Bu protokol hem bleomisin endotrakeal enjeksiyonu ile her iki akciğerde de önemli inflamatuar ve fibrotik yanıtı indüklemek hem de kuyruk damar ı ile yeni anti-inflamatuar ve anti-fibrotik sistemik tedavileri doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı fare trakea içine Bleomisin doğrudan enjeksiyonu akciğer inflamatuar ve fibrozis güvenli, sağlam ve tekrarlanabilir indüksiyon sağlayan üst hava yolunda herhangi bir dökülme olmadan akciğerlerin hızlı hedefleme sağlar. Prosedürü gösteren Dr.Fiorenza Orlando, ortak laboratuarımızdan bir veteriner doktor olacak.
Başlamak için, bir cerrahi platform üzerinde sırt üstü yatan anestezili fare konumlandırın. Yerinde tutmak için bacaklarını cerrahi bant şeritleri ile hassas bir şekilde düzeltin. Farenin boynunu hiper uzatmak için, servikal bölgesinin altına diş pamuk rulosu gibi bir destek yerleştirin.
Sonra yavaşça boğaz tıraş için bir jilet kullanın. Deriyi çimdiklemek için bir çift anatomik forceps kullanın. Fare sternohyoid kas yazışmalarda uzunluğu yaklaşık yarım santimetre uzunluğunda kısa bir kesi yapmak için kavisli künt makas saplı halka bir çift kullanın.
Herhangi bir kanamayı durdurmak için pamuk lu çubuklar kullanın. Sonra künt diseksiyon ile trakea dışlaştırmak ve yavaşça yağ ve diğer dokulardan temizleyin. Fareyi kafasıyla operatöre yönlendirmek için cerrahi platformu döndürün ve enjeksiyon sırasında operatörün şırıngaya düzgün bir şekilde açı yapmasına izin ver.
Nefes borusunu görselleştirmek için fareyi çalışan bir mikroskobun altına yerleştirin. Aydınlatmayı ayarlayın ve büyütmeyi 1 ile 1,2 arasında ayarlayın ve ardından odak noktasını ve netliği ayarlayın. Trakea kolayca açıkça görülebilir trakeal halkaları ile beyaz yarı saydam tüp olarak ayırt edilebilir.
Bleomisin çözeltisini karıştırmak ve 100 mikrolitreyi 0,5 mililitrelik şırınganın içine, 25 gauge iğneile kabarcık oluşumundan kaçınan bir şırıngaya karıştırmak için hafifçe pipet. Trakea açıkça görüntülendikten sonra, iğne ucuyla 30 derecelik açıyla dikkatlice delin. Yavaş yavaş doğrudan trakea lümen içine Bleomycin 100 mikrolitre enjekte.
Tüm ses inin iğneden aşağı inmek için birkaç saniye bekledikten sonra nefes borusundan çıkarın. İğne nefes borusuna doğru bir şekilde yerleştirildiğinde oluşan ve sıvının tüm hacminin solunduğuna dair birkaç saniyelik apne gözlemleyin. Şırıngayı ve iğneyi güvenle atın.
Deri altı fasyave deri yarasını 5-0 emilebilir dikişle kapatın ve hayvanın iyileşmesini bekleyin. Fareyi tekrar anestezi ettikten ve bilinç kaybı onaylandıktan sonra fareyi steril bir kaputun altına yerleştirin. Deney boyunca nazik anesteziyi korumak için %1,5 izofluran sürekli akışa sahip bir yüz maskesi kullanın.
Vazodilatasyonu teşvik etmek ve daha kolay enjeksiyon için izin vermek için, iki dakika boyunca ılık suda kuyruk ıslatın. Hücre kümeoluşumunu önlemek için hafifçe pipetleme ile insan göbek kordonu mezenkimal stromal hücrelerin in süspansiyon karıştırın. 26 gauge iğne ile bir mililitreşşile baloncuk oluşumunu önleyen 200 mikrolitre aspire edin.
Kuyruğu ucundan tutun ve hafifçe düzdüze. Sonra kuyruğun lateral ven bulmak. Yavaşça bir neşter ile kuyruk kazıyın ve% 70 etanol ile silin.
Kuyruğun distal kısmından başlayarak, iğneyi 15 derecelik bir açıyla damara takın. Yavaş yavaş insan göbek kordonu mezenkimal stromal hücrelerin infüzyon 200 mikrolitre. Başarılı intravenöz infüzyonu izlemek için, direnç ve ekstravazasyon eksikliği olmadan ven giren sıvı gözlemleyin.
Tüm hacim iğne aşağı seyahat edene kadar birkaç saniye bekledikten sonra, damardan çıkarın. Daha sonra kanamayı önlemek ve hayvanın iyileşmesini sağlamak için steril bir gazlı bezle giriş yarasına kısa bir süre basınç uygulayın. İnfüzyondan sonra şırıngayı ve iğneyi güvenle atın.
Bleomisin enjeksiyonundan sonra hematoksilin ve Eosin ve Picrosirius Red boyama ile akciğer histopatolojik değişiklikleri, serumfizyolojik sonrası normal akciğer mimarisine göre geniş inflamatuar infiltrasyon ve fibrozis idrakına doğru değerlendirildi. Bleomisin indüklenen akciğer iltihabı ve fibrozis büyük ölçüde insan umbilikal korbiyal korbiyal mezenkimal stromal hücre infüzyonu ile zayıflatılmış, ancak salin ile değil. Kollajen birikimi hidroksiproline titreşme ile ölçüldü.
Bleomisin enjeksiyonu sonrasında hidroksiproline düzeyleri 8.günden 14 ve 21. Oysa insan göbek kordonu mezenkimal stromal hücrelerin eklenmesi önemli ölçüde Bleomisin etkilerini azalttı. Tüm akciğer mRNA'sında Col1A1 tip bir kollajen geninin ekspresyon düzeyleri de 8, 14 ve 21.
Spesifik antikorlarla immünoleboyama, insan göbek kordonu mezenkimal stromal hücrelerinin hızlı ve etkili bir şekilde fare akciğerlerine ulaştığını, ancak sadece birkaç hücrenin tespit edildiğini gösterdi. Bu veriler, uzun süreli koruyucu etkiye rağmen hücrelerin bölgeden hızlı bir şekilde çıkılabileceğini göstermektedir. Çalışan bir mikroskobun kullanılması, operatörün iğnenin kurulumdan önce fare trakeasına doğru şekilde yerleştirilmesini doğru bir şekilde izlemesine izin vererek yüksek başarı güveni sağlar ve böylece ona zarar verme riskini en aza indirir.
