Yazarlar, uzman teknik yardım için Shelly Xie ve Jennifer Payne, kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Pediatrik Üroloji Derneği ve Stanford Pediatrik Araştırma Fonu hibe yoluyla mümkün olmuştur.

Üretral kateterler I. Hazırlık <ol><li> Numune alınacak her bir fare mesane ve böbrek için, sırasıyla, bir cryovial tüp içinde 5-6 paslanmaz çelik boncuk (mesane, 1.6 mm boyutlarında veya 0,9-2,0 mm karışımı) veya zirkonyum oksit boncuk (böbrek, 0.5 mm boyutlarında) yerleştirin. Boncuk içeren tüplere Otoklav. </li><li> Ortam sıcaklığına kadar soğumasını tüpleri sonra, her paslanmaz çelik boncuk içeren tüp ve her zirkonyum oksit boncuk içeren tüp steril PBS 400 mikrolitre 200 mikrolitre steril PBS ekleyin. </li><li> Biz, Hung ve Hultgren 13 tarafından açıklandığı gibi üretral kateterler hazırlar . Temiz bir çifti düz başlı forseps ve ince makas (iris veya benzer tipte) Otoklav ve aletlerin ortam sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. % 70 etanol ile laminer akış kaput yüzeyleri silin. Kaput, polietilen boru, 30 cm (yaklaşık) segmentinde kesti. Aseptik olarak steril bir 3 cc şırınga, steril bir 30 iğne (1 / 2 inç uzun bir iğne) yerleştirin. Otoklavlanmış forseps ile kesilen polietilen boru bir ucunu Pick up ve hub karşılar kadar iğne üzerine boru slayt. Yaklaşık 2 cm iğne ucu ötesine uzanan boru böylece kesin. Kateter steril bir petri şırınga ve yerden çıkarın. </li><li> Çapraz bulaşma olasılığını azaltmak için, biz her fare için bir kateter olun. Tüm kateterler yapıldıktan sonra, onları en az 30 dakika süreyle UV radyasyona maruz kalma ile ortaya bir petri sterilize edin. UV lambaları ile doğrudan veya lambaları aktif iken kaputu vücudun herhangi bir parçası maruz bırakmayın. UV ışınlarına maruz kalan, kateter petri uzun vadeli saklı olabilir. Biz kısırlık korumaya yardımcı olmak için Parafilm çanak sızdırmazlık öneririz. </li></ol> II. Hayvan Aşılama <ol><li> Fare, strese bağlı karıştırıcı faktörlerin önlemek için haftada en az bir deneysel manipülasyon önce gelmelisiniz. Erkek fare üretra catheterize son derece zor, çünkü dişi fareler kullanılır. CBA / J yaygın olarak kullanılan, idrar yolu enfeksiyonu duyarlı kendilenmiş fare suşu. Bu immünolojik olgunluk, yaşlılık önce pencere olduğundan, Fare, 8 ile 12 hafta arasında yaş kullanılmalıdır. Deneyin ilk gününde, donmuş bakteriyel stok bir şişeye steril bir aşılama döngünün sonuna batırın. Uygun bir agar plaka üzerine küçük bir inokulum ve çizgi dışı Toplayıp. Genellikle, üropatojenik E. coli (UPEC) ve diğer suşları 37 Luria-Bertani (LB) agar gecede büyüdü ° C, havadaki. UPEC suşları LB agar katı, sarımsı-beyaz saydam koloniler olarak büyür. Hemen bakteriyel stok dondurucu dönmek. Üropatojenik bakteri suşlarının tekrarlanan, seri kültürleri ile zamanla daha az öldürücü olabilir. Dolayısıyla, her bir deney için taze bir agar plaka şeritli tavsiye ederiz. </li><li> Deney 2 gün, uygun koloni morfolojisi onayladıktan sonra, bir gecede en az 5 cc suyu kültür agar plakları ve yerden tek koloniler almak. LB suyu en üropatojenik bakteri suşları için kullanılabilir (37 ° C, havadaki 200 rpm). Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun. </li><li> Deney 3 gün, tip I pili ifade artırmak için (genellikle 37 ° C ve 200 rpm) bir gecede% 10 suyu ilk suyu kültür ve kültür. Tip I pili in vivo 1 üropatojenler için kritik bir virülans faktörü olduğu gösterilmiştir beri Seri suyu bakteri kültürleri, uropathogenicity optimize etmek için yardımcı olur. Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun. </li><li> Deney 4 gün, 3 gün suyu kültürü OD 600 ölçer. Test edilen bakteri suşu için zaten bilinen değilse, OD 600 ve kob arasındaki ilişkiyi belirlemek için en az 7 günlükler (PBS ile yapılan dilüsyonları, LB agar üzerinde yapılan kültürler, 37 ° C de inkübasyon gecede) üzerinden on kat seri seyreltme kaplama yapmak / ml. Genel bir kural olarak, 0,4-0,5 bir OD 600 50 mikrolitre başına 1-2x10 7 kob yaygın karşılık gelir. OD 600 ve kob / ml arasında bir ilişki tespit edildikten sonra, bir OD 600 PBS 50 mikrolitre fare başına istenen kob karşılık gelen suyu kültürü ayarlayabilirsiniz. Bazı iş yerine 50 den 10 mikrolitre, aşılama, kidneys6 içine az reflü yol açtığını öne sürmüştü. Ancak, çoğu yayınlar ortalama 50 mikrolitre fare kullanımı bildirdin. Genel olarak, 10 6 ve 108 kob / fare, ama her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu in vivo deneysel olarak test edilmesi gerekmektedir arasında istenen kob aralıkları. </li><li> Bu inocula instilasyon hemen sonra işeme değildir sağlamaya yardımcı olmak için, fare genel anestezi indüksiyonu öncesinde en az 30 dakika süreyle su yoksun olmalıdır. Bir diğer önemli manevra scruffing fareler anestezi indüksiyonu öncesinde işeme neden ve yavaşça alt abdom basaraktr. Iki ila% 2,5 &#39;izofluran% 1,8-2 izofluran ile bakım anestezi ile 8-12 haftalık kadın CBA fareler için güvenli bir indüksiyon dozu,. </li><li> Anestezi sağlandıktan sonra, farelerin izofluran içeren oksijen bağlı bir roket ucu konisi takılı kafası ile yatar pozisyonda yerleştirilir. Alt karın mesaneden idrar tahliye için masaj yapılır. Mesane nispeten boş ise, bu manevra idrar verim olmayabilir. Alt karın ve perine% 70 etanol ile ıslatılır. </li><li> Olmayan bir steril bir iğne 1 cc şırınga istenilen bakteriyel inokulum çekmek için kullanılır. Sonra steril bir üretral kateter aseptik şırınga yerleştirilir. Sadece 1-2 milimetre boru iğne ucu distal kalır, böylece aşırı boru bir makas ile kateter kesilir. Sonra, şırınga vurdu ve piston tüm kabarcıklar dik kaldırmak için şırınga ile depresif. Bakteriyostatik yağlayan bir topak sütü steril bir petri veya steril enjektör sarmalayıcı iç üzerine etmedik. Kateterin ucu (ekli şırınga ile), jöle batırılmış. Birden fazla bakteri suşlarının aynı deneyi test ediliyor, farklı suşları içeren kateterler yağlamak için aynı damla jöle kullanmamaya dikkat edin. </li><li> Anestezi fare için bir stereo mikroskop büyütme (5x optik zum aralığı 0.8x) kullanarak, klitoral başlık nazik, ince dişli forseps bir çift ile non-dominant el kavradı ve derin pembe üretral meatus (maruz sefalad kaldırdı Şekil 1). Bağlı kateter) şırınga (bir kalem kavrama ile dominant el kavradı ve kateterin ucu 45 derecelik bir açıyla üretral meatus ile uğraşmaktadır. Klitoral kaput şırınga uzun ekseni boyunca gergin, kateterin üzerine etkili üretra &quot;yükleme&quot;. Bu manevra, fare üretra gereksiz olduğundan çok önemlidir. Kateter mesane (hub, Şekil 2) kolayca slayt, ve yavaşça üretra gereksiz kıvrımları gezinmenize yardımcı twirled olabilir. Kateter hubbed sonra fare uzun eksenine paralel olana kadar, şırınga düşürülebilir. Baskın olmayan el inokulum (en az 5 saniye) yavaş yavaş enjekte etmekte kullanılan dominant el olarak kateter ve şırınga konumunu istikrara kavuşturmak için forseps bırakabilirsiniz. Sıvı enjeksiyon sırasında kateter etrafında akan görülürse, mesane ya tam veya kateter vajina (üretra sadece kaudal). Enjeksiyon hemen durdurulur ve kateter pozisyonu dikkatle incelenmelidir. Kateter üretra ise, verilen fare deneyinde yer olmamalıdır. Öte yandan, vajina içinde yanlış bir kateter yerleştirilmesine ve enjeksiyon yeniden girişimi. Enjeksiyondan sonra, kateter ve şırınga fare yavaş yavaş geri çekilir. </li><li> Uygulanan bakteri tahliye ve böylece değişken enfeksiyon düzeylerine yol açabilir erken aşılama sonrası işeme olasılığını azaltmak için, bazı araştırmacılar anestezi altında transüretral inoculation10 sonra 30 dakika süreyle fareler korumak. Ameliyattan sonra, farelerin normal nefes desen ve faaliyet dönüş onaylamak için sürekli gözlem ile temiz bir ısınma battaniye kurtarmak olmalıdır. Bir kez hayvanlar tam tarama yeteneği iyileşti, onlar çarşaf içeren kafeslerde iade edilebilir. </li></ol> III. Enfekte Doku Ölçü CFU <ol><li> Çeşitli fare İYE yayınlar 6 saat, bir hafta veya daha uzun bir post-aşılama kültür sonuçları bildirdin. En uygun zaman her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. Iflenen idrar kültürü için steril bir Petri kabı üzerine fare scruffing elde edilir. Toplanan idrar, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Işeme idrar kaç saat içinde elde etmek için birden çok deneme fare işeme, sık, düşük hacimli (geçersiz ortalama 30-100 mikrolitre) olduğundan, gerekli ve strese bağlı olabilir. </li><li> Işeme idrar örnekleri alındıktan sonra, izofluran ve servikal dislokasyon kullanarak fareleri kurban. Karın aseptik açıldı. Işeme idrar örneği başarıyla daha önce elde değilse, küçük bir idrar miktarı genellikle 30 gauge iğne ve şırınga kullanılarak mesane duvarının üzerinden aspire edilebilir. </li><li> Bir veya iki böbreğin kaldırılır steril bir petri üzerinde en az 4 adet (her parça en az 50 mikrogram olmalıdır) içine kıyılmış ve yerleştirilir zirkonyum boncuk / PBS içeren buz üzerinde cryovials. Mesane, kaldırılır, en az 4 adet içine kıyılmış ve paslanmaz çelik boncuk / yerleştirilir PBS içeren buz üzerinde cryovials. Doku / boncuk / PBS içeren cryovials Bullet Blender homojenizatör yerleştirilir ve dokuları, bir dakika süreyle &quot;8&quot; hız ayarı kullanarak homojenize edilir. Bazı doku parçaları homojenizasyon sonra kalması için yaygındır. Sıvı Homojenat 50-100 mikrolitre pipetlenebilir sürece, katı parçalarımutlaka bir sorun değildir. Homojenizasyon zaman bazı örnekler arttırılabilir ise, homojenizasyon tutarlılığı korumak için bütün dokular için bunu yapmak için kritik öneme sahiptir. Bullet Blender homojenizatör, çapraz bulaşma olasılığını ortadan kaldırır, bireysel örnekler standart bir Homojenizatör kullanarak tek bir işlem daha hızlı ve örnekleri homojenize önemli ölçüde ısı değildir çünkü kullanmaktadır. </li><li> En az iki ya da üç kez toplanan idrar ve doku homojenatlarında on kat dilüsyonları mikrotiter plate yapılmalıdır. Ön deneyler için en az yedi on kat dilüsyonları yapmak için ihtiyatlı olabilir. 100&#39;e kadar uygun agar Kültür idrar mikrolitre, mesane ve / veya böbrek homojenatlarında. Idrar örnekleri hacmi sınırlı olabilir bu yana, on kat dilüsyonları gerçekleştirmeden önce 100 mikrolitre birimleri getirmek için gerekli olabilir. Eğer bu talep ediliyorsa, ilk seyreltme (on kat seyreltme önce) bakteriyel verimi son hesaplamalarına dahil çarpanlarına gerekecektir. Bu medya Gram negatif organizmalar için seçici olduğundan, eozin metilen mavisi veya MacConkey agar (37 gecelik inkübasyon ° C) kültür UPEC tercih. MacConkey agar UPEC suşları laktoz fermente yeteneği nedeniyle merkezi umblike, kırmızı-pembe koloniler olarak büyür. </li><li> Gece kültürden sonra, her plaka için kob sayılır. 50-100 koloni içeren plaka seyreltme seri seyreltilmiş numuneler için en doğru sayısı olarak kabul edilir. &quot;Geri&quot; doku miligram başına, doku başına kob hesaplamak veya ml&#39;de. </li></ol> IV. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 forseps (fotoğraf üst ötesinde) ile sefalad klitoral kaput kaldırma maruz Üretral meatus (koyu pembe doku) . <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 üretra kateterize. Bifid klitoris kateter hemen üstünde görülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Mesane kob üropatojenik E. ile 8 hafta yaşında kadın CBA / J fareler transüretral enfeksiyonu 2 gün sonra sayılır coli. Mesanesi MacConkey agar seri seyreltme kaplama homojen ve kob / ml tespit edildi. Elmas bireysel fareler için kob / ml gösterir, yatay çubuk medyan kob / ml gösterir.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli.">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li><li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract.">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li><li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies.">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li><li>Gunther, N. W. t., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection.">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li><li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells.">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li><li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder.">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li><li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending,+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin.">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

İndüksiyon fare idrar yolu enfeksiyonu, bakteri transüretral aşılama köklü ama teknik olarak zor bir işlemdir 11. Hung ve Hultgren fare idrar yolu enfeksiyonu 13 transüretral teknikler son zamanlarda mükemmel bir inceleme yayınladı. Bu çalışmada, biz bu deneysel yaklaşım daha ince göstermek için çalışırlar. Yeni başlayanlar, mesane ortaya çıkarmak için bir orta hat laparotomi yapmak, Hindistan mürekkep (PBS içinde% 1) bir çözelti enjekte v...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Ilgi üropatojenik bakteri suşlarının agar yetiştirilmektedir. Genellikle, üropatojenik<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) ve diğer suşların 37 gece Luria-Bertani agar (LB) yetiştirilebilir ° C, havadaki. UPEC suşları LB agar sarımsı-beyaz saydam koloniler olarak büyür. Uygun koloni morfolojisi onayı takiben, tek koloniler, daha sonra suyu olarak yetiştirilebilir toplanır. LB suyu en üropatojenik bakteri suşları için kullanılabilir. İki seri, bir gecede LB suyu kültürleri, tip I pili, üropatojenik bakteriler için iyi tanımlanmış bir virülans faktörü ifade artırmak için istihdam edilebilirler. Broth kültürler istenen konsantrasyona fosfat tamponlu salin (PBS) seyreltilir. Sekiz-12 haftalık dişi farelerde izofluran anestezi altında yerleştirilir ve transüretral 30 göstergesi şırınga boru kaplı polietilen kullanılarak bakteri inoküle. Ampirik / fare her bakteri suşu kombinasyonu için tespit edilmelidir tipik inocula, 10<sup&gt; 6</sup&gt; 10<sup&gt; 8</sup&gt; 10 ila 50 mikrolitre PBS kob başına fare. İstenen enfeksiyon döneminden sonra (birkaç hafta gün), idrar örnekleri ve mesane ve her ikisi de böbrek hasat edilir. Her organ, kıyılmış PBS içinde yer ve Mavi Bullet Homojenizatör homojenize. Idrar ve doku homojenatlarında seri PBS içinde seyreltilmesi ve uygun bir agar kültüre. Ertesi gün, koloni oluşturan birim sayılır.

Watch this Scientific Journal Video about Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection at JoVE.com

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Bu video transüretral fare idrar yolu enfeksiyonlarına neden ve enfeksiyonların sonucunda dereceye ölçmek için yöntemler gösterecektir.

Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K Görüntüleme.  Stanford University. Bu video transüretral fare idrar yolu enfeksiyonlarına neden ve enfeksiyonların sonucunda dereceye ölçmek için yöntemler gösterecektir.

Video: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Yetişkin erkek fare yordamda transüretral korumak

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Fare modelleri Helicobacter enfeksiyonu ve gastrik patolojiler

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Bleomisin endotrakeal enjeksiyon tarafından fare akciğer hasarı indüksiyon

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...