Başlamak için, metal ağları 25 x 8 milimetre ölçülerinde şeritler halinde kesin. Özelleştirilmiş ağları bir sterilizasyon kabına yerleştirin ve iki saat boyunca otoklavlayın. Otoklavlamadan sonra sterilizasyon kabını ve 1,8 mililitrelik şişeleri laminer akış tezgahının altına yerleştirin.
Sterilizasyon kabını açın ve metal ızgarayı çıkarın. Izgarayı 1.8 mililitrelik şişenin kapağına yerleştirin ve şişeyi kapatın. İnsan yumurtalık korteks dokusunu topladıktan sonra medullayı çıkarın ve dokuyu istenen şekillerde kesin.
Altı oyuklu plakanın ilk oyuğuna beş mililitre vitrifikasyon çözeltisi 1 ekleyin. Hücre süzgecini kullanarak, yumurtalık korteks dokusunu plakanın 1 kuyusunda beş dakika boyunca dengeleyin. Hücre süzgecini korteks dokusu ile birlikte beş mililitre vitrifikasyon çözeltisi 2 içeren kuyu 2'ye taşıyın ve beş dakika boyunca dengeleyin.
Daha sonra, korteks dokusu içeren süzgeci, altı dakika boyunca beş mililitre vitrifikasyon çözeltisi 3 içeren altı oyuklu bir plakanın 3 kuyusuna yerleştirin. Hazırlanan kriyo şişesini sterilize edilmiş sıvı nitrojen ile doldurun ve sıvı nitrojenle doldurulmuş kriyo dewar kabına yerleştirin. Doku örneklerini bir dakika içinde vitrifikasyon cihazının metal ızgarasına yükleyin.
Ardından metal ızgarayı, ızgara tabanlı kriyo şişesindeki sıvı nitrojenin içine yerleştirin. Steril altı oyuklu bir plakanın 1 numaralı kuyusuna altı mililitre dengeleme çözeltisi ekleyin, ardından her biri 2 ve 3 numaralı kuyucuklara altı mililitre RS aktarın. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Hızlı ısınma solüsyonunu steril bir numune kabında 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma plakası üzerinde bir saat ısıtın. Laminer akış tezgahının altında, vitrifiye edilmiş yumurtalık kortikal dokusu içeren kriyo ile korunmuş şişeleri açın. Ağı hızlı bir şekilde hızlı ısınma çözeltisine aktarın.
Steril forseps kullanarak, dokuyu dengeleme çözeltisine aktarın ve sallanan bir çalkalayıcı üzerinde üç dakika inkübe edin. Ardından, dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sallanan bir çalkalayıcı üzerinde RS1 ve RS2 ile durulayın. Kalseini 100 mikrolitre DMSO'da çözün.
Üç mikrolitre kalseini 1,5 mililitrelik bir tüpün dibine aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. 1,5 mililitrelik bir tüpe 0,007 gram kollajenaz ekleyin ve tüpü eksi 20 santigrat derecede saklayın. Donmuş üç mikrolitre kalseine 997 mikrolitre DPBS ekleyin ve kalsiyi çözmek için yeniden askıya alın.
Daha sonra 1000 mikrolitre çalışma çözeltisi elde etmek için soğuk kollajenaz tozu ekleyin. Daha sonra 500 mikrolitre çalışma kalsein çözeltisi ekleyin ve iki milimetre yumurtalık korteks parçasının iki parçasını dört kuyulu bir tabağın kuyucuklarına aktarın. Daha sonra ışıktan koruyarak 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.
Son olarak, floresan mikroskobu altında foliküler canlılığı belirleyin.
