Protokolümüz, fare dalak ve lenf düğümlerinin sabit durum fenotipik enstantane sağlamaktan daha büyük T hücre tepkisinin dinamiği yansıtmak için kullanılabileceği pratik bir yaklaşım sağlar. Tekniğimiz, devam eden bir yanıtla uğraşan antijene özgü CD8 T hücrelerini hassas bir şekilde algılar. Çoğalan CD8 T hücreleri, in vivo ilaç tedavisinin veya hücre transferinin muhtemelen şaşırtıcı etkileri olmadan ölçülür.
Tekniğimiz çeşitli ortamlarda bağışıklık dinamiklerinde bir pencere sağlayabilir. Örneğin, aşılama ve enfeksiyonlara, otoimmün hastalıklara ve kanser immünoterapisine yanıt olarak. 10x permeabilizasyon tamponunu damıtılmış su ile seyrelterek taze 1x permeabilizasyon yıkama tamponu hazırlayın ve agregaları ortadan kaldırmak için 0,45 mikrometre filtreden filtreleyin.
Monoklonal antikor Ki67 FITC'yi, numune başına 100 mikrolitrelik son hacim için bir titrasyon deneyi ile belirlenen 1x permeabilizasyon yıkama tamponunda seyreltin. Her tüpe 1x permeabilizasyon yıkama tamponunun 3 mililitresini ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj ekleyin. Üstnatant atın.
Yine, hücreleri peletmek için 1x permeabilizasyon yıkama tamponunu ve santrifüjü ekleyin. Ardından, üstnatant atın. Pelete 100 mikrolitre seyreltilmiş monoklonal antikor Ki67 FITC ekleyin, ardından girdap ve karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, hücreleri 4 mililitre 1x permeabilizasyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra santrifüj ve süpernatantı atın. Doğrudan akış sitometresinde elde edilecek numuneler için hücre peletine 350 mikrolitre PBS ve DNA lekesi için Hoechst ile inkübe edilecek numuneler için hücre peletine 250 mikrolitre PBS ekleyin. Hoechst ve PBS çözeltisini hazırlayın ve her numuneye ekleyin, böylece son konsantrasyon mililitre başına iki mikrogram olacaktır.
Girdap ve karanlıkta 15 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatır. Daha sonra, numuneleri beş dakika santrifüjleyin ve hücre peletine 350 mikrolitre PBS ekleyin. Yazılımı açın ve çalışma alanı şeridi bölümünde Grup Oluştur"u tıklatarak analiz edilecek farklı organlara karşılık gelen farklı gruplar oluşturun.
Grup adına çift tıklayarak değiştirilen grup penceresini açın ve eşitlenen işleve onay işareti ekleyerek yeni oluşturulan grupları eşitleyin. Her FCS dosyasını ilgili grubuna sürükleyin, sonra a-LN grubuyla başlayan bir gating stratejisi oluşturun. Örnek için alınan ungated olayları bir nokta çiziminde görüntülemek için tam lekeli örneği çift tıklatarak grafik penceresini açın.
X ve y ekseninin, bu makalenin akış sitometresi ayarları dosyasının ikinci tablosunda belirtildiği gibi FCS dosyalarında olduğu gibi etiketlendiğini unutmayın. Uygun görselleştirme için yeterli sayıda olayın görüntülendiğinden denetleyin. Gerekirse, çalışma alanı şeridindeki kalp simgesine tıklayarak tercihleri açın, Grafikler'i seçin, ardından grafik türü olarak Nokta Çizimi"ni seçin ve ilgili kutuda çizilen nokta sayısının doğru olup olmadığını denetleyin veya değiştirin.
Grafik penceresindeki düzenlenmemiş olayları, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde DNA-W bulunan bir nokta grafiğinde görüntüleyin. Her iki eksen için doğrusal ölçek kullanın. Gerekirse, grafik penceresindeki her eksene yakın bir T ile gösterilen kutuyu tıklatarak logaritmaktan doğrusala kadar ölçeği değiştirin.
Gating tool bölümünde dikdörtgene tıklayarak tek bir hücre popülasyonu seçin, sonra dikdörtgen kapının ortasına çift tıklayarak x ekseninde FSC-A parametresine sahip bir nokta çiziminde tek hücreleri görüntüleyin ve ölü hücre y ekseninde kalıplanın. Ölü hücre ölümü için negatif olan canlı hücre popülasyonu seçmek için çokgene tıklayın. Hücreleri x ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde SSC-A parametresi olan bir nokta çiziminde görüntülemek için çokgen kapının ortasına çift tıklatın.
Dikdörtgene tıklayın ve bu grafikteki tüm tek canlı hücreleri dahil etmek için rahat bir kapı oluşturun. Hücreleri x ekseninde CD3 ve y ekseninde CD8 ile nokta çiziminde görüntülemek için rahat kapının ortasına çift tıklayın. Grafik penceresinde görselleştirme için uygun erişim ölçeğini kullanın.
Gerekirse, her eksene yakın bir T ile belirtilen kutuya tıklayarak x ve y ölçeğini değiştirin, Erişim İşlevini Özelleştir'i seçin ve gerektiğinde temeller ve pozitif on yıllar ile ekstra olumsuzg on yıllarını değiştirin. Çokgeni tıklatarak CD3+CD8+hücreleri seçin. Hücreleri x ekseninde Tetr-gag ve y ekseninde Pent-gag ile nokta çiziminde görüntülemek için CD3+CD8+gate'in ortasına çift tıklayın.
Çokgen üzerine tıklayarak antijene özgü CD8 T hücrelerini seçin. Hücreleri x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 bulunan bir nokta grafiğinde görüntülemek için gaga özgü kapının ortasına çift tıklayın. Grafik penceresinin gating aracı bölümünde Quad"'yı tıklatarak farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri seçin.
Kapıları grubun tüm örneklerine uygulamak için tek bir örnekte oluşturulan gating stratejisini ilgili gruba kopyalayın. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi b-dalak ve CBM grupları için gating stratejilerini kopyalayın. Tüm kapıların üç grubun her örneği için uygun olduğunu doğrulayın.
Gerekirse, grubu desynchronize ve el yazmasında açıklandığı gibi kapıları değiştirin. Rahat kapının BM hücrelerini x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 ile noktasal bir çizimde görüntüleyin. Çalışma alanı şeridi bölümünde Düzen Düzenleyicisi"ne tıklayarak sonuçları görselleştirin.
Örnek bölmedeki gating stratejisinin her kapısını düzen düzenleyicisine sürükleyin ve çizimleri gating sırasına göre yerleştirin. Gerekirse, düzende karşılık gelen çizimi çift tıklatıp grafik tanımı penceresinde uygun türü seçerek grafik türünü değiştirin. Gruba tıklayın ve her organdan antijene özgü CD8 T hücrelerinde elde edilen sonuçları görselleştirmek ve farklı örnekleri karşılaştırmak için düzen şeridindeki işlevlere göre yineleyin.
Pozitif bir kontrolü temsil eden kemik iliği hücrelerinin sonuçlarını görselleştirin. Kemik iliği hücrelerinin hücre döngüsü analizinin tipik bir örneği burada gösterilmiştir. Protokol, DNA boyamanın mükemmel kalitesini gösteren düşük bir G0 ila G1 ve G2'den M DNA zirvelerine kadar düşük bir değişim katsayısı sağladı.
Antijene özgü CD8 hücrelerini tanımlamak için beş aşamalı bir gating stratejisi kullanıldı. Tedavi edilmeyen farelerde boyama arka planını artırmadan aşılanmış farelerde gag spesifik CD8 T hücre tespitinin hassasiyetini artırmak için iki multimer kullanıldı. Drenaja bağlı lenf düğümlerindeki ve dalaktaki gag spesifik CD8 T hücreleri, üçüncü gün destek sonrası S-G2/M fazlarında yüksek oranda hücre içerir.
Ayrıca, S-G2/M fazlarındaki gag spesifik CD8 T hücreleri, aynı organdan toplam CD8 T hücrelerine bindirildiğinde yüksek FSC-A ve SSC-A'ya sahipti. Ofset histogramları, lenf düğümlerindeki G0'daki birkaç hücre dışında, aktif T hücreleri için beklendiği gibi, gag spesifik CD8 T hücreleri tarafından CD62L ekspresyonun düşük olduğunu gösterdi. Bu yöntem, T hücrelerinin membran ve Ki67 boyama ile birlikte mükemmel bir DNA boyama kalitesi elde etmesi için tasarlanmıştır.
Akış sitometrisi veri analizi önemli bir noktadır. Kapı konumlandırması için uygun denetimi kullandığınızdan emin olun. Bu yöntemi kullanarak fare ve insan periferik kanında hücre döngüsünün S-G2/M evrelerinde T hücreleri keşfettik.
Bu teknik tip 1 diyabet, enfeksiyöz mononükleoz ve COVID-19'da immün izleme çalışmalarında yararlı oldu.
