+throughout+a+Multidimensional+Condition+Space+Quantified+by+Automated+Image+Analysis.">Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis.</a> Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).</li><li>Perrin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+signal+transduction+in+primary+roots.">Gravity signal transduction in primary roots.</a> Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).</li><li>Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+root+gravity+sensing+and+signal+transduction.">Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction.</a> Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).</li><li>Harrison, B. R., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARL2,+ARG1+and+PIN3+define+a+gravity+signal+transduction+pathway+in+root+statocytes.">ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes.</a> Plant J. 53, 380-392 (2007).</li><li>Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root Development. , 157-174 .</li><li>French, A., Ubeda-Tom&#225;s, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+root+growth+using+a+novel+image-analysis+tool.">High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool.</a> Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).</li><li>Granier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENOPSIS,+an+automated+platform+for+reproducible+phenotyping+of+plant+responses+to+soil+water+deficit+in+Arabidopsis+thaliana+permitted+the+identification+of+an+accession+with+low+sensitivity+to+soil+water+deficit.">PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit.</a> New Phytol. , 169-623 (2006).</li><li>Walter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+seedling+growth+acclimation+towards+altered+light+conditions+can+be+quantified+via+GROWSCREEN:+a+setup+and+procedure+designed+for+rapid+optical+phenotyping+of+different+plant+species.">Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species.</a> New Phytol. 174, 447-455 (2007).</li><li>Gregory, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+roots+with+high+resolution+X-ray+micro-tomography.">Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography.</a> Plant Soil. , 255-351 (2003).</li><li>Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+X-ray+imaging+of+plant+root+growth+and+water+uptake+in+thin-slab+systems.">Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems.</a> Plant Soil. 255, 361-373 (2003).</li><li>Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots.">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Doğru fenotipik gözlem bir organizma içinde, gen fonksiyonunun anlaşılması belirtileri için çok önemlidir. Fenotipik bilgi elde etmek için bir yolu, yüksek çözünürlüklü görüntü verisi yakalama geçer. Geliştirilen tarayıcı-tabanlı platform birkaç saat üzerinden yüksek çözünürlüklü (4.800 dpi) birçok görüntü koleksiyonu (200 images / tarama periyodu) sağladı. Buna ek olarak, bu platform nedeniyle kolaylıkla ortak bir arayüz 18 kullanılarak farklı tarayıcı binlerce çalıştırmak için birisidir yazılımın esnekliği ve laboratuar sınıf ortamlarda çeşitli şekilde uyarlanmıştır. Burada sunulan yöntem, büyük ölçekli fenotipleme tesisleri ve tek bir laboratuvarda uygulanabilir otomatik sistemlere kadar uzanan yüksek verimli görüntü yakalama bir boşluğu doldurur. Mevcut yüksek verimli platformlar p yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için, robotik destekler üzerine monte edilmiş kameralar da dahil olmak üzere özel görüntüleme donanımları, kullanma eğiliminderimarily toprak bitki dokularında (LemnaTec tarafından Bitki Bütünleştirici Teknoloji ve Scanalyzer HTS örneğin Merkezi) 20,21 üstünde. Onlar toprak ortamında (Bitki Bütünleştirici Teknoloji örneğin Merkezi) 11,22,23 büyüdükçe X-ray ve MR teknolojilerini kullanarak özel görüntüleme sistemleri de olağanüstü çözünürlük ile zemin dokuları görüntü aşağıda geliştirilmiştir. Daha özel teknoloji Bu gelişme dinamik fenotip çalışmaları daha zor hale throughput pahasına genellikle. Önemlisi, bu high-end platformları için maliyet ve altyapı ihtiyaçları küçük laboratuarlarda uygulanması için onları çoğunlukla olanaksız hale. Platformlar da daha fazla standart görüntü yakalama teknoloji kullanımı ve de bu tür bir ağırlık uyarıcıya kök yanıt olarak dinamik yanıtların ölçümü için uygun olan geliştirilmiştir. Örneğin, CCD kameraları, yüksek ışık ve yerçekimine bireysel fide yanıtları yakalamak için kullanılmıştıruzaysal ve zamansal çözünürlük 1,8,12. Diğer sistemler tek bir görüntü (iPlant İşbirlikçi örn RootTipMulti) 17,24 birden köklerinin kök ucu yönelim ölçümüne izin geliştirilmiştir. İlk durumda, verim nispeten düşük ikinci durumda çıkışı daha yüksek iken, sadece bir fide bir anda her kamera tarafından görüntüsü olduğu göz önüne alındığında, ama genellikle çözünürlük pahasına edilir. Bu yazıda özetlenen prosedür ekipman ve kolayca kullanılabilir ve nispeten uygun fiyatlı yazılımı ile yüksek verim, yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için bir platform sunuyor. Bu kurulumu kullanarak, 1.080 bireysel kök reaksiyonları altı tarayıcıların bir banka ile donatılmış tek bir laboratuarda her hafta toplanan olabilir. Haftada 864 bireysel tepkilerin ortalama toplama, 15 ay, 41.625 fidan toplam bir genomik çalışma için tarandı. Bireysel koleksiyonların yaklaşık% 15 nedeni kurulum hatası, netwo başarısızrk hatası veya ekipman arızası. Başka bir% 22 yanıtları bir büyüme tepkisi nedeniyle çimlenme veya yetersiz kök büyüme eksikliği başarısız oldu. Nihai veri seti 163 rekombinant kendilenmiş hatların bir yerçekimi uyarana 27.475 bireysel fide tepkileri artı 99 izogenike yakın çizgiler oluşur. Veriler, bu çok yüksek verimli bir yaklaşım yapma, tek bir laboratuarda toplanmıştır. Hatta edinimi için kullanılan ekipman bile ağır kullanımı ile iki yıldır güvenilir bir işlevi vardır, nispeten ucuz olduğu göz önüne alındığında. Bu protokol, bu grubun araştırma amaçları için çok yararlı olsa da, yine de bazı sınırlamalar vardır. Çünkü günde sıkıştırılmamış görüntü verisi yaklaşık 50 GB throughput, etkili sıkıştırma programları geliştirilmiştir olabilir sürece alanı büyük miktarda ev görüntüleri için gerekli olduğu belli oldu. Depolama sorunu geçici olarak her bilgisayar için harici sabit diskler satın alarak çözüldü. Buna ek olarak, iki adet 10 TB ağ bağlantılı depolama cihazları satın alındı. Yukarıda açıklandığı gibi, daha sonra, sıkıştırma algoritmaları kadar% 60 (Şekil 8) ile veri boyutunu azaltmaya yardımcı olabilir, geliştirilmiştir. Bu verileri bir ağ bağlantılı depolama aygıtına kaydedilebilir hangi hızda ağ bağlantısının hızına bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sıkıştırma programları nedeniyle de görüntü veri kaybını önlemek için arzu kısıtlı olmuştur. Bir tarayıcı tabanlı görüntüleme sistemine özgü diğer sınırlamalar da kabul edilmektedir. Örneğin, bir tarayıcı-tabanlı yaklaşım fidanları her tarama sırasında beyaz ve potansiyel kızılötesi aralıkları yüksek şiddette ışığa maruz kalmaktadır. Fideler hala (Şekil 7), bir yerçekimi uyarana sağlam yanıtları geçmesi görülebilir ama bu büyük olasılıkla, fide büyümesini etkiler. Bir gelecekteki gelişim sadece kızılötesi LED aktif böyle tarayıcıları programlama içerebilir. Aktif developmen bir alant de bu görüntü verilerinin çözünürlük ve verimi eşleşen analiz algoritmaları oluşturulmasıdır. Bu tarayıcı-tabanlı bir yöntem kullanılarak oluşturulan büyük veri seti fide görüntüleri yüksek verimlilik fenotipleme için güçlü araçlar gelişimi için ideal olmuştur. Şekil 7&#39;de gösterilen bu görüntüler üzerinde istihdam sıkıştırma algoritması, görüntü analiz uygulamaları için uygun olduğu iddiasını destekler. Ek olarak, üretilen görüntüler daha düşük çözünürlük (en az 1200 dpi) toplanır ise, daha önce yayınlanmış bir algoritma, RootTrace 17,24 ile analiz edilebilir ve fide analizden önce, yukarıda tarif edilen sıkıştırma algoritması kullanılarak resimdeki bölümlenmiştir. Kök büyüme verileri ucu açısı veri 900 dpi (yayınlanmamış gözlem) indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir ise 1,200 dpi indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir. Bu yazıda özetlenen prosedür Roo dünyasında kendi niş sığarhala nispeten uygun fiyatlı olurken, yüksek verimlilik ve yüksek çözünürlükte olduğundan t görüntüleme. Bu yaklaşımın bir başka yararı da kolayca belirli bir araştırma grubu görüntüleme ihtiyaçlarını karşılamak için özelleştirilebilir olmasıdır.

Yüksek çözünürlüklü fenotipik veri toplama organizma işlevi 1,2 aracılık genetik etkileşimi ve çevresini anlamasını amaçlayan çalışmalarda yararlıdır. Bu tür çalışmalar, ek gerekli bu bağlamda fenotipleri ölçmek için kullanılan yöntemler, yüksek verim 3,4 olması yapımında, ölçek de doğal olarak büyüktür. Phenomics ölçekli araştırma yöntemleri kurulmasında, hacmi ve çözünürlük arasında makasına devreye girer. Geçirilendeki yüksek yöntemler de daha zor genetik ve çevre 5 küçük etkileri algılamak için yapım, çözünürlük düşük olma eğilimindedir. Alternatif olarak, daha dikkatli arzu edilen bir fenotip ölçen yöntemler de zor geniş genetik ve çevresel etkilerini anket yapma, verim düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, görsel inceleme dahil miktarının fenotipleri, için manuel yöntemler nedeniyle insan Başı farklılıklara varyasyon konusu olabilirception 6. Görüntüleme teknolojileri fenotipik olarak gözlem 7-9 elde hacmi ve çözünürlük arasında yararlı bir köprü sağlayabilir. Genel olarak, bir görüntü hacmi kolaylaştıran yakalamak için nispeten kolaydır, ve yeterli çözünürlükte alındığında, ince fenotipleri 1,2,7 tespit edilebilir. Görüntüleme teknolojileri ilgilendiren bir sistemi ya da süreci uygun değiştirilebilir olma eğilimindedir ve genellikle 10-12 ölçeklenebilir. Bu nedenle, görüntüleme teknolojileri organizma işlevi büyük ölçekli çalışmalar gelişimi için idealdir. Bir ağırlık uyarıcı birincil kök cevabı, morfolojik olarak basit bir organ içinde meydana karmaşık bir fizyolojik bir süreçtir. Tepki kök organı yoluyla yaymak ve ilerleme ortamı 12-14 etkisinde genetik faktörler de dahil olmak üzere çevresel ve genetik faktörler tarafından belirlenir sinyal yollarının aktivasyonunu içerir </sup&gt;. Bir yerçekimi uyarana birincil kök yanıtı Darwin&#39;den bu yana en az çalışılmış, ama nasıl çalıştığı hakkında bilgi edinmek için çok özellikle erken sinyal olaylar ve müdahale plastisite 12,14,15 aracılık faktörler vardır. Bu yanıtın dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış kazanıyor başarıyla belirli bir ortamda 16 içinde kurulmuş olmak için fidan yeteneğini geliştirmek için yollar bulmak önemlidir. Buna ek olarak, kök şekli müsait görüntü işleme uygulamaları 8,12,17 için yapar. Birlikte ele alındığında, kök gravitropic tepki organizma fonksiyonu genomik düzeyinde çalışmalar yürütülmesi amacıyla yüksek verimli görüntüleme teknolojisinin gelişimi için ideal bir sistemdir. Bu raporda, ucuz, piyasada mevcut dorse tarayıcıları kullanarak kök gravitropic tepki görüntü yakalamak için yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü bir yöntem sunulmaktadır. Bir bakışprotokol, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Agar plakaları üzerinde dikilen fidanları özel pleksiglas plaka sahipleri ile donatılmış dikey odaklı dorse tarayıcılar üzerinde konumlandırıldı. Görüntüler 4,800 dpi her birkaç dakikada toplanan ve yerel bir sürücü veya veri sunucu üzerinde kaydedildi. Her resim serisi ile ilişkili metadata bir veritabanında saklanır ve saklanan görüntüler işlenir. Yaklaşım, görüntü yakalama için birisidir yazılımı kullanır. VueScan (Malzeme bkz. Tablo) Windows, Mac veya Linux işletim sistemleri üzerinde 2.100 farklı tarayıcılar çalıştırmak için kullanılabilir. 4.800 dpi bir tarayıcı çözünürlüklü sabit kameralar CCD 1,8,12 kullanarak daha önceki çalışmalarda elde çözünürlüğü maç bu uygulamada kullanılmıştır. Ortak bir arayüz ile birlikte birisidir yazılımının esnekliği kullanıcıların kolaylıkla bu yazıda sunulan protokole yeterli çözünürlükte hemen her tarayıcı donanım benimsemeye olanak çalışan herhangi bir tarayıcı için kullanır. Cari çıktı toplanması için izin verirGünde 216 bireysel yanıtları. Teknolojisi üniversitelere araştırma için yüksek okullardan değişen kurumlarda kullanım için uyarlanabilir ve ölçeklenebilir. Ayrıca, toplanan görüntülerin görüntü analiz uygulamaları için yeterli kalitede.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

Biyoloji araştırma çabaları giderek daha yüksek çözünürlüklü verilerin yüksek hacimli toplamayı sağlayan yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Laboratuarlar yüz olabilir bir meydan okuma bu yöntemlerin geliştirilmesi ve başarıdır. Ilgi sürecinde fenotipleri Gözlem gen işlevini okuyan araştırma laboratuarları tipik bir hedefi olduğunu ve bu genellikle görüntü yakalama yoluyla elde edilir. Görüntüleme yaklaşımlar kullanılarak gözlem için uygun olan özel bir işlem olup, ağırlık vektör ile aynı hizada yerinden edilmiş bir fide kökünün düzeltici büyümesidir. Kök gravitropic tepkisini ölçmek için kullanılan görüntüleme platformlar, pahalı verim nispeten düşük ve / veya emek yoğun olabilir. Bu sorunlar, ucuz, ancak yüksek-çözünürlüklü, masaüstü tarayıcılar kullanarak yüksek verim görüntü yakalama yöntemini geliştirerek ele alınmıştır. Bu yöntemi kullanarak, görüntüler 4.800 dpi her birkaç dakikada yakalanabilir. Geçerli kurulum 216 bireysel r toplanmasını sağlayanGünde esponses. Toplanan görüntü verileri görüntü analiz uygulamaları için yeterli kaliteye sahip.

Temsilci Görüntüler Bu yaklaşım Arabidopsis fide büyüme yüksek çözünürlüklü zaman serilerinin hızlı üretimini sağlar. Bir tarayıcı çalıştırmak ilk ve son görüntüleri Şekil 7A ve 7B gösterilmiştir. 7C ve 7D tam bir tarayıcı görüntünün yarısından itibaren en iyi sonuçları göstermektedir. Görüntü kalitesini etkileyen bazı konular Şekil 7A ve 7B gösterilmiştir. Bu konular çimlenme varyasyonu, koşmak başında büyüme yörünge fide varyasyon, ve tarama sırasında yoğuşma oluşumunu içerir. Yoğunlaşma, büyük ölçüde plaka kapağının içine uygulanan Triton X-100&#39;ün miktarını arttırarak çözülebilir. Doğru bir görüntü toplama engelleyebilecek diğer faktörlerin kırpma kutusunun göre eğik olacak şekilde, plaka pozisyon ve konumlandırma plakaları ile ilgili olarak ürün kutusunun doğru konfigürasyonu vardır. Görüntü Analizi Uygulama: Görüntü Sıkıştırma Tarayıcı görüntülerin bir zaman dizisi elde edildikten sonra, güvenli bir şekilde görüntü analizi kolaylaştırmak için bir ağ erişilebilir bir şekilde muhafaza edilmelidir. Tek bir tarayıcı çalıştırmak ile ilgili görüntü dosyaları sabit disk alanı önemli miktarda işgal. 4,800 dpi toplanan tek bir TIFF dosyası yaklaşık 220 MB olan ve tipik bir tarayıcı çalıştırmak 200 görüntü dosyaları oluşturur. Bu nedenle, sabit disk alanı yaklaşık 44 GB çalıştırmak başına gereklidir. Görüntü analizi ile ilişkili depolama ve ağ iletim maliyetlerini azaltmak için aynı anda veri kaybını en aza indirirken, görüntü verilerini saklamak için gerekli alan miktarını azaltmak tercih edilir. Mansap analizi deneysel bir çalışma ile ilişkili takip eden görüntü dosyaları her fide belirlenmesini içerecektir. Bu nedenle, tarayıcı görüntüden tek bir ağaç fideleri segmentlere aşağı analizini kolaylaştırabilir. Çünkü uzakta th kalanından fidenin segmentasyone görüntüsü de önemli ölçüde gereksiz arka plan piksel depolama azaltabilir, bu yaklaşım aynı zamanda veri boyutunda önemli bir azalmaya yol açar. Aşağı analiz kök dokusunda odaklanmış Ayrıca, eğer bu kök piksel kendi renk alanı nispeten dar olduğundan renk bilgileri korumak için gerekli olmayabilir. Bir bilgisayar görüntü işleme protokolü ve hem bireysel hem de fide çıkış segmentlere ve gri skala görüntüleri dönüştürerek veri boyutunu azaltmak için kod geliştirilmiştir. Bu yaklaşım depolama alanı şartları içinde% 60 azalma ile sonuçlanır. Bu veri sıkıştırmasını elde etmek için kullanılan bir iş akışı, aşağıdaki adımlarda tarif edilmektedir: <ol><li> Tek bir klasörde tarayıcı görüntü dosyaları bir zaman serisi ile başlayın. </li><li> Her görüntü için, (Şekil 8, üst) gri skala bir RGB dönüştürmek. </li><li> Sağ ve sol tarafta içine görüntüyü bölünmüş. </li><li> Kendi dosyasında (Şekil 8) içine resimdeki her bir fide ekstrakte edin.Bu siyah ya da beyaz ve daha sonra her görüntü satırın toplam piksel yoğunluğunu hesaplamak için piksel dönüştürmek için bir eşik uygulanarak yapılır. Yüksek yoğunlukla satır tanımlanır ve her bir piksel &#39;bitki&#39; veya komşularının yoğunluğuna dayalı &#39;nonplant&#39; olarak sınıflandırılır. Bu satırda, her bir &#39;bitki&#39; merkezi bulunan ve bu noktadan önceden belirlenmiş boyutta bir kırpma kutusu (Şekil 8, alt) çizilir. </li><li> Bireysel zaman serisi görüntü dosyaların depolanması için her fidan için ayrı alt klasörler ile görüntü (sol ve sağ) her tarafı için ayrı bir klasör oluşturun. </li><li> Sıkıştırılmış ZIP ​​dosyası içine çıkan klasörleri arşivle. </li></ol> Bu adımları gerçekleştiren bir kod programlama dili Python 20 kullanılarak geliştirilmiştir. Algoritma veri boyutu yaklaşık% 60 azalma sağlar ve tarayıcı imag% 90 tüm bireysel fide tanımlamada başarılıdıre içerik şimdiye kadar analiz edilmiştir. Kodlar (Malzeme bkz. Tablo) GNU Genel Kamu Lisansı Sürüm 3 altında indirmek için serbestçe kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. Tarama işlemleri, tohum ekimi (plaka başına kadar dokuz Arabidopsis tohum) ile başlar ve veri depolama ve görüntü işleme ile biter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Petri destek inşaatı için Şekil 2. T emplate. Ple<html> xiglas genişliği (bu durumda 227 mm olarak) düz yatak uygun şekilde kesilir ve uzunluğu 128 mm oldu. Bir 88 mm çaplı iki daire dengeli bir şekilde, desteğin genişliği ve uzunluğu boyunca dağıtılmıştır, öyle ki, kalan parçanın kesilip ayrılmıştır. Destek 3M Command Şeritler ile Flatbed&#39;den yapıştırılmış edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Fidan gravistimulated edilmiş ve belge kapağı yerleştirilmiş Şekil 3.. Tarayıcı yapılandırması sonra. Bu Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu adımda 1.21 de tarayıcının yapılandırması.&quot;_blank&quot;&gt; Büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu Aşama 1.8 için seçilmiş ayarları Şekil 4. Screen shot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Mavi kutu fo özel ayarları vurgular iken Şekil 5.. Adımda 1.9 ve Tarayıcı Kurulum ve Resim Koleksiyonu 1.10 sırasında birisidir yazılımın ekran görüntüsü. Kırmızı kutu kırpma boyutunu vurgulamaktadır<html> r x-ve y-telafi fide ve etiket bilgi yakalamak için kullanılır. Taranacak Flatbed&#39;den bölgesi Önizleme alanında bir noktalı çizgi olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Şekil 6.. Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu adım 1.12 hedef klasörün seçimi. Yanındaki Varsayılan Klasör iletişim kutusunda (kırmızı ok) @ düğmesine basıldığında kullanıcı uygun hedef klasörü seçmek için izin verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . 7 re &quot;fo: İçerik-width =&quot; &quot;fo: src =&quot; 5in / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Şekil 7, (AD). Yukarıdaki görüntüler bu yazıda anlatılan yöntem kullanılarak toplanmıştır bu örnekleridir. Paneller A, B, C, D, tek bir tarama süresi sırasıyla ilk ve son görsel vardır. A, B göstermektedir tam C, D, tek bir plaka gösteren, taranan alanın kırpılmış bir bölge iken, bölgeyi taradı. Çeşitli tutarsızlıklar görülebilir. Panel A çimlenme ve büyüme yörünge değişimini göstermektedir. Panel B (Görüntü A olarak aynı fideler; 9 saat sonra) plakalar yoğunlaşmayı birikebilir olduğunu göstermektedir. Panel C ve D güçlü büyüme o dolayı iyi sonuç olarak kabul edilirf fidan ve çalışma boyunca görüntü kalitesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Şekil 8. Geliştirilen görüntü sıkıştırma algoritması ölçeğini (üst) gri bir tarayıcı görüntü dönüştürür. Görüntü sağ ve sol yarıya bölünür ve görüntü sınırları (gösterilmemiştir) kaldırılır. Her yarım tek tek fidan pozisyonları en büyük toplam piksel yoğunluğuna sahip satır bularak tanımlanır. Bu pozisyonları plakası (alt) tüm fidan uygulanan yeni bir kırpma alanı tanımlamak için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response at JoVE.com

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

using-flatbed-scanners-to-collect-high-resolution-time-lapsed-images

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Görüntüleme.  Doane College.  Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir. 

Video: Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Biyoloji

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Ve Mısır

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri