Bu yöntem, verimli enfekte hücrelerin benzersiz özellikleri nelerdir, hangi konak kofaktöranlarının virüslerin üretken enfeksiyon oluşturmasına izin verebildiği ve terapötik müdahalelerde bu hücrelerin nasıl hedeflendirilebildiği gibi konak-patojen etkileşimleri alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek hücre içinde hem protein hem de mRNA için nicel önlemler sağlamasıdır ve reaktiflerin çoğu ticari olarak mevcuttur. Hücre sıralama prosedürünü gösteren Matthew Creegan, Doktor Michael Eller'in laboratuvarındaki akış sitometri çekirdeğinden kıdemli bir teknisyen.
Başlamak için, pcr öncesi moleküler biyoloji iş istasyonunda, 96 gen ekspresyonu tahlillerini bir RNase,DNase serbest tüpünün bir araya getirerek ileri ve ters astarların 180 nanomolar son konsantrasyonuna her bir tahlil eklemeyi sağlayarak tahlil karışımını hazırlayın. Isırık karışımının uygun seyreltilmesini sağlamak için DNA süspansiyon tamponu ekleyin. Her beklenen 96 by 96 yonga dizisi için, pipet her bir töz altı mikrolitre bir 96 iyi PCR plaka belirlenmiş bir kuyu içine, sonra bir yapıştırıcı ile plaka mühür.
Yüzey boyama canlı hücreleri başlamak için, bir doku kültürü biyogüvenlik kabine, ilk tazminat örnekleri ve metin protokolünde belirtildiği gibi floresan antikor kokteyl bir ana karışımı hazırlamak. 37 derece santigrat su banyosunda iki dakika boyunca cryopreserved hücreleri eritin. Bundan sonra, pbs 12 mililitre içeren bir 15 mililitre tüp hücre süspansiyon 5 ve iki mililitre arasında ekleyin.
Santrifüj 500 G'de 25 santigrat derecede üç dakika, sonra PBS'yi aspire edin ve üç mililitre taze PBS'de peleti yeniden askıya alın. Bu karışımı beş mililitrelik polistiren tüpe aktarın. Santrifüj bir kez daha 500 G'de 25 santigrat derecede üç dakika.
Süpernatant aspire, yaklaşık 10 mikrolitre artık PBS bırakarak. Daha sonra, 80 mikrolitre antikor kokteylinde 20 milyon adede kadar yıkanmış hücreyi yeniden askıya alın. Işıktan korunurken 25 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yat.
Bundan sonra, PBS üç mililitre ekleyin. Santrifüj 500 G'de üç dakika süreyle ve süpernatantı aspire edin. PBS'nin 300 ila 500 mikrolitresindeki hücreleri iyice askıya alın.
Bu çözeltiyi 35 mikrometrelik naylon hücre süzgeci kapağına borutakarak filtreleyin. sonra hücreleri buz üzerinde tutun ve sıralamakadar ışıktan korunun. PCR öncesi iş istasyonunda, ilk olarak metin protokolünde belirtildiği gibi TEK bir RNase, DNase serbest steril tüp teRT preAMP reaksiyon karışımını hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, bu reaksiyon karışımının 10 mikrolitresini istenilen sayıda 96 iyi PCR sıralama toplama plakasına dağıtın. Plakayı yapışkan filmle kapatın ve daha sonra plakayı önceden soğutulmuş 96 kuyu alüminyum bloğun üzerine yerleştirin. Bundan sonra, hücre sıralama gating düzenini kurun ve metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometrik hücre ayırıcısını hazırlayın.
Her kuyuya sıralanacak hücrelerin sayısını ve alt kümesini belirtmek için uygun araç ayarlarını girin. Yapışkan contayı çıkarın, ardından FACS hücreleri hazırlanan 96 iyi PCR toplama plakasına sıralayın. Taze yapışkan film ile plaka reseal.
Hemen resealed plaka girdap ve sonra santrifüj 2000 G dört derece santigrat bir dakika için. Termocycle 15 dakika boyunca 50 derece santigrat önceden ısıtılmış bir kapak ile bir PCR makinede plaka iki dakika boyunca 95 derece santigrat takip. Son olarak, 15 saniye boyunca 95 santigrat derece 18 döngüleri ve dört dakika boyunca 60 santigrat derece için termocycle, daha sonra bir post-PCR iş istasyonunda, yeni bir 96 iyi PCR plaka DNA süspansiyon tampon 20 mikrolitre içine cDNA beş mikrolitre aktarın.
Başlamak için, her kuyuda dört mikrolitre istihar edici reaktif içip qPCR titretplakasını hazırlayın. Daha sonra, 2X tsay plakasından qPCR plakasına her bir titrenin dört mikrolitresini aktarın. QPCR titrek plakasını dört santigrat derecede koruyun.
Kontrol hattı sıvılarını astar şırıngalarından çipin iki giriş valfine dağıtın. Koruyucu plastiği tabağın altından çıkarın. Çipi A1 konumunda çentikli tarafı olan bir IFC denetleyicisi üzerine yerleştirin ve ardından asal komut dosyasını seçin ve çalıştırın.
Her mikroakışkan talaş için, gerçek zamanlı reaksiyon karışımını hazırlamak için numune yükleme reaktifinin 50 mikrolitresini 500 mikrolitre PCR ana karışımıyla karıştırın. Pipet 4.4 mikrolitre bu reaksiyon yeni bir 96 iyi PCR plaka şimdi örnek plaka olarak belirlenen her kuyu içine karıştırın. Daha sonra, pipet 3.6 mikrolitre önceden seyreltilmiş cDNA örnek plaka her kuyuiçine.
Bundan sonra, fiş çentikli tarafında ilgili kuyuya doymak plaka beş mikrolitre aktarın. Numune plakasından beş mikrolitreyi çipin diğer tarafındaki ilgili kuyuya aktarın. Yüklü çipi IFC denetleyicisine takın ve yük karışımı komut dosyasını çalıştırın.
Ardından, çipi BioMark platformuna aktarın ve enstrümanı metin protokolünde belirtildiği şekilde ayarlayın, ardından fiş çalıştırma dosyasını belirlenen bir klasöre kaydedin. Fiş çalışması tamamlandığında, gerçek zamanlı PCR analiz yazılımını açın ve chiprun'u açmak için dosyayı, açık olarak seçin. bml dosyası.
Yazılım penceresinin sol üst köşesinde, yonga gezgini ve yonga çalıştırma özetini bulun. Fiş çalıştırma özetinin altında, dedektör kurulumuna tıklayın. Görev altında, yeni'yi tıklatın ve konteyner türü SBS plakasını ve konteyner biçimi SBS 96'yı seçin.
Haritalamanın yanındaki elipsli düğmeye tıklayın ve ardından M96-Assay-SBS96.dsp'yi seçin. Analiz görünümleri üzerine tıklayın. Görev altındaki qPCR sekmesinde, kullanıcı dedektörleri için doğrusal türev ve CT eşik yöntemi için taban çizgisi düzeltmesini seçin.
CT eşikleri sekmesinde, otomatik kutuyla başlatmayı işaretleyin ve ardından çözümle düğmesini tıklatın. Analiz görünümlerinin sağ üst çeyreğinde, ikinci sekme, sonuç tablosuna tıklayın. Açılan menüden, ısı haritası görünümünü seçin ve verilerle birlikte ısı haritası görüntülenir.
Isı haritasının altında, eşik ve günlük grafiğini tıklatın. Isı haritasındaki sütunlarla temsil edilen tahlillere tıklayarak ve üstel aşamadaki amplifikasyon eğrilerini kesişmek için eşiği gerektiği gibi sürükleyerek her dedektör için CT eşiklerini el ile ayarlayın. Bittiğinde, analiz et'i tıklatın.
Ardından, qPCR verilerini csv dosyası olarak dışa aktarın. QPCR verilerini BioMark bilgisayardan masaüstünüze aktarın. Verileri bir elektronik tabloya veya istatistiksel analiz yazılımına aktarın ve sonuçları çipteki örnek ve tahlil konumlarına göre eşleyin.
Yeni bir sütun oluşturun ve hücreleri viral genlerin ekspresyonuna göre gruplar halinde düzenlemek için koşullu bir formül kullanın. Analiz altında, X'e uygun Y'yi seçin ve gen ekspresyonunu grupla karşı çizin. Bundan sonra, 96 iyi plakaya karşılık gelen FACS sıralamasındaki FCS dosyalarını açmak için FlowJo sürüm dokuzu kullanın.
Dosya adı vurgulanırken, platform, olay numarası kapısı seçin ve dizinlenmiş sıra kapıları oluşturun. Tek tek hücreler satır tarafından görüntülenir. Tüm 96 hücreyi vurgulayın ve ardından çalışma alanını seçin, dışa aktarın, tüm telafi edilen katları seçin.
Veriler altında FCS dosyalarını seçin, dışa aktar'ı tıklatın ve belirlenmiş bir klasörü seçin. Tek tek hücreler için yeni FCS dosyalarını yeni bir FlowJo çalışma alanına sürükleyin. Tüm hücreleri vurgulayın ve sigma düğmesi, ortalama ve tüm floresan parametreleri ile temsil edilen istatistik ekle'yi tıklatın.
Tablo düzenleyicisini açın, ardından ilk hücrenin tüm katlarını vurgulayın ve tablo düzenleyicipenceresine sürükleyin. Bu pencerede, tablo oluştur ve görüntüle'yi tıklatın. Bundan sonra, kopyala-yapıştırma veya uygulama kaydet ve başlat düğmesini tıklatarak istatistiksel bir yazılıma kopyalayıp çıktı layın.
Tek hücreli FACS verilerini JMP'deki qPCR verileriyle plaka numarası ve iyi konuma göre birleştirin. Son olarak, birleştirilmiş veriler üzerinde grafiksel ve istatistiksel analizler yapın. Bu çalışmada, çoklu parametre akış sitometrisi ile tek hücreli yüzey protein ibitomu, yüksek multipleksli RTqPCR ile nicel tek hücreli mRNA ekspresyonu ile bütünleşmiştir.
Burada gösterilen FACS sıralanmış Rhesus makak CD4 pozitif T hücrelerinden tek hücreli kantitatif viral gen ekspresyonudur. Negatif hücrelerin Tat/rev pozitif N'si, stabilizasyon dan önce enfeksiyonun erken bir evresi ve kısmen spliced viral RNA'nın nükleer ihracatı ile tutarlı olan koyu yeşil pozitif hücrelerin N'sinden daha az tat/rev RNA kopyasını ifade eder. Pozitif hücrelerin tat/rev pozitif N'deki spliced Gag-RNA'nın yüksek bolluğu, bol genomik RNA'nın ifade edildiği ve tomurcuklanan virions'lara paketlendiği geç evre üretken enfeksiyonla tutarlıdır.
Tek hücreli viral gen, konak gen ve konak yüzey protein ekspresyonu gösteren bu trivariate çizim, CD4 ve CD3 transkriptleri devam etse bile yeşil renkte gösterilen tat/rev pozitif hücrelerde yüzey CD4 ve CD3 protein ekspresyonunun azaldığını göstermektedir. Bir kez hakim, bu teknik 2-3 gün içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, viral enfekte hücrelerde farklı ifade genler ve proteinler ile ilgili soruları ele almak için hedeflenen tek hücreli prototranskripsiyonel değerlendirme gerçekleştirmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
