Gross laboratuvarı üyelerine, makalenin eleştirel okuması ve yorum ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne (CGC) bazı suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu araştırma Vitalunga Ltd ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (hibe No. 989/19) bir hibe ile desteklenmiştir. Grafiksel soyut şekil (Şekil 1) BioRender.com ile oluşturulmuştur.

NOT: Okuyucuların rahatlığı için, protokolü iki bölüme ayırdık: biri C. elegans'ta mitofajiyi ölçmek için protokole odaklanırken, diğeri karaciğer hücrelerinde mitofajiyi ölçmek için protokole odaklanmaktadır. Malzemelerin listesi sağlanan Malzemeler Tablosunda bulunabilir.
1. C. elegans protokolü
<ol><li>Nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarının ve Escherichia coli OP50 bakteri stoğunun hazırlanması NOT: Bir açıklama noktası olarak, NGM plakalarının ve OP50 bakteri stoğu25,26'nın hazırlanması için standart protokolleri takip ederken, bu protokollerde farklı laboratuvarlar arasında farklılıklar olabileceğinin farkındayız. Bu nedenle, deneyin doğru bir şekilde çoğaltılmasını sağlamak için tüm protokolleri dahil ettik.<ol><li>pH 6'ya ulaşana kadar ~150 mL 1 M K 2 HPO 4 ila 500 mL 1 M KH2PO4 çözeltisi ekleyerek 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6 yapın. Tamponu 0,22 μm vakum filtresi/depolama sisteminden geçirerek sterilize edin.</li>
		<li>0.1 M kalsiyum klorür (CaCl 2) ve magnezyum sülfat (MgSO4) yapın ve bunları0.2 μm şırınga filtresi ile sterilize edin.</li>
		<li>Mutlak etanol içinde 5 mg / mL kolesterol hazırlayın. NOT: Kolesterol etanol içinde hazırlandığından, filtrelemeyin.</li>
		<li>1.5 g sodyum klorür (NaCl), 1.25 g pepton ve 8.5 g agar'ı 500 mL çift damıtılmış suda (DDW) çözerek NGM-agar'ı hazırlayın. Otoklavlayın ve ~ 55 ° C'ye soğumaya bırakın.</li>
		<li>Steril koşullar altında, 12.5 mL potasyum fosfat tamponu (pH 6), 0.5 mL 0.1 M CaCl2, 0.5 mL 0.1 M MgSO4 ve 1 mL 5 mg / mL kolesterol ekleyin. Her eklemeden sonra iyice karıştırın.</li>
		<li>Her 35 mm'lik plakaya erimiş NGM-agar'dan 4 mL ekleyin. Bulaşıkları oda sıcaklığında (RT, ~ 21 ° C) katılaşması için gece boyunca bırakın.</li>
		<li>Luria-Bertani (LB) agar plakaları yapmak için, 5 g NaCl, 5 g tripton, 2.5 g maya ekstraktı ve 7.5 g agar'ı 400 mL damıtılmış, deiyonize su (DDW) içinde çözün, çözeltinin pH'ını 7.0'a ayarlayın, hacmi DDW ile 500 mL'ye çıkarın ve otoklavlayın. Çözelti 55 ° C'ye soğutulduktan sonra, her 90 mm Petri kabına 25 mL karışım dökün ve plakaların oda sıcaklığında 2 gün kurumasını bekleyin. Daha sonra, gliserol stoğundan kurutulmuş LB plakaları üzerindeki OP50 bakterilerini çizin ve tek koloniler elde etmek için gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>8 g tripton, 5 g maya ekstraktı ve 2.5 g sodyum klorürü (NaCl) 0.5 L DDW'de çözerek 2x maya tripton (YT) hazırlayın. PH'ı 7'ye ayarlayın ve otoklavlayın.</li>
		<li>Soğuduktan sonra, yeni çizgilenmiş LB plakasından bir OP50 bakteri kolonisini, 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde 50 mL 2x YT ortamına aşılayın. 37 °C ve 250 rpm'de yaklaşık 0,6 optik yoğunluğa (OD600) çalkalayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Araç ve deney plakalarının hazırlanması<ol><li>Her 35 mm NGM-agar plakasının merkezine 100 μL OP50 bakterisi ekleyin. Gece boyunca RT'de kurutun (oda sıcaklığı, 21 °C).</li>
		<li>DMSO'da 0,5 M VL-850 hazırlayın ve M9 tamponu kullanarak 10 mM VL-850'ye seyreltin (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7ve 1 mM MgSO 4)26. PH'ın 7,0 olduğunu onaylayın (değilse, 0,1 M HCl ile titre edin) ve çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtresiyle filtreleyin-sterilize edin. Aracı yukarıda açıklandığı gibi, ancak ilaç olmadan hazırlayın (bu durumda, VL-850). DMSO'da 50 mM FCCP yapın, M9 tamponu ile 1 mM FCCP'ye seyreltin ve çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtresiyle filtreleyin-sterilize edin.</li>
		<li>Bakteri çimleri üzerinde ayrı ayrı tohumlanmış NGM plakalarına 25 μL araç (negatif kontrol), FCCP (pozitif kontrol; 5 μM) veya VL-850 (deneysel işlem; 62,5 μM) ekleyin.</li>
		<li>Plakaları alüminyum folyo ile örtün ve RT'de kurumaya bırakın (oda sıcaklığı, 21 °C). Plakaları ~ 16 saat sonra kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Senkronize genç yetişkin C. elegans hermafroditlerinin elde edilmesi<ol><li>22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 ve 86 mM NaCl ile 1 L M9 tampon yapın. Otoklavlayarak sterilize edin ve soğumaya bırakın. Soğutulduktan sonra, 1 mL 1 mM MgSO4 (0,22 μm filtre sterilize edilmiş) ekleyin.</li>
		<li>4 mL'lik bir alkali hipoklorit çözeltisi (sodyum hidroksit için 0,5 N'lik nihai konsantrasyon ve sodyum hipoklorit için %1,25'lik nihai konsantrasyon) oluşturmak için 0,8 mL'lik 2,5 N sodyum hidroksit ve 1 mL% 5'lik bir sodyum hipoklorit çözeltisini 2,2 mL DDW ile karıştırın.</li>
		<li>Tüm annelerin tüpe toplandığından emin olmak için NGM plakalarını 1 mL M9 tampon 3x ile yıkayarak solucanları (gravid hermafroditler) 15 mL konik bir tüpe toplayın.</li>
		<li>Solucanları 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile tortulayın ve süpernatantı 1 mL'lik bir hacim kalana kadar atın.</li>
		<li>1 mL alkali hipoklorit çözeltisi ekleyin ve tüpü 5x ters çevirerek karıştırın. Yumurtaların salınmasına yardımcı olmak için tüpü 3 dakika boyunca hafifçe vorteksleyin ve disseke edici bir stereoskop altında solucanların durumunu gözlemleyin.</li>
		<li>Solucanların yaklaşık% 50'si kırıldığında, 5 mL M9 tamponu ekleyin ve 500 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj yaparak yumurtaları hemen çökeltin.</li>
		<li>Peletleri rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın. 5 mL M9 tampon ekleyin ve yıkama prosedürünü 2 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Süpernatantı 2 mL kalana kadar çıkarın ve senkronize L1 larvaları elde etmek için tüpü ~ 16 saat (RT, 21 ° C) boyunca 20 rpm'de döndürün (360 ° rotasyon). Bu tüpten, bir cam slayt üzerine 5 μL'lik bir damla alın, bir stereoskop altında larva sayısını sayın, bu adımı 3x tekrarlayın, üç sayının ortalamasını alın ve mikrolitre başına solucan sayısını tahmin edin (μL). Bu hesaplamalara dayanarak, OP50 bakterileri ile tohumlanmış NGM plakası başına ~ 200 larva ekleyin.</li>
		<li>L1 larvalarını genç yetişkin aşamasına kadar ~ 48 saat boyunca 21 ° C'de büyütün.</li>
	</ol></li>
	<li>İlaç tedavisi ve mikroskopi prosedürü<ol><li>Deney veya kontrol plakalarının her birine 100 solucan koyun. Negatif, pozitif ve deneysel plakaların aracı, sırasıyla 5 μM FCCP ve 62,5 μM VL-850'yi içerdiğinden emin olun. 6 saat boyunca 21 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Solucanları her plakadan 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için 1 mL M9 tamponu kullanın. Tüpü bir mini santrifüjde kısaca (~ 3 s) döndürün. Ardından, solucan topağını rahatsız etmeden M9 tamponunu yavaşça pipetleyerek süpernatantı atın. Bu yıkama adımını 2x tekrarlayın ve ardından solucan topağını rahatsız etmeden süpernatantı yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Solucan topağına %0,1 v/v Poloxamer 188, %0,1 v/v Pluronic F127 ve 2 μL boyama kiti reaktifi içeren 200 μL M9 tamponu ekleyin. Karışımın RT'de (oda sıcaklığı, 21 ° C) 1 saat boyunca 20 rpm'de (360 ° dönüş) dönmesine izin verin. Boyaları ışıktan korumak için, tüpleri alüminyum folyo ile örtün.</li>
		<li>Solucanları adım 1.3.4'te açıklandığı gibi yavaşça döndürün. Ardından, solucan topağını rahatsız etmeden boyama çözeltisini çıkarın. Daha sonra, solucanları adım 1.3.2'de açıklandığı gibi yıkayın ve uygun tedaviyi içeren tohumlu bir NGM-agar plakasına aktarın - örneğin, FCCP ile muamele edilmiş solucanlar FCCP içeren bir plakaya aktarılır. Plakaları alüminyum folyo ile örtün, çünkü boyama reaktifi ışığa duyarlıdır. NOT: Aşırı boya nedeniyle arka plan gürültüsünü en aza indirmek için solucanları bakteri içeren kültür plakalarına ve ilgili arıtma maddesine aktardık. Örneğin, FCCP ile muamele edilen solucanlar, FCCP takviyeli plakalara vb. Aktarıldı.</li>
		<li>Solucanları plakalardan 1 mL M9 tampon kullanarak taze mikrosantrifüj tüplerine yıkayın; Solucanları aynı şekilde 2x yıkayın. Daha sonra, solucanları 30 dakika boyunca buz üzerinde% 1 formaldehit ile sabitleyin ve artık formaldehiti gidermek için solucanları 1 mL M9 tampon 3x ile yıkayın. Yıkamalardan sonra, solucanları bir pelet haline getirin ve solucan peletini 10 μL M9'da bozulmadan tutarak maksimum miktarda süpernatan aspire edin.</li>
		<li>% 2.5 agaroz hazırlamak için, 10 mL'lik bir borosilikat cam test tüpüne 0.125 g agaroz ağırlığında, 5 mL M9 tamponu ekleyin ve tüpü bir Bunsen brülörü ile hafifçe ısıtarak agarozu çözün. Erimiş agarozu 75 ° C'de ayarlanmış kuru bir banyoya aktarın ve 1 mL'lik bir uç kullanarak, erimiş agarozun 100 μL'sini bir Deckgläser mikroskop kapak camına (24 mm x 60 mm) koyun. Hemen, agaroz damlasına dik olarak başka bir slayt koyun ve çapraz bir şekil oluşturun. ~ 2 dakika bekleyin ve üst kapak camını (nazikçe) iterek slaytları yavaşça ayırın, böylece agaroz pedini alt kapak slaytında bırakın. NOT: Tüpteki agarozu ısıtırken dikkatli olun ve tüpün vücuttan uzak tutulduğundan emin olun. Agarozun pıhtılaşmasını en aza indirmek için 1 mL ucun kenarını kesin.</li>
		<li>Solucanları bir Pasteur cam pipet ile agaroz pedine aktarın (yani, tüpteki tüm miktar, ~ 10 μL). Fazla sıvıyı laboratuarda mendilden yapılmış bir fitille çıkarın ve ardından solucanları daha küçük bir kapak sürgüsü (24 mm x 40 mm) ile örtün. Buharlaşmayı önlemek için küçük kapak sürgüsünün çevresine şeffaf oje sürün. Slaytı ışıktan korumak için karanlık bir kutuya koyun.</li>
		<li>60x büyütme lensi kullanarak solucanları 24 saat içinde uygun dalga boylarında (aşağıya bakınız) görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın.<ol><li>Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
			<li>Görüntüleme yazılımını açın ve yazılımın gri alanına sağ tıklayın. Açık Satın Alma | Ti2 Tam Yüzey Takımı | ND Satın Alma | LUT'lar açılır penceredeki seçeneklere tıklayarak sağ tıklama sonucunda ortaya çıkar.</li>
			<li>Ti2 Full Pad altında 60x'i seçin.</li>
			<li>Edinme altında, Göz Merceği DIA'yı seçin ve mikroskop ince odaklı düğmeyi kullanarak solucanları odak noktasına getirin. Alma altında, Dönen disk'i seçin ve 16 bit - Bağlama yok seçeneğini belirleyin. Her floresan filtresi için Pozlama Süresi'ni 500 ms ve Brightfield için 20 ms olarak ayarlayın. Bu parametreler ayarlandıktan sonra Şimdi Çalıştır'ı seçin ve çıktı görüntüsünün ND2 dosyası olarak oluşturulmasını bekleyin. NOT: Farklı görüntüleme kurulumları farklı özelliklere sahip olduğundan pozlama süresinin deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Her dalga boyunun floresan yoğunluğunu incelemek için arama tablolarını (LUT) kullanın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü analizi<ol><li>Konfokal görüntüleri (burada, Nikon ND2 dosyaları) birlikte yerelleştirme eklentisiyle ImageJ27'de açın. Her ND dosyası üç dalga boyunda (DAPI, GFP/FITC [yeşil] ve Texas Red [kırmızı] filtreleri kullanılarak) ve görünür ışıkta çekilen görüntü düzlemlerini içerir. Bu görüntülere erişmek için, ND dosyasını ImageJ sunucusunda açın ve iletişim kutusunda Görüntüleri Böl'ü seçin. Parlak alan (BF), yeşil kanal ve kırmızı kanal görüntüleriyle çalışın.</li>
		<li>Resim | Shift + D klavye kısayolunu çoğaltın veya kullanın.</li>
		<li>Arka planı azaltmak için, yukarıda belirtildiği gibi görüntünün başka bir kopyasını oluşturun. Arka planı 100'lük bir Yuvarlanma Yarıçapı ile çıkarın ve verilen görüntünün arka planına sahip bir görüntü oluşturmak için Arka Plan Oluştur (çıkarmayın) seçeneğini belirleyin. Ardından, İşlem | Görüntü Hesaplayıcı'yı seçin ve çoğaltılan ilk görüntüyü ikinci çoğaltılan görüntüden çıkarın. Kolokalizasyon analizi için elde edilen görüntüleri kullanın.</li>
		<li>Birlikte yerelleştirme eklentisini kullanmak için yeşil kanal ve kırmızı kanal görüntülerini 8 bit'e dönüştürün. Bunu yapmak için, Resim | Türü | 8 bit.</li>
		<li>Eklentilere tıklayın | Eşlokalizasyon. Kolokalizasyon eklentisini kullanarak mitokondri ve lizozom sinyallerinin kolokalizasyonunu ölçmek için (yukarıya bakın), aşağıdaki parametreleri kullanın: Oran =% 75, Eşik kırmızı kanal = 80.0, Eşik yeşil kanal = 50.0. Çıktı, bir RGB görüntüsünde birlikte yerelleştirilmiş puncta ve üç 8 bit görüntünün (yeşil, kırmızı ve birlikte yerelleştirilmiş görüntü) birleşimini içeren 8 bitlik bir ikili görüntüdür.</li>
		<li>Solucanların kafa, vücut-duvar kasındaki punktaya odaklanarak bu alanı manuel olarak seçin ve Düzenle'ye tıklayarak bir maske oluşturun | Seçim | İlgilenilen bölgeyi seçen Maske oluşturun (Şekil 2A, B). Baş vücut duvarı kas bölgesini analiz etmek için diğer lekeli varlıkları (örneğin, faringeal kaslar) seçici olarak çıkarın.</li>
		<li>İlgilenilen bölgedeki (ROI) parçacıkları seçmek için, birlikte yerelleştirilmiş 8 bit'i seçin ve görüntü hesaplayıcısını kullanarak görüntüleri maskeleyin . Ardından, YG'deki puncta'yı seçmek için AND işlemini (Şekil 3A) kullanın. Bu, YG'de puncta içeren bir görüntü oluşturur (Şekil 3B).</li>
		<li>Kolokalize mitokondri ve lizozomların alanını analiz etmek için Analiz | Parçacıkları analiz edin ve punktanın toplamının 0.1625 μm 2 ile 4 μm2 arasındaki toplamını ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hep-3B kanser hücresi protokolü
<ol><li>İlaç stok çözeltisinin hazırlanması<ol><li>DMSO'da 100 mM VL-850 hazırlayın. 0,5 M HEPES tamponu, pH 7,3 ile 5 mM'ye kadar seyreltin ve 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak çözeltiyi sterilize edin. Ardından, aracı daha önce açıklandığı gibi, ancak ilaç olmadan (bu durumda, VL-850) hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Deney, ilaç tedavisi ve mikroskopi prosedürü için Hep-3B hücrelerinin kültürlenmesi<ol><li>%10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), %2 L-glutamin ve %1 tetrasiklin (bundan böyle tam DMEM olarak anılacaktır) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren 10 cm'lik doku kültürü plakalarında Hep-3B hücrelerini büyütün. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
		<li>% 70 -% 80 hücre akıcılığı (logaritmik büyüme fazı) gösteren bir Hep-3B hücresi plakası seçin, ortamı çıkarın ve plakayı 5 mL önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de ~ 3 dakika boyunca 1 mL önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin /% 0.02 EDTA ile inkübe edin; Hücreleri doku kültürü mikroskobu altında gözlemleyin (10x). Hücreler yuvarlandığında tripsin sindirimini durdurun ve 5 mL tam DMEM ekleyerek plakadan ayrılmaya başlayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 5 mL tam DMEM'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücre konsantrasyonunu belirleyin. 50 μL hücre süspansiyonunu 50 μL tripan mavisi ile karıştırın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak veya bir hemositometre 5x kullanarak hücreleri sayın ve sayımların doğruluğunu sağlamak için bu sayımların ortalamasını alın.</li>
		<li>Her 8 kuyucuklu μ slaytta 42.000 Hep3G hücresini 400 μL tam DMEM içinde tohumlayın (yukarıda açıklandığı gibi). Hücreleri 37 ° C'de 24 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
		<li>~% 80 -% 85 akıcılıkta 24 saat sonra, kuyucukların her birinden 250 μL ortamı çıkarın ve uygun işlem veya araçla 50 μL ortam ekleyin. Bu protokolü takip etmek için, hücrelere 100 μM VL-850, 5 μM FCCP ve bir kontrol aracı uygulayın.</li>
		<li>Bileşiklerle 6 saatlik inkübasyondan sonra, boyama reaktifini içeren her bir kuyucuğa 50 μL orta ekleyin (her bir kuyucukta 250 μL için 0.5 μL boya). Hücreleri boya ile 37 ° C'de 30 dakika ve% 5 CO2'de inkübe edin. NOT: Boyama reaktifi ışığa duyarlı olduğundan, numuneleri alüminyum folyo ile kaplayarak ve loş ışıklı bir ortamda (mümkünse) çalışarak ışığa maruz kalmayı en aza indirin.</li>
		<li>200 μL'lik bir pipet kullanarak, her bir oyuktan tüm ortamı (250 μL) yavaşça çıkarın ve ardından hücreleri 200 μL önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri, PBS'de RT'de 15 dakika boyunca hazırlanan% 4 formaldehit ve% 2.5 glutaraldehit içeren 200 μL sabitleme çözeltisi ile sabitleyin.</li>
		<li>Fiksatif çözeltiyi boşaltın ve 200 μL PBS ile kısaca yıkayın.</li>
		<li>200 μL PBS ekleyin, hücreleri 4 ° C'de kapalı ve ışıktan koruyun ve 24 saat içinde görüntü alın. NOT: Dönen diskli konfokal mikroskobu, adım 1.4.8'de olduğu gibi DIC, TRITC, FITC ve DAPI dahil olmak üzere dört kanalda kullandık. Tedavi başına ~ 300 hücre görüntüledik.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü analizi<ol><li>1.5.1-1.5.5 adımlarını gerçekleştirin. Hücrelerin YG'sini elde etmek için, hücrelerin alanını vurgulayan bir görüntü oluşturun. Bunun için bir eş yerelleştirilmiş noktalar (RGB) görüntüsü seçin (Şekil 4A). Hücre alanının tamamını seçmek için İşlem | İkili | İkili görüntü elde etmek için Maske oluşturun (Şekil 4B). Hücrenin alanını analiz etmek için Analiz | Parçacıkları analiz edin ve görüntüdeki tüm parçacıkları Parçacıkları Analiz Et için varsayılan ayar olan 0'dan sonsuzluğa kadar ölçün.</li>
		<li>Kolokalize mitokondri ve lizozomların alanını analiz etmek için, kolokalize 8 bitlik bir görüntü seçin, İşlem Seç'i seçerek bunu ikiliye dönüştürün | İkili | İkili Yap, Analiz Et'i seçin | Parçacıkları analiz edin ve 0.1625 μm 2 ile 4 μm 2 arasındaki punkta toplamını ölçün. Kolokalize punktayı ölçmek için, kolokalize mitokondri ve lizozomların alanını toplam hücre alanına bölün.</li>
	</ol></li>
</ol>

Mitofajinin Ölçülmesi C. elegans ve Karaciğer Kanseri Hücre Hattı

<ol>
	<li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machinery+of+mitochondrial+fusion+and+fission.">Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).</li><li>Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+heme+metabolon:+Insights+into+the+complex(ity)+of+heme+synthesis+and+distribution.">The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).</li><li>Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+and+physiology+of+mitochondrial+fatty+acid+&#946;-oxidation+and+its+genetic+disorders.">The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid &#946;-oxidation and its genetic disorders.</a> Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2,+a+mitochondria-ER+tethering+protein,+facilitates+osteoclastogenesis+by+regulating+the+calcium-calcineurin-NFATc1+axis.">Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).</li><li>Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+capacity+regulates+iron+homeostasis+in+endothelial+cells.">Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells.</a> Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).</li><li>Armstrong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+medicine:+Pharmacological+targeting+of+mitochondria+in+disease.">Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease.</a> British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).</li><li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+homeostasis:+The+interplay+between+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis.">Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis.</a> Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).</li><li>Bhujabal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP8+recruits+LC3A+to+mediate+Parkin-independent+mitophagy.">FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).</li><li>Martinez-Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mitophagy+in+neurodegenerative+diseases.">Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).</li><li>Zimmermann, M., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+get+rid+of+mitochondria:+Crosstalk+and+regulation+of+multiple+mitophagy+pathways.">How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways.</a> Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).</li><li>Almacellas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+ensures+accurate+chromosomal+segregation+to+prevent+chromosomal+instability.">Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability.</a> Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).</li><li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery.">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li><li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy.">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome+biology+in+autophagy.">Lysosome biology in autophagy.</a> Cell Discovery. 6, 6 (2020).</li><li>Katayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+modulating+mitophagy+for+therapeutic+studies+of+neurodegeneration.">Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration.</a> Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).</li><li>Shpilka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPR(mt)+scales+mitochondrial+network+expansion+with+protein+synthesis+via+mitochondrial+import+in+Caenorhabditis+elegans.">UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 12, 479 (2021).</li><li>Liao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degradation+of+TMEM166+by+autophagy+promotes+AMPK+activation+to+protect+SH-SY5Y+cells+exposed+to+MPP().">The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP().</a> Cells. 11 (17), 2706 (2022).</li><li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+designer+diamines+promote+mitophagy,+and+thereby+enhance+healthspan+in+C.+elegans+and+protect+human+cells+against+oxidative+damage.">Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage.</a> Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).</li><li>Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacological+regulation+of+cellular+mitophagy.">The pharmacological regulation of cellular mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocellular+carcinoma+cell+lines+secrete+the+major+plasma+proteins+and+hepatitis+B+surface+antigen.">Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen.</a> Science. 209 (4455), 497-499 (1980).</li><li>Ant&#243;n, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Atg8-cardiolipin+interactions+in+mitophagy:+Specific+properties+of+LC3B,+GABARAPL2+and+GABARAP.">Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP.</a> Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).</li></ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Çoklu mitopaji yolları çeşitli proteinleri ve biyomolekülleri içerir (örneğin, kardiyolipin29). Bununla birlikte, bu yolakların bitiş noktası benzerdir - mitokondrinin lizozomal enzimler tarafından parçalanması12,13. Gerçekten de, birkaç yöntem mitofajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Bununla birlikte, elektron mikroskobu gibi bazı yöntemler, pahalı ekipmanlara, eğitimli uzmanlara ve numuneler ve analizler ...

Mitokondri, insanlar da dahil olmak üzere tüm aerobik hayvanlar için gereklidir. Biyomoleküllerin kimyasal enerjisini oksidatif fosforilasyon1 yoluyla adenozin trifosfata (ATP) dönüştürürler, heme2'yi sentezlerler, yağ asitlerini β oksidasyon3 yoluyla parçalarlar, kalsiyum4 ve demir5 homeostazını düzenlerler, apoptoz6 ile hücre ölümünü kontrol ederler ve redoks homeostazında hayati bir rol oynayan reaktif oksijen türleri (ROS) üretirler7. İki tamamlayıcı ve zıt süreç, mitokondrinin bütünlüğünü ve uygun işlevini korur: yeni mitokondriyal bileşenlerin sentezi (biyogenez) ve mitokondriyal otofaji (yani mitofaji) yoluyla hasarlı olanların seçici olarak uzaklaştırılması)8.
Çeşitli mitopaji yolaklarına PINK1 / Parkin gibi enzimler ve FUNDC1, FKBP8 ve BNIP / NIX 9,10 dahil olmak üzere reseptörler aracılık eder. Özellikle, mitokondriyal bileşenlerin seçici bozunması, otofagozom makinesinden bağımsız olarak (yani, mitokondriyal kaynaklı veziküller yoluyla) meydana gelebilir11. Bununla birlikte, farklı seçici mitopaji yolaklarının bitiş noktaları benzerdir (yani, lizozomal enzimler tarafından mitokondriyal bozunma)12,13. Bu nedenle, mitofajiyi tanımlamak ve ölçmek için çeşitli yöntemler, mitokondriyal ve lizozomal belirteçlerin 14,15,16,17 ve mitokondriyal proteinlerin / mitokondriyal DNA18 seviyelerinin azalmasına dayanır.
Aşağıda, ftolaysız mikroskopi kullanarak hayvan hücrelerinde mitopajiyi ölçmek için mevcut deneysel metodolojilerin kısa bir açıklaması bulunmaktadır ve mitopaji bitiş noktası fazını vurgulamaktadır.
Mitopaji biyosensörleri Mitokondriyal bozunma, lizozom19'un asidik ortamında meydana gelir. Bu nedenle, proteinler de dahil olmak üzere mitokondriyal bileşenler, mitopaji işleminin son noktasında nötrden asidik bir pH'a geçiş yaşarlar. Bu model, mito-Rosella18 ve tandem mCherry-GFP-FIS114 dahil olmak üzere çeşitli mitopaji biyosensörlerinin etki mekanizmasını desteklemektedir. Bu sensörler pH'a duyarlı yeşil floresan proteini (GFP) ve pH'a duyarsız kırmızı floresan proteini (RFP) içerir. Bu nedenle, mitopajinin son noktasında, GFP floroforun söndürülmesi nedeniyle yeşil-kırmızı floresan oranı önemli ölçüde düşer. Bu sensörlerin başlıca sınırlamaları şunlardır: (1) floroforlar arasında olası Förster rezonans enerji transferi (FRET); (2) GFP ve RFP'nin diferansiyel olgunlaşma hızı; (3) GFP ve RFP arasında, onları birbirine bağlayan polipeptitin proteolitik bölünmesi nedeniyle ayrışma; (4) floresan-emisyon çakışması; ve (5) diferansiyel florofor parlaklığı ve söndürme15,16.
Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelen bir sensör, Keima mitokondriyal sensör17'dir. mt-Keima sensörü (mercan proteini Keima'dan türetilmiştir) tek bir emisyon zirvesi (620 nm) gösterir. Bununla birlikte, uyarma zirveleri pH'a duyarlıdır. Sonuç olarak, yüksek bir pH'tan asidik bir pH 16,17'ye geçerken yeşil bir uyarmadan (440 nm) kırmızı olana (586 nm) bir geçiş vardır. Daha yeni bir mitopaji sensörü olan Mito-SRAI, sabit biyolojik örneklerde ölçümlere izin vererek alanı ilerletmiştir20. Bununla birlikte, genetik sensörlerin, onları belirli dokularda / hücrelerde ifade etme ve bunları farklı mitokondriyal bölmelere hedefleme yeteneği gibi birçok avantajına rağmen, sınırlamaları da vardır. Bir sınırlama, genetik sensörlerin hücrelerde veya hayvanlarda ifade edilmesi gerektiğidir, bu da zaman alıcı ve kaynak yoğun olabilir.
Ek olarak, sensörlerin mitokondri içindeki ekspresyonu, mitokondriyal fonksiyonu etkileyebilir. Örneğin, C. elegans solucanı vücut duvarı kaslarında mitokondriyal GFP'nin (mtGFP) eksprese edilmesi, mitokondriyal ağıgenişletir 21. Bu fenotip, mitokondride (UPRmt)21'de katlanmamış protein yanıtının aktivasyonunda önemli bir rol oynayan stresle aktive edilmiş transkripsiyon faktörü ATFS-1'in işlevine bağlıdır. Bu nedenle, genetik olarak kodlanmış mitokondri / mitopaji biyosensörleri, mitokondri homeostazını in vivo olarak izlemek için son derece yararlı olsa da, ölçmek için tasarlandıkları süreci etkileyebilirler.
Mitokondri/lizozom spesifik antikorlar ve boyalar Mitokondriyal / lizozom kolokalizasyonunu test etmek için bir başka strateji, mitokondriyal dış membran proteini TOM20 ve lizozomal ilişkili membran proteini 1 (LAMP1) 22 gibi mitokondriyal / lizozomal proteinlere karşı antikorlar kullanmaktır. Çoğu durumda, bir florofora konjuge edilen ikincil antikorlar, floresan sinyalini mikroskopi yoluyla tespit etmek için kullanılır. Diğer bir strateji, genetik yapıları mitokondriyal/lizozomal boyalarla birleştirmektir, örneğin hücrelerde bir LAMP1::GFP füzyon yapısını eksprese ederken, kırmızı mitokondriyal boya (örneğin, Mitotracker Red) ile boyamaktır16. Bu metodolojiler, etkili olsa da, spesifik antikorlar gerektirir ve genellikle sabit örneklerle çalışmayı veya floresan olarak etiketlenmiş mitokondri / lizozomları ifade eden hücreler / transgenik hayvanlar üretmeyi içerir.
Burada, bundan böyle VL-85023 olarak anılacak olan sentetik diamin O,O (oktan-1,8-diil)bis'in (hidroksilamin) mitopaji aktive edici özelliklerini değerlendirmek için ticari bir lizozom / mitokondri / nükleer boyama kitinin kullanımını C . elegans solucanlarında ve insan kanser hücre hattı Hep-3B'de özetliyoruz (Şekil 1). Boyama kiti, özellikle bu organelleri boyayan lizozomal / mitokondriyal / nükleer hedefli boyaların bir karışımını içerir23. Bu kiti daha önce C. elegans23'te 1,8 diaminooktan (bundan böyle VL-004 olarak anılacaktır) mitopaji aktivitesini göstermek için kullandık. Daha da önemlisi, boyama kiti sonuçlarını mito-Rosella biyosensörü ve mitokondriyal: nükleer DNA içeriği23'ün qPCR ölçümleri ile doğruladık. Bu boyama kiti aşağıdaki avantajları sunar. İlk olarak, bir mitokondriyal biyosensörü ifade eden transgenik hayvanlar veya hücreler üretmeye gerek yoktur. Bu nedenle, değiştirilmemiş vahşi tip hayvanları veya hücreleri inceleyebilir ve böylece çok fazla zaman, para ve emek tasarrufu sağlayabiliriz. Ayrıca, belirtildiği gibi, mitokondriyal biyosensörlerin eksprese edilmesi mitokondriyal fonksiyonu değiştirebilir. İkincisi, kit uygun maliyetli, kullanımı kolay ve hızlıdır. Üçüncüsü, yöntemi C. elegans ve insan hücrelerinde göstermemize rağmen, diğer hücre tipleri ve organizmalar için değiştirilebilir.
Bununla birlikte, herhangi bir yöntem gibi, boyama kiti protokolünün de dezavantajları vardır. Örneğin, solucanların reaktif ile inkübasyonu, gıda yokluğunda gerçekleştirilir (ölü bakterilerin bile boyama verimliliğini önemli ölçüde azalttığını gördük). Kuluçka süresi nispeten kısa olmasına rağmen, bu zaman diliminde bile, mitopaji de dahil olmak üzere homeostatik tepkilerin değişmesi mümkündür. Ek olarak, boyaların ER / mitokondriyal / nükleer proteinlere ve diğer biyomoleküllere bağlanması bu organellerin aktivitelerini etkileyebilir. Dahası, genetik sensörlerle mitofaji ölçümünün aksine, kimyasal fiksasyona uğramış solucanlar ve hücrelerle çalışıyoruz. Bu nedenle, aynı solucanları / hücreleri farklı zamanlarda izlemeye devam etmek imkansızdır. Bu nedenle, belirli bir fizyolojik süreçte mitopajinin işlevini doğrulamak için farklı metodolojileri birleştirmenizi öneririz. Aşağıda, VL-850'nin C. elegans solucanlarında ve Hep-3B hücrelerinde sağlam mitofajiyi indüklediğini gösteren yeni veriler sunuyoruz. Bu nedenle, bu veriler VL-850'nin C. elegans'ın ömrünü uzattığı ve C. elegans'ı sağlıklı mitofajinin indüksiyonu yoluyla oksidatif hasardan koruduğu hipotezini daha da desteklemektedir. Proton iyonofor karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), güçlü bir mitofaji indükleyicisi24 olan pozitif bir kontrol olarak kullandık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent or resource</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD-Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD-Difco</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD-Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C/5360/48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water (DDW)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS heat inactivated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteradehyde (25%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer 1 M</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-gluatamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab139487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformalydehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 188 Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>1310732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dodecahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VL-850: 1,8-diaminooxy-octane</td>
			<td>Patented</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/Plastic Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Millex GV</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LMCT1.7B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LTB15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9015810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500&#160;mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LG-FPE205500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Lifegene</td>
			<td>LTB50-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser Microscope cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>101152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>99445-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBiDi 8 well &#956;-slides</td>
			<td>iBiDi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24 x 40 mm</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN1052421ECALN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium 0.25 mM wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PT1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter CellDrop BF</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>CellDrop BF-UNLTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV-2400</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZ61 stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>MT30019032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolver Adjustable Lab Rotator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mitophagy in caenorhabditis elegans and mammalian cells using organelle-specific dyes

Mitokondri, enerji üretimi, lipid metabolizması, kalsiyum homeostazı, heme biyosentezi, düzenlenmiş hücre ölümü ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik fonksiyonlar için gereklidir. ROS, anahtar biyolojik süreçler için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, kontrolsüz olduklarında, mitokondriyal hasar da dahil olmak üzere oksidatif hasara yol açabilirler. Hasarlı mitokondri daha fazla ROS salgılar, böylece hücresel hasarı ve hastalık durumunu yoğunlaştırır. Mitokondriyal otofaji (mitopaji) adı verilen homeostatik bir süreç, hasarlı mitokondrileri seçici olarak ortadan kaldırır ve daha sonra yenileriyle değiştirilir. Birden fazla mitopaji yolu vardır, ortak son nokta lizozomlardaki hasarlı mitokondrinin parçalanmasıdır. 
Genetik sensörler, antikor immünofloresansı ve elektron mikroskobu dahil olmak üzere çeşitli metodolojiler, mitopajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Mitopajiyi incelemek için kullanılan her yöntemin, spesifik doku / hücre hedefleme (genetik sensörlerle) ve büyük ayrıntı (elektron mikroskobu ile) gibi avantajları vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle pahalı kaynaklar, eğitimli personel ve transgenik hayvanlar oluşturmak gibi gerçek deneyden önce uzun bir hazırlık süresi gerektirir. Burada, mitokondri ve lizozomları hedef alan ticari olarak temin edilebilen floresan boyaları kullanarak mitofajiyi ölçmek için uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. Bu yöntem, nematod Caenorhabditis elegans ve insan karaciğer hücrelerindeki mitopajiyi etkili bir şekilde ölçer ve bu da diğer model sistemlerdeki potansiyel verimliliğini gösterir.

Mitochondria are essential for all aerobic animals, including humans. They convert the chemical energy of biomolecules to adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation1, synthesize heme2, degrade fatty acids through &#946; oxidation3, regulate calcium4 and iron5 homeostasis, control cell death by apoptosis6, and generate reactive oxygen species (ROS), which play a vital role in redox homeostasis7. Two complementary and opposite processes maintain the integrity and proper function of the mitochondria: the synthesis of new mitochondrial components (biogenesis) and the selective removal of damaged ones through mitochondrial autophagy (i.e., mitophagy)8.
Several mitophagy pathways are mediated by enzymes, such as PINK1/Parkin, and receptors, including FUNDC1, FKBP8, and BNIP/NIX9,10. Notably, the selective degradation of mitochondrial components can occur independently of the autophagosome machinery (i.e., through mitochondrial-derived vesicles)11. However, the endpoints of the different selective mitophagy pathways are similar&#160;(i.e.,mitochondrial degradation by lysosomal enzymes)12,13. For this reason, various methods for identifying and measuring mitophagy rely on the colocalization of mitochondrial and lysosomal markers14,15,16,17 and decreased levels of mitochondrial proteins/mitochondrial DNA18.
Below is a concise description of the existing experimental methodologies for measuring mitophagy in animal cells using fluorescence microscopy, emphasizing the mitophagy endpoint phase.
Mitophagy biosensors 
Mitochondrial degradation occurs within the acidic environment of the lysosome19. Therefore, mitochondrial components, including proteins, experience a shift from a neutral to an acidic pH at the endpoint of the mitophagy process. This pattern underpins the mechanism of action of several mitophagy biosensors, including mito-Rosella18 and tandem mCherry-GFP-FIS114. These sensors contain a pH-sensitive green fluorescence protein (GFP) and a pH-insensitive red fluorescence protein (RFP). Therefore, at the endpoint of mitophagy, the green-to-red fluorescence ratio drops significantly due to the quenching of the GFP fluorophore. The major limitations of these sensors are (1) possible F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between the fluorophores; (2) the differential maturation rate of GFP and RFP; (3) dissociation between the GFP and RFP due to proteolytic cleavage of the polypeptide that connects them; (4) fluorescence-emission overlap; and (5) differential fluorophore brightness and quenching15,16.
A sensor that overcomes some of these limitations is the Keima mitochondrial sensor17. The mt-Keima sensor (derived from the coral protein Keima) displays a single emission peak (620 nm). However, its excitation peaks are pH-sensitive. As a result, there is a transition from a green excitation (440 nm) to a red one (586 nm) when shifting from a high pH to an acidic pH16,17. A more recent mitophagy sensor, Mito-SRAI, has advanced the field by allowing for measurements in fixed biological samples20. However, despite the many advantages of genetic sensors, such as the ability to express them in specific tissues/cells and target them to distinct mitochondrial compartments, they also have limitations. One limitation is that the genetic sensors need to be expressed in cells or animals, which can be time-consuming and resource-intensive.
Additionally, the expression of the sensors within mitochondria themselves may influence the mitochondrial function. For example, expressing mitochondrial GFP (mtGFP) in the C. elegans worm body wall muscles expands the mitochondrial network21. This phenotype depends on the function of the stress-activated transcription factor ATFS-1, which plays an essential role in the activation of unfolded protein response in mitochondria (UPRmt)21. Therefore, although genetically encoded mitochondria/mitophagy biosensors are extremely useful for monitoring mitochondria homeostasis in vivo, they may affect the very process they are designed to measure.
Mitochondria/lysosome-specific antibodies and dyes 
Another strategy for testing mitochondrial/lysosome colocalization is to use antibodies against mitochondrial/lysosomal proteins, such as the mitochondrial outer membrane protein TOM20 and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)22. In most cases, secondary antibodies that are conjugated to a fluorophore are used to detect the fluorescence signal via microscopy. Another strategy is to combine genetic constructs with mitochondrial/lysosomal dyes, such as expressing a LAMP1::GFP fusion construct in cells while staining them with a red mitochondrial dye (e.g., Mitotracker Red)16. These methodologies, while effective, require specific antibodies and often involve working with fixed specimens or generating cells/transgenic animals expressing fluorescently labeled mitochondria/lysosomes.
Here, we outline the utilization of a commercial lysosome/mitochondria/nuclear staining kit for assessing the mitophagy-activating properties of synthetic diamine O,O (octane-1,8-diyl)bis(hydroxylamine), hereafter referred to as VL-85023, in C. elegans worms and the human cancer cell line Hep-3B (Figure 1). The staining kit contains a mixture of lysosomal/mitochondrial/nuclear-targeted dyes that specifically stain these organelles23. We previously used this kit to demonstrate the mitophagy activity of 1,8 diaminooctane (hereafter referred to as VL-004) in C. elegans23. Importantly, we validated the staining kit results with the mito-Rosella biosensor and qPCR measurements of the mitochondrial:nuclear DNA content23. This staining kit offers the following advantages. First, there is no need to generate transgenic animals or cells expressing a mitochondrial biosensor. Therefore, we can study unmodified wild-type animals or cells and, thus, save much time, money, and labor. Moreover, as mentioned, expressing mitochondrial biosensors can change the mitochondrial function. Second, the kit is cost-effective, easy to use, and fast. Third, although we demonstrate the method in C. elegans and human cells, it could be modified for other cell types and organisms.
With that said, like any method, the staining kit protocol has drawbacks. For example, the incubation of the worms with the reagent is carried out in the absence of food (we have seen that even dead bacteria significantly decrease the staining efficiency). Although the incubation time is relatively short, it is possible that even in this time frame, homeostatic responses may be altered, including mitophagy. In addition, the binding of the dyes to the ER/mitochondrial/nuclear proteins and other biomolecules may affect the activities of these organelles. Moreover, unlike mitophagy measurement with genetic sensors, we work with worms and cells that have undergone chemical fixation. Therefore, it is impossible to continue monitoring the same worms/cells at different times. Hence, we recommend combining different methodologies to validate the function of mitophagy in a particular physiological process. Below, we present new data demonstrating that VL-850 induces robust mitophagy in C. elegans worms and Hep-3B cells. Therefore, these data further support the hypothesis that VL-850 extends the lifespan of C. elegans and protects C. elegans from oxidative damage through the induction of healthy mitophagy. We have used the proton ionophore carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), which is a potent mitophagy inducer24, as a positive control.

Yazar Gündemi: Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitofajinin Tespiti  

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Degradation of damaged mitochondria by mitophagy is essential for the function of the mitochondrial network. Unfortunately, this process declines with age. We develop and use drugs that activate mitophagy, thereby promoting healthy aging to understand the function of mitophagy in aging and age-related diseases, including Alzheimer's.One of the biggest challenges is to measure the mitophagy process without affecting it. Recent studies have shown that GFP expression in the mitochondria of muscle cells induces stress that is MT UPR. Therefore, using dyes in non-transgenic animals or cells is essential and complements genetic technologies.Our protocol has three main advantages. First, there is no need to generate transgenic animals or cells expressing mitophagy biosensors. Second, no need for expensive infrastructure and expertise such as in case of electron microscopy.And third, the organelle dye cocktail is commercially available and the protocol is simple and fast. The new mitophagy-activating compound VL-850 induces robust mitophagy, and in this way protects from oxidative stress and promote lifespan. Now the big question is to determine the underlying mechanism of action.We explored the mechanism at multiple levels, from the cellular to the organismal using C.elegans and mammalian cells.

VL-850 ile hem C. elegans solucanlarında hem de Hep-3B hücrelerinde sağlam bir mitopaji yanıtının indüklenmesi VL-850, C. elegans solucanlarını ve insan keratinositlerini (HaCaT hücreleri) oksidatif stresten korur23. Etki mekanizmasını daha fazla araştırmak için, VL-850'nin C. elegans ve diğer insan hücrelerinde mitopajiye neden olup olmadığını inceledik. Bunu test etmek için, C. elegans solucanlarını (genç yetişkinl...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes at JoVE.com

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

Hasarlı mitokondrinin mitopaji ile parçalanması, mitokondriyal ağın işlevi için esastır. Ne yazık ki, bu süreç yaşla birlikte azalır. Mitofajiyi aktive eden ilaçlar geliştiriyor ve kullanıyoruz, böylece Alzheimer da dahil olmak üzere yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklarda mitopajinin işlevini anlamak için sağlıklı yaşlanmayı teşvik ediyoruz.En büyük zorluklardan biri, mitofaji sürecini etkilemeden ölçmektir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kas hücrelerinin mitokondrilerindeki GFP ekspresyonunun MT UPR olan stresi indüklediğini göstermiştir. Bu nedenle, transgenik olmayan hayvanlarda veya hücrelerde boyaların kullanılması esastır ve genetik teknolojileri tamamlar.Protokolümüzün üç ana avantajı vardır. İlk olarak, mitopaji biyosensörlerini eksprese eden transgenik hayvanlar veya hücreler üretmeye gerek yoktur. İkincisi, elektron mikroskobu durumunda olduğu gibi pahalı altyapı ve uzmanlığa gerek yoktur.Üçüncüsü, organelle boya kokteyli ticari olarak temin edilebilir ve protokol basit ve hızlıdır. Yeni mitopaji aktive edici bileşik VL-850, sağlam mitofajiyi indükler ve bu şekilde oksidatif stresten korur ve ömrünü uzatır. Şimdi asıl soru, altta yatan eylem mekanizmasını belirlemektir.Mekanizmayı, C.elegans ve memeli hücrelerini kullanarak hücreselden organizmaya kadar birçok seviyede araştırdık.

detection-mitophagy-caenorhabditis-elegans-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

1.5K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. Hasarlı mitokondrinin mitopaji ile parçalanması, mitokondriyal ağın işlevi için esastır. Ne yazık ki, bu süreç yaşla birlikte azalır. Mitofajiyi aktive eden ilaçlar geliştiriyor ve kullanıyoruz, böylece Alzheimer da dahil olmak üzere yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklarda mitopajinin işlevini anlamak için sağlıklı yaşlanmayı teşvik ediyoruz.En büyük zorluklardan biri, mitofaji sürecini etkilemeden ölçmektir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kas h...

Video: Yazar Gündemi: Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitofajinin Tespiti  

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Biyoloji

Protocol for Measuring Mitophagy in Caenorhabditis elegans

Protocol for Measuring Mitophagy in Caenorhabditis elegans  

To begin, take the synchronized young adult C.Elegans hermaphrodites in a micro centrifuge tube. Add 200 microliters of M9 buffer, containing Poloxamer 188, Pluronic F127, and two microliters of the staining kit reagent to the worm pellet. Cover the tubes with aluminum foil to protect the dyes from light.Let the mixture rotate at 20 RPM for one hour at room temperature. Then spin the worms at 500 G for one minute. After that, remove the staining solution without disturbing the worm pellet.Wash the worms with M9 buffer thrice and transfer them into a seeded NGM agar plate containing the appropriate treatment. Wash the worms off the plates into fresh micro centrifuge tubes with one milliliter of M9 buffer. Afterward, fix the worms with 1%formaldehyde on ice for 30 minutes.And wash the worms with one milliliter of M9 buffer thrice to remove any residual formaldehyde. After pelleting the worms, aspirate the maximum amount of supernatant, keeping the pellet intact in 10 microliters of M9.Next, to prepare 2.5%agarose, weigh 0.125 grams of agarose into a 10 milliliter borosilicate glass test tube. Add five milliliters of M9 buffer and dissolve the agarose by gently heating the tube with a bunsen burner.Transfer the melted agarose to a dry bath set at 75 degrees Celsius. Add 100 microliters of the melted agarose onto a deck glosser microscope cover glass using a one milliliter tip. Immediately, put another slide perpendicularly on the agarose drop forming a cross shape.After two minutes, gently separate the slides by pushing the upper cover glass leaving the agarose pad on the bottom cover slide. Transfer the worms onto the agarose pad with a Pasteur glass pipette. Use a wick made of a laboratory wipe to remove excess liquid.Then cover the worms with a smaller cover slip and apply transparent nail polish to the periphery to prevent evaporation. Place the slide in a dark box to protect it from light. Use a confocal microscope to image the worms within 24 hours at the appropriate wavelengths using a 60 times magnification lens.Next, open the imaging software and right click on the gray area. From the popup that appears, select acquisition. Ti2 full pad.ND acquisition, and lookup tables. Under Ti2 full pad, select 60 times and adjust the microscope fine focus knob to bring the worms into focus. Then select spinning disc and choose the 16 bit-no binning option.For each fluorescence filter, set the exposure time to 500 milliseconds and 20 milliseconds for bright field. Once these parameters are set, select run now and wait for the output image to be generated as an ND2 file.

Caenorhabditis elegans'ta Mitofajiyi Ölçme Protokolü

Analyzing the Images of Caenorhabditis elegans after Drug Treatment

Analyzing the Images of Caenorhabditis elegans after Drug Treatment  

After imaging the drug-treated C.elegane, open the ND file in the image J server with the colocalization plugin and select the split images option in the dialogue box. Each ND file contains image planes taken at three wavelengths and visible light. Work with brightfield, green, and red images.Generate duplicates of these images to keep the original image untouched by clicking on image and selecting duplicate or using the keyboard shortcut shift plus D.Then reduce the background by generating another image duplicate as demonstrated earlier. Subtract the background with a rolling radius of 100 and select the create background option to generate an image with the given image's Background. Now go to process, click image calculator and subtract the first duplicated image from the second duplicated image.Use the resulting images for the colocalization analysis. To use the colocalization plugin, convert the green and red channel images to eight bit by clicking image, selecting type, followed by eight bit. Next, click on plugins and select colocalization.To measure the colocalization of mitochondria and lysosome signals, set the ratio to 75%the threshold red channel to 80.0, and the threshold green channel to 50.0. An eight bit binary image containing colocalized puncta and combining the three eight bit images in an RGB image is generated as output. Next, focus on the puncta in the head body wall muscle of the worms by manually selecting the area and creating a mask by clicking edit, selection, and create mask to select the region of interest.To select the particles in the region of interest, use the image calculator to select the colocalized eight bit and masked images. Utilize the operation and to select the puncta in the region of interest generating an image with puncta in the region of interest. Finally, to analyze the area of the colocalized mitochondria and lysosomes, select analyze, followed by analyze particles and measure the summation of the puncta between 0.1625 square micrometers and four square micrometers.The confocal images of the head body wall muscles of worms showed colocalization of mitochondria and lysosomes. VL-850 induced robust mitophagy in the worm's head body wall muscles, indicating a potent mitophagy inducer. The mitophagy potency of VL-850 was similar to that of FCCP.

İlaç Tedavisi Sonrası Caenorhabditis elegans Görüntülerinin Analizi

Protocol for Measuring Mitophagy in Hep-3B Cancer Cells 17

To begin, take 70 to 80%confluent Hep-3B cells. Remove 250 microliters of medium from each of the wells and add 50 microliters of medium with the appropriate treatment or vehicle. Add 50 microliters of medium to each well containing the staining reagent, and incubate the cells with the dye.After removing the medium and washing the cells with pre-warmed PBS, fix the cells with 200 microliters of fixing solution for 15 minutes at room temperature. Afterward, decant the fixative solution and wash briefly with 200 microliters of PBS. Finally, add 200 microliters of PBS.Keep the cells covered and protected from light at four degrees Celsius, and image within 24 hours.

Hep-3B Kanser Hücrelerinde Mitopaji Ölçme Protokolü 17

Image Analysis of  Hep-3B Cells after Drug Treatment

After imaging the drug treated Hep-3B cells, open the confocal images in image J with the colocalization plugin. Open the ND file in the image J server and select the split channels option in the dialogue box. Work with green and red images.Generate duplicates of these images to keep the original image untouched by clicking on image and selecting duplicate or using the keyboard shortcut shift plus D.To reduce the background, generate another image duplicate, subtract the background with a rolling radius of 100, and select the create background option to generate an image with the given images background. Then, go to process. Click image calculator and subtract the first duplicated image from the second duplicated image.Utilize the resulting images for the colocalization analysis. To use the colocalization plugin, convert the green and red channel images to 8 bit by clicking image, selecting type, followed by 8 bit. Next, click on plugins and select colocalization.To measure the colocalization of mitochondria and lysosome signals, set the ratio to 75%the threshold red channel to 80.0, and the threshold green channel to 50.0. An 8 bit binary image containing colocalized puncta and combining the three 8 bit images in an RGB image will be generated. Convert these images to 8 bit images.To obtain the region of interest of the cells, generate an image that highlights the area of cells by selecting a colocalized point's image. To select the entire cell area, select the resultant colocalized points image and click on image, adjust threshold, and set threshold to ensure all the cell area is highlighted. To analyze the area of the cell, select analyze, click analyze particles, and measure all the particles in the image from zero to infinity, the default setting for analyze particles.To analyze the area of the colocalized mitochondria and lysosomes, select the colocalized 8 bit image. Then, select analyze. Click analyze particles and measure the summation of puncta between 0.1625 square micrometers and four square micrometers.Divide the area of the colocalized mitochondria and lysosomes by the total cell area to measure the colocalized puncta. The confocal images of Hep-3B cells displayed colocalization of mitochondria and lysosomes. VL 850 and FCCP induced significant mitophagy in the Hep-3B cells.