Başlamak için, senkronize genç yetişkin C.Elegans hermafroditlerini bir mikro santrifüj tüpüne alın. Solucan peletine Poloxamer 188, Pluronic F127 ve iki mikrolitre boyama kiti reaktifi içeren 200 mikrolitre M9 tamponu ekleyin. Boyaları ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
Karışımın oda sıcaklığında bir saat boyunca 20 RPM'de dönmesine izin verin. Sonra solucanları bir dakika boyunca 500 G'de döndürün. Bundan sonra, solucan topağını rahatsız etmeden lekeleme çözeltisini çıkarın.
Solucanları M9 tamponu ile üç kez yıkayın ve uygun tedaviyi içeren tohumlanmış bir NGM agar plakasına aktarın. Solucanları plakalardan bir mililitre M9 tamponu ile taze mikro santrifüj tüplerine yıkayın. Daha sonra, solucanları 30 dakika boyunca buz üzerinde% 1 formaldehit ile sabitleyin.
Ve kalan formaldehitleri gidermek için solucanları bir mililitre M9 tamponla üç kez yıkayın. Solucanları peletledikten sonra, pelet miktarını 10 mikrolitre M9'da bozulmadan tutarak maksimum miktarda süpernatan aspire edin. Daha sonra,% 2.5 agaroz hazırlamak için, 10 mililitrelik bir borosilikat cam test tüpüne 0.125 gram agaroz ağırlığındadır. Beş mililitre M9 tamponu ekleyin ve tüpü bir bunsen brülörü ile hafifçe ısıtarak agarozu çözün.
Erimiş agarozu 75 santigrat derecede ayarlanmış kuru bir banyoya aktarın. Bir mililitrelik bir uç kullanarak bir güverte parlatıcı mikroskop kapak camına 100 mikrolitre erimiş agaroz ekleyin. Hemen, çapraz bir şekil oluşturan agaroz damlasına dik olarak başka bir slayt koyun.
İki dakika sonra, agaroz pedini alt kapak slaytında bırakarak üst kapak camını iterek slaytları yavaşça ayırın. Solucanları bir Pasteur cam pipet ile agaroz pedine aktarın. Fazla sıvıyı çıkarmak için laboratuvar mendilinden yapılmış bir fitil kullanın.
Daha sonra solucanları daha küçük bir kapak kayması ile örtün ve buharlaşmayı önlemek için çevreye şeffaf oje uygulayın. Slaytı ışıktan korumak için karanlık bir kutuya yerleştirin. 60 kat büyütme lensi kullanarak solucanları 24 saat içinde uygun dalga boylarında görüntülemek için konfokal mikroskop kullanın.
Ardından, görüntüleme yazılımını açın ve gri alana sağ tıklayın. Görüntülenen açılır pencereden Edinme'yi seçin. Ti2 tam ped.
ND alma ve arama tabloları. Ti2 tam yüzey altında, 60 kez seçin ve solucanları odaklamak için mikroskop ince odak düğmesini ayarlayın. Ardından dönen diski seçin ve 16 bit-no binning seçeneğini belirleyin.
Her floresan filtresi için, pozlama süresini 500 milisaniye ve parlak alan için 20 milisaniye olarak ayarlayın. Bu parametreler ayarlandıktan sonra, Şimdi çalıştır'ı seçin ve çıktı görüntüsünün ND2 dosyası olarak oluşturulmasını bekleyin.
