Başlamak için, çıkarılan fare dokularını %50 buz gibi soğuk salin ve %50 metanol içeren doku öğütücü tüpüne yerleştirin. Havaneli öğütücü borusuna yerleştirin ve dokuyu homojenize etmek için hafifçe beş kez döndürün. Homojenize dokuyu hemen 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Homojenize numuneye iki mililitre metanol ve bir mililitre 0.1 molar hidroksilamin ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Retinoid ekstraksiyonu için, homojenata 10 mililitre heksan ekleyin ve tüpü en az 10 saniye boyunca yatay olarak girdaplayın.
Fazları ayırmak için homojenat heksan karışımını 1000 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak, heksan tabakasını ayrı bir 15 mililitrelik cam tüpe aktarın ve ekstrakte edilen numuneden hekzanı tamamen buharlaştırmak için numuneyi bir vakum santrifüjüne yerleştirin. 15 mililitrelik tüpteki kurutulmuş retinoidleri 100 mikrolitre heksan ile yeniden süspanse edin ve tüm retinoidlerin çözündüğünden emin olmak için iyice vorteksleyin.
100 mikrolitre hekzanın tamamını ikinci cam tüpe pipetleyin ve retinoidleri çözmek için tüpü girdaplayın. Ardından, HPLC analizi için 100 mikrolitre hekzanın tamamını tek bir cam inert içine pipetleyin. Uygun koşulları kullanarak HPLC çalıştırmasını ayarlayın.
Standartlara dayalı olarak ilgilenilen her retinoid için tutma sürelerini ve UV spektrumlarını kullanarak tepe noktalarını belirleyin. Kromatografik veri sistemini kullanarak, tanımlanan tepe noktalarını entegre edin ve analiti ölçmek için harici standart eğriye başvurun. Biyolojik doku kromatogramları için, tutma sürelerindeki değişkenlikleri hesaba katmak için tepe noktalarını manuel olarak entegre edin.
Kontrol faresi gözünün kromatogramında, 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol ve all-trans-retinol tanımlandı. Hidroksilamin ile muamele edilen fare gözünün kromatogramında, alıkonma süreleri arttırıldı. Bu retinaldehitlerin syn ve anti izomerleri de mevcuttu.
Fare hepatik dokusunun kromatogramında, retinil palmitat ve all-trans-retinol, A vitamininin ana formları olarak tanımlandı ve fare kanında bir trans-retinol zirvesi gösterdi. UV emici spektrumları, kromatogram piklerinde retinoid izoformlarının varlığını doğruladı.
