급여 및 연구 지원은 미국의 대두위원회에서 제공하고, 오하이오 주립 대학 / 오하이오 농업 연구 개발 센터 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 하였다. 이 연구는 부분적으로 CMHG에 CONACYT 멕시코에서 친교에 의해 지원되었다. 상표 또는 독점적 제품의 언급은 OSU / OARDC에 의해 제품의 보증이나 보증을 구성하지 않고도에도 적합 다른 제품의 배제에 승인을 의미하지는 않습니다. 저널 기사 없음 HCS 09-17.

다음 방법론은 자동 이미지 수집 시스템을 사용하여 유전자 발현의 이미지 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다. 설명의 편의를위한, 전반적인 접근 방법은 네 단계로 나눠되었다 : 1) 종자 준비, 2) 유전자 도입을 입자 충격, 3) 로봇 이미지를 수집하고, 4) 이미지 분석을 사용합니다. 이 일반적인 방법론이 다른 어플 리케이션의 넓은 범위에 사용할 수 있지만, 프로토콜의 현재 세트 같은 작품에서 추적 유전자 발현에 대한 유용한 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자의 사용에 기반 시간이 지남에 따라 생활의 조직. I. 시드 준비 <ol><li> 리마콩 (. Phaseolus lunatus CV 헨더슨 - 부시) 씨를 구입, 또는 이상 성장 챔버의 재배 식물 (50 % 상대 습도, ​​8분의 16 H 조명 : 어두운, 23분의 25 ° C 주 / 야)에서 수확 수 있습니다. 수확 후 종자의 품질은 -20 ° C.에 저장 종자에 의해 유지 수 있습니다 </li><li> 씨를 germinating위한 마젠타 GA7 용기를 준비합니다. 폴드 필터 종이 또는 종이 타올 마젠타 상자의 하단에 들어갈 수 있습니다. 종이 타월을 축축하게하다, 그리고 unabsorbed 물을 부어 각 컨테이너에 ~ 25 ML 탈이온수를 추가합니다. 압력솥 20 분 종이가 들어있는 상자를 moistened. </li><li> 50 ML 일회용 원심 분리기 튜브를 사용하여, 60 RPM에서 자이 러 토리 쉐이크에 떨고있는 20 분 10 % 상용 표백 용액 (20-40 ML 20 씨앗)의 종자를 소독. 참고 : 이후의 모든 단계가 층류 후드에서 수행되어야합니다. </li><li> 각 린스 중 30 초에 대한 부드러운 교반과 멸균 탈이온수와 씨앗에게 4-7 번 씻어. </li><li> 각 멸균 마젠타 상자에있는 접힌 종이의 층 사이에 5-6 살균 씨앗을 놓으십시오. </li><li> 25 ° C, H 빛을 8분의 16 : 어두운 40 μEm -2 -1의 다음과 같은 조건에서 4 일간 씨를 품어. </li></ol> II. 입자 충돌을 사용하여 유전자 소개 <ol><li> 생활 조직에서 모니터링할 수 있습니다 리포터 유전자로 좋아하는 발현 벡터를 사용하여 유전자 구조를 빌드합니다. 우리는 모터와 모터 요소 분석을위한 높은 사본 번호 발현 벡터 유용한 설계했습니다. 이 벡터는 프로 모터 / 변형 조직에 발기인 요소 기능을 시각화하는 데 사용되는 GFP의 유전자를 포함하고 있습니다. </li><li> 1-2 주변 모종을 germinating에서 폭격, 엑사이스 리마 콩 cotyledons 전에 H와 종자 외피를 제거합니다. 충격에 적합 Cotyledons은 녹색 평면 및 추가 이미지 분석에 방해가 수있는 손상을 무료로 빛을 노란색해야합니다. </li><li> MS 소금 1, B5 비타민 2, 즉시 excised 후 3 % 자당 및 0.2 % Gelrite (산도 5.7)이있는 OMS 문화 매체에 플레이스 cotyledons. </li><li> DNA가 M10 텅스텐 입자 (실바니아, 토완다, PA, 미국)에 구축 침전물. 0.6 ML의 microfuge 관에서, 25 μl 텅스텐 입자 (입자가 바로 사용하기 전에, 멸균 물, 100 MG ML -1에 resuspended됩니다) 5 μl DNA (1 μg의 μl -1), 25 μl 2.5 M의 염화칼슘 (시그마를 추가 - 알드리치 고양이. C3881 - 500G) 10 μl 100 MM spermidine (시그마 고양이. S - 2626). 소용돌이 간략 모든 구성 요소를 철저를 혼합합니다. </li><li> 5 분 얼음의 DNA 준비를 품어. 그런 다음 제거 50 μl 뜨는을 삭제. </li><li> vortexing하여 DNA - 코팅 입자를 Resuspend 즉시 2 μl 나누어지는를 제거합니다. 이 vortexing 단계에게 나누어지는이 튜브에서 제거됩니다 때마다 반복합니다. 코팅 입자가 얼음에 보관하고 15 분 이내에 사용해야합니다. </li><li> 필터 화면의 중간에 주사기 필터의 상단에, 장소를 통해 2 μl 코팅 입자. 입자 총 챔버 내부의 필터 지주 단위로 코팅된 입자를 포함하는 필터 장치를 놓습니다. </li><li> 배플에 리마콩 떡잎 adaxial 측면을 놓고 입자 총 챔버에 배플을 놓습니다. 비커의 바닥에 녹아있는 화면으로 구성되어 있습니다 배플은, 폭격하는 동안 조직을 지원하는 플랫폼으로 사용됩니다. </li><li> 입자 건 (이 방법에서 우리 연구실에 설계된 간단하고 저렴한 입자 인플로 건 3, 돼지를 사용)를 사용하여 충격 조직은 다음과;) 후 챔버 대피하기 위해 진공 이어지는 밸브, B)을 엽니다 진공 입자 충돌 후, 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제 760mm (30) HG, 솔레노이드를 활성화하고 입자를 추진하기 위해 헬륨을 출시, C)에 도달합니다. 입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50 PSI입니다. </li><li> 진공이 릴리스 후, 폭격을 cotyledons를 검색하고 OMS 문화 매체, 최대 떡잎, adaxial 측면을 반환합니다 챔버 문을 엽니다. 참고 : 부량와 표현 프로 파일링 들어, 우리가 일반적으로 모든 DNA 구조 세 cotyledons 최소 도배. 일반적으로 DNA는 긍정적인 관리,잘 공부 유전자 발현 프로필을 준 구축, 참조로 포함됩니다. </li></ol> III. 자동 이미지 콜렉션 <ol><li> 수은 램프를 켜고 따뜻하게하는 램프에 대해 30 분 기다립니다. </li><li> 그 자리 - RT CCD 카메라 (진단먼트 주식 회사, 스털링 헤이츠, MI, 미국)과 로봇 플랫폼의 움직임을 드라이브 로봇 플랫폼 모터 컨트롤러에 대한 전원을 켭니다. </li><li> MZFLIII 해부 현미경에 (Leica, Heerbrugg, 스위스), GFP 감지 (예 40분의 480 NM, 엠 510 LP.. GFP2 필터 설정)에 대한 필터 설정을 설정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 분사하여 걸쭉하게 폴리 카보 네이트 페트리 접시의 뚜껑을 소독. 페트리 접시의 기본 이미지 모음 4 중 결로 방지 커버하는 데 사용되는 전문 뚜껑. </li><li> 자동 이미지 수집 시스템의 로봇 플랫폼 (Arrick 로봇, 허스트, TX, 미국)에 폭격 cotyledons가 들어있는 접시를 놓습니다. 로봇 플랫폼은 스테핑 모터 세트에 의해 구동과 8 배양 접시의 첨부 파일 테이블로 구성되어있다. 플랫폼은 폴리 카보 네이트, 폴리 프로필렌과 알루미늄 구성되어 있습니다. 접시는 측면 플라스틱 세트 나사를 강화하여 위치에 고정됩니다. </li><li> 로봇 플랫폼과 이미지 수집을 모두 제어하는​​ 사용자 지정 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다. 또한, 소프트웨어 하얀 빛을 컨트롤러 스위치를 엽니다. </li><li> &quot;모터 모션 &#39;탭에서&#39;에 모터 &#39;및&#39;모터 홈&quot;을 클릭하십시오. 소프트웨어가 홈 위치로 플랫폼을 orients 후, 우리는 모든 떡잎에 대한 위치를 입력 시작할 수 있습니다. </li><li> &quot;모터 모션 &#39;탭에서, 첫 번째 접시를 선택합니다. 플랫폼은 현미경의 목표 아래 페트리 접시의 중앙에 위치합니다. 이동 거리 버튼을 사용하여 정확하게 이미지 컬렉션의 첫 번째 떡잎 위치를. 에 하얀 빛을 컨트롤러, 대상 지역은 &quot;라이브 모드&quot;기능을 설정하여 컴퓨터 모니터를 통해 볼 수 있습니다. </li><li> 최초의 떡잎은 해부 현미경에 관한 매뉴얼 손잡이를 사용하여 초점과 배율 (1.6x 배율 선호)으로 설정합니다. 같은 접시에 남아있는 cotyledons에 대한 초점 조정은 로봇 플랫폼에서 각 접시 아래에있는 세 수평 나사를 사용하여 만들어집니다. </li><li> 관심 영역이 설정되면, &quot;이 위치 추가&quot;버튼을 클릭하십시오. 소프트웨어는 위치 일정 파일에이 지역의 좌표를 추가하고 플랫폼 판의 중심으로 돌아갑니다. </li><li> 위치를 설정하고 이동 거리 버튼과 수동 수평 나사를 사용하여 접시에 모든 나머지 cotyledons에 대해 중점을두고 있습니다. 모든 cotyledons의 모든 좌표가 입력되고 나면, 위치 일정 좌표를 저장합니다. </li><li> 이미지 모음 매개 변수를 입력합니다. 흰색 또는 파란색, &quot;이미지 설정&quot;탭에서, 라이트 원하는 유형을 선택합니다. GFP 감지 들어, 푸른 불빛을 사용해야합니다. 또한, 노출 설정을 입력합니다. 우리가 빨강, 파랑과 녹색 색상 독립적으로 노출 시간을 수정할 수 있지만, 우리는 일반적으로 우리가 직접 만들 수 있도록 GFP 사진 문서 (20, 14 각각 빨간색, 녹색 및 파랑 채널, 14 초)에 대해 동일한 설정을 사용 다른 DNA 구조 사이에 일관성을 비교. </li><li> 같은 &quot;이미지 설정&quot;탭에서 이미지가 저장됩니다 빈 폴더를 지정합니다. 이미지의 모든 시리즈는 cotyledons에 입력한 위치의 순서에 따라 순차적으로 번호가 독립 폴더에서이 마스터 폴더 내에 저장됩니다. </li><li> &quot;캡처 시간 관리 &#39;탭으로 이동하여 이미지를 수집 시간 간격 및 이미지 수집주기의 총 수를 설정합니다. 이미지는 일반적으로 잘 정의 유전자 발현 프로파일을 생성, 100 H에 대해 매 시간마다 수집하고 있습니다. </li><li> 클릭하여 이미지 획득을 시작 &quot;실행 일정!&quot; &quot;위치 일정&quot;탭에서에 위치한 버튼을 클릭합니다. </li><li> 100 H 이미지 컬렉션의 끝에 추가 이미지 분석을위한 대용량 하드 드라이브 또는 컴퓨터로 로봇을 제어하는​​ 컴퓨터에서 이미지를 전송합니다. 고해상도 이미지 (1600 X 1200 픽셀) ~ 5 MB 각을 측정 TIF 파일로 저장됩니다. </li></ol> IV. 이미지 분석 <ol><li> 어도비 ImageReady를 사용하여 각 폴더에서 100 순차 이미지를 조립. <ol><li> ImageReady를 열고 프레임으로 시리즈를 구성하는 모든 순차 이미지를 가져옵니다. </li><li> 800 × 600 픽셀 원본 이미지 크기를 조정할 수 있습니다. 수집된 이미지가 이미지 처리가 느리 수 대용량 파일을 생성 고해상도입니다. </li><li> 이미지 스크롤 대부분의 이미지에서 볼 수 자리 (들)을 찾습니다. </li><li> 선택된 지점 (들)에는 300 %까지 확대할 수 있습니다. 높은 배율을 사용하여 이미지 정렬보다 정확한 등록하실 수 있습니다. </li><li> 모든 이미지의 상단에 레이어를 삽입하고 있는지 모든 프레임에 표시됩니다하십시오. &quot;페인트&quot;도구를 사용하여 지점 (S) 위치를 표시합니다. </li><li> &quot;이동&quot;도구를 사용하여 모든 프레임을 정렬하고 참조로 레이어의 흔적을 복용 시작합니다. </li><li> 정렬이 완료되면, 참조로 사용되는 레이어를 삭제하고 단일 &quot;PSD&quot;파일로 이미지를 저장합니다. 또한, 가장 높은 해상도를 사용하여 단일 &quot;MOV&quot;파일로 모든 프레임을 내보낼 수 있습니다. 각 이미지 시리즈의 수동 정렬 ~ 10 분 정도 소요됩니다. </li></ol></li><li> ImageJ를 사용하여 유전자 발현의 부량을 수행합니다. <ol><li> 오픈 ImageJ 소프트웨어와 &quot;MOV&quot;파일을 열려면 ImageReady에서 이전에 저장한. </li><li> 선택 도구를 사용하여 400 X 300 픽셀 지역 작물 이미지를 선택합니다. 이 새로운 파일은 &quot;AVI&quot;파일로 저장해야합니다. </li><li> &quot;이미지&quot;, &quot;컬러&quot;와 ImageJ에서 &quot;RGB 분할&quot;을 클릭하여 빨간색, 파란색 및 녹색 채널에 새로운 &quot;AVI&quot;파일에있는 순서대로 이미지를 분리합니다. </li><li> 녹색과 적색 채널의 모든 이미지에서 배경 형광을 빼기. 녹색 채널 이미지 시리즈를 사용하지 않는 표현 전지와 지역의 20 X 20 픽셀 영역을 선택하고 같은 지역을 두 채널에서 선택되도록, &#39;투자 수익 (ROI) 관리자 &quot;도구의 위치를​​ 기록합니다. 녹색 채널에 적극적인 20 X 20 픽셀 사각형으로 ImageJ의 작업 표시줄에있는 &quot;플러그인&quot;명령으로 이동 후 플러그인 - 도구 &quot;각 슬라이스에 대한 투자 수익 (ROI) 측정 빼기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> ImageJ에서 &quot;한계&quot;GFP - 표현 픽셀을 정의하거나 세그먼트에 다음 &quot;조정&quot;, &quot;이미지&quot;를 클릭합니다. 20-30 픽셀의 평균 스폿 크기를 얻기 위해 임계값 창에서 막대를 드래그하여 임계값 수준을 조정합니다. </li><li> 우리가 의미가 픽셀당 가치의 총 수를 GFP - 표현 픽셀을 회색 측정할 수 있도록 설계하는 플러그인을 사용하여 GFP 발현을 확인합니다. </li><li> 평균 출력을 복사는 Microsoft Office Excel로 ImageJ 및 붙여넣기에서 값을 그레이 스케일. 의미를 곱하여 각 채널 (빨간색과 초록색)의 GFP 발현을 계산하면 총 숫자로 픽셀당 가치를 그레이 스케일 GFP - 표현 각 채널에 대해 픽셀. 두 채널에 대한 표현 값의 합계는 GFP의 표현을 제공합니다. 값은 유전자 발현 프로파일을 설명하고 직접적인 비교를하는 데 사용할 수 있습니다. 시간 경과 애니메이션 또한 유전자 발현 프로파일의 독특하고 명확한 시각화를 제공하는 &quot;MOV&quot;또는 &quot;AVI&quot;파일을 사용하여 생성할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> V. 대표 결과 로봇 이미지 수집과 분석 절차 (그림 1) 여기에 짧은 기간의 유전자 발현에 대한 양적 데이터의 대량의 인수 허용했다. GFP 유전자를 사용하여 공장 모터 특성화 경우,이 방법은 일시적 표현 프로필을 만드는 방법 (그림 2)뿐만 아니라 transiently 및 안정 - 변형 식물 조직 5,6에서 자세한 - 방식의 GFP 발현의 추적 유용하지 않습니다. 수집된 연속 이미지를 생성 짧은 시간 - 저속 애니메이션 플랜트 조직에서 시간이 지남에 따라 유전자 발현에 대한 심층 분석을위한 유용한 도구입니다. 이 방법은 또한 직접적인 유전자 발현에 영향을 미칠 요인을 평가하기위한 훌륭한 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 바이러스 원산지 입을 다양한 진압의 존재 하에서 GFP 과도 표현이 성공적으로 우리의 자동 이미지 수집 및 분석 시스템 7,8을 사용하여 연구하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 이미지 분석 절차는 네 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. (A) 로봇 이미지 수집 시스템, 빨강, 파랑과 녹색 채널로 이미지 (B) 분리, 임계값 수준을 조정하여 표현하는 픽셀의 (C) 세분화, 및 (D)의 출력 결과를 얻기를 사용하여 이미지 시리즈의 취득 포함하는 가치와 GFP - 표현 초점 카운트를 그레이 스케일. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. GFP로 융합 식물 발기인에 의해 구동 다른 과도 표현 프로필을 보여주는 그래프. 데이터는 우리의 로봇 이미지 수집 시스템을 사용하여 수집하고 ImageReady와 ImageJ 소프트웨어로 분석했다.

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

로봇의 사용은 인간의 삶의 다양한 측면에서 큰 응용 프로그램을 가지고, 특히, 로봇이 효과적으로 지루하고 복잡한 활동을 자동화하고,보다 정확한 방법으로 작업을 수행하기 위해, 위험한 환경에서 활동을 수행하는 데 사용되었습니다. 분자 생물학, 그리고 특히 유전자 발현 분석에, 로봇은 유전자뿐 아니라 기능뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 조직의 성장과 발전을 추적할 수 있습니다. 많은 생물 학적 현상은 단일 시점의 관찰을 사용하여 수행하기 어려울 수있는, 동적으로 발생합니다. 표현 연구 GFP 유전자의 사용은 조직의 반응과 성장을 관찰에 대한 추가 혜택을 제공합니다. 우리의 실험 절차를 보려면, GFP는 우리 GFP 탐지가 아닌 파괴와 같이 시간이 지남에 따라 조직의 동일한 조각의 유전자 발현을 따르 수 있습니다. 또한, GFP 단백질의 우리의 버전 감지를 허용하도록 충분히 안정뿐만 아니라 우리가 상승과 유전자 표현의 가을을 모두 수행하므로 식물 조직의 축적을 최소화하기 위해 일부 매출을 보여줍니다. 우리는 이미 애플 리케이션의 광범위한 로봇 이미지 수집 및 분석 시스템을 활용했습니다. 우리는 현상의 역동적인 이해가 필요한 것입니다 많은 생물 학적 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 예견. 예를 들어, 식물 조직의 성장과 발전은 귀중한 통찰력 / 다음 프로세스에 대한 정보를주는 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 또한, GFP 같은 기자 유전자를 사용하여 단백질 수송의 역학은 시간 경과 애니메이션을 사용하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 이 보고서에서 설명하는 방법은 기술적으로 복잡하지만 개념적으로 간단합니다. 우리의 결과는 강력하고 새로운 어플 리케이션이 지속적으로 발견되고있다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

식물 조직의 유전자 발현은 일반적으로에 대한 식물의 조직에서 화합물의 파괴 추출하여 공부합니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 분석합니다. 방법은 여기에 녹색 형광 단백질 (활용 발표<em&gt; GFP</em시간이 지남에 따라 조직의 동일한 조각의 유전자 표현의 지속적인 모니터링&gt;) 유전자.<em&gt; GFP</em&gt; 유전자는 다른 발기인의 규제 통제하에 위치 및 입자 충돌을 통해 리마콩 cotyledonary 조직에 도입되었다. Cotyledons는 다음 디지털 카메라 및 문화 요리 보안 첨부 파일을 허용하도록 맞춤 설계된 2 차원 로봇 플랫폼과 형광 현미경의 해부 구성되어 로봇 이미지 수집 시스템에 배치했다. 이미지는 각 발기인에 대한 표현 프로파일을 생성하여 100 시간 동안 매 시간마다 cotyledonary 조직에서 수집되었다. 100 이미지의 각 수집 시리즈 처음으로 GFP가 - 표현 foci 것은 지속적으로 분석 선택한 필드 내에 유지 것을 확실히 ImageReady 사용하여 수동 이미지 정렬의 대상이되었다. 300 x 400 픽셀을 측정하는 일련의 특정 영역은 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 GFP의 강도 측정을 제공하기 위해 추가 분석을 위해 선택되었다. 배치 이미지는 빨강, 녹색 및 파랑 채널과 GFP - 표현 영역 것은 ImageJ의 문턱 기능을 사용하여 확인되었습니다. 나뉘어 있었다 배경 형광 공제한 후 (의 회색 값의 뺄셈을하지 않는 표현 각 픽셀에서 픽셀)을 각각 빨간색과 녹색 채널에서 GFP의 강도는 각 GFP - 표현 픽셀의 총 개수로 픽셀당 가치를 그레이 스케일 의미를 곱하여 계산 채널, 그리고 빨간색과 녹색 채널을 모두 그 가치를 추가할 수 있습니다. GFP 강도 값 표현 프로필을 항복 모든 100 시간 지점 수집되었다. GFP 발현 프로파일의 변화는 발기인 강도, 입을 억제의 존재, 또는 발기인의 자연과 같은 요인의 차이에서 발생. GFP 강도의 부량 이외에 이미지 시리즈는 ImageReady를 사용하여 시간 경과 애니메이션을 생성하는 데 사용되었습니다. 시간 경과 애니메이션은 세포의 명확한 대부분 속도가 느린 감소 다음에 GFP 표현의 비교적 빠른 증가를 표시하는 것으로 나타났습니다. 일부 세포는 때때로 빠른 세포 죽음에 연결되어있을 수 있습니다 형광의 갑작스런 손실을 표시합니다. 인접한 세포에 막과 세포 벽 전체 GFP의 명백한 교통도 관찰되었다. 시간 경과는 달리 GFP의 강도 프로필 또는 단일 시점 이미지 컬렉션을 사용하여 얻을 수없는 추가 정보를 제공하는 애니메이션.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석​​에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K 조회수.  The Ohio State University. 우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석​​에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

척수 전기 생리학

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...