Bu yöntem mikrobiyota üyelerinin etkisi hakkında gastroenteroloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle cins Helicobacter olanlar, inflamasyon ve kanser. Bu tekniğin en büyük avantajı, helicobacter enfeksiyonunun incelenmesine ve fizyolojik koşullar altında mide üzerindeki etkisine olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin sonuçları, Helicobacter enfeksiyonunun önlenmesi veya ortadan kaldırılması veya antibiyotikler, ilaçlar veya aşılar da dahil olmak üzere sonuçları için tedavilerin geliştirilmesine yönelikdir.
Bu yöntemler Helicobacter enfeksiyonunun patogenezine özgü bir içgörü sağlar. Ancak, tekniklerin birkaç diğer gastrointestinal patojenlerin çalışmaya adapte edilebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler farelerde enfeksiyon kurma yeteneğine sahip bir bakteriyel inoculum hazırlanması ile mücadele edecek.
Helicobacter izole lerinin, yoğun bir alt kültürden in vitro geçirmiş olmayan fare kolonileştirme suşları olarak bilinmesi zorunludur. Buna ek olarak, bu suşlar için in vitro alt kültürlerin sayısı kaydedilmelidir. 15 mililitrelik polistiren tüplere bakteriyel süspansiyonlar ekleyin ve her kültürden 10 ila 20 mikrolitrelik damlacıkları tek tek cam mikroskop slaytlarına aktarmak için plastik bir döngü kullanın.
Daha sonra, faz kontrastlı mikroskopi altında bakterilerin canlılığını ve hareketliliğini 100 kat daha fazla büyütmede değerlendirin. Bakterilerin çoğunluğu basilşeklinde ise sadece H.pylori inocula kullanın. H.felis inocula öncelikle sarmal şekilli bakteriler içermelidir.
Ve inocula'yı tek kullanımlık, tek kullanımlık, mililitreşileşlere yükleyin. Her şırıngayı 23 kalibrelik bir iğneyle donatın ve her iğneye tek kullanımlık polietilen kateter takmak için plastik parafin film kullanın. Daha sonra, altı ila sekiz haftalık spesifik patojensiz ve Helicobacter içermeyen fareyi boyun ve kuyruğun ensesine elle dizginler ve açık çenenin ortasına bir kateter yerleştirin.
Kateteri yemek borusuna doğru bir kateterde yönlendirin, farenin boynunu uzatarak yemek borusundan mideye ve trakeadan uzaklaşın, kateterin çoğu veya tamamı artık görünmez olana ve bir direnç hissedilene kadar. Sonra, en iyi kolonizasyon ve hastalık patolojisi sağlamak için beşinci bakterilere en az bir kez 10 teslim. Deneyin sonunda, mide eksizyonu için karın boşluğu açmak için ince, kavisli makas kullanın.
Büyük eğrilik boyunca mide kesin ve yavaşça herhangi bir artık gıda kaldırmak için yıkama başına taze PBS bir 50 mililitrelik tüp iki kez organ yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, ıslak ağırlığı kaydetmek için bir katranlı, altı santimetre, plastik Petri çanak içine doku yerleştirin. Midedüzleştirme sonra, antrum oluşan iki eşit doku parçaları halinde sagittally örnek ikiye bölün, vücut, ve non-glandüler forestomach bölgeleri.
Non-glandüler bölge çıkarın ve planlanan downstream analizi için uygun çözüm doku parçası depolamadan önce her midenin yarısı tartMak. Mide dokusunun diğer yarısını %10 formalin içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin ve 10 saniye sonra tüplerin üst taraflarına dokuları düzleştirmek. Dokular tüp duvarlarına yapıştırılmış hale geldiğinde, en az 24 saat boyunca formalin örnekleri yeniden batırın.
Midede enfeksiyon sonrası canlı H.pylori sayısını saymak için, BHI'de depolanan mide örneklerini homojenize eder ve ortaya çıkan gastrik homojenlerin taze, steril et suyunda seri seyreltmeler gerçekleştirir. Önceden kurutulmuş at kanı agar, veya HBA, plakalar üç veya dört segmente ek antibiyotikler ile takviye bölmek ve Miles ve Misra tekniğinin bir adaptasyon kullanarak, her agar plaka bir segment üzerine her mide homojen seyreltme 10 ila 100 mikrolitre ekleyin. Steril, plastik döngüler ile homojenleri yayın ve plakaların kurumasını bekleyin.
Daha sonra, su petri çanak ve bir gaz paketi içeren anaerobe gaz kavanoz ters bir pozisyonda plakaları yerleştirin. Sonra, kavanozları 37 derecede 4-7 gün kuluçkaya yatırın. Koloniler gözlemlenebildiği zaman, 10 ila 100 izole koloni içeren segmentleri sayısal.
Ötenaziden sonra mide hayvanlardan hasat edilir ve tartılır. Non-glandüler bölge kaldırılır, ve mide antrum ve vücut oluşan iki eşit yarıya ayrılır. Başarılı kolonizasyon genellikle hba plakaları üzerine çizgili gastrik homojenatlardan bireysel kolonilerin canlı sayma ve sonraki numaralandırma gerçekleştirerek doğrulanır.
Fare mide mikrobiyotası veya çok sayıda H.pylori kolonisinden gelen kirletici bakterilerin varlığının H.pylori CPU'ların numaralandırılmasını zorlaştırabileceğini unutmayın. Alternatif olarak, PCR H.felis ve H.pylori ureB genlerinin 325-baz çifti bölgeye yönelik özel doğrulanmış astarlar kullanarak enfeksiyonu doğrulamak için kullanılabilir. Bu temsili deneyde, yabani tip C57 Black-6 fareler, H.felis enfeksiyonu sonrası altı ay hiperplazi ve bez atrofisi de dahil olmak üzere orta derecede inflamasyon belirtileri ve submukozanın hücresel infiltrasyonu gösterdi.
Daha şiddetli inflamasyon nakavt farelerde aynı anda gözlenir, lenfoid foliküllerin ek varlığı hücresel infiltratlar yakın gözlenen ile. H.felis bakterileri de enfekte fare mide dokusunun Giemsa lekeli bölümlerinde görselleştirilmiş olabilir. Bu prosedürü takiben, Helicobacter enfeksiyonu sırasında indüklenen konak yanıtlarının türleri hakkında ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR, immünohistokimya veya immünoresans gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.
Bu teknik, gelişiminden sonra mikrobiyoloji ve gastroenteroloji alanında araştırmacıların Helicobacter pylori'nin mide hastalığındaki nedensel rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, helicobacter türleri ile farelere nasıl tekrar bulaştıracağınız ve enfeksiyonla ilişkili patolojiyi nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu protokolde kullanılan Helicobacter suşlarının bulaşıcı olduğunu unutmayın ve bu nedenle bu bakterilerle çalışırken her zaman standart biyogüvenlik prosedürleri izlenmelidir.
