Bu yöntem, potansiyel terapötik müdahaleler geliştirmek için putatif hedef genlerin ve patojenik mekanizmaların belirlenmesi gibi onkoloji alanında önemli bilgilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, NFAT2 ve diğer transkripsiyon faktörlerinin bilinen ve yeni hedef genlerle etkileşimini saptayabilmedir. Optimal fiksasyon ve kesme koşulları kurmak zor olduğundan genellikle bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek.
1.5 mililitrelik bir tüpü %37 formaldehit mililitre ile doldurmaya başlamak için. Daha sonra başka bir 1.5 mililitrelik tüpü, beş mililitrelik bir tüpte 1,25 molar glisin mililitresi ve dört mililitre PBS doldurun. Daha sonra, hücrelerin uyarılmasından sonra metin protokolüne göre hücreleri döndürür ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alır ve tüpü buz dolu bir kutuya yerzein.
Hücrelere 13,5 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Sonra oda sıcaklığında süspansiyon kuluçka. Bundan sonra, fiksasyon durdurmak için 1.25 molar glisin 57 mikrolitre ekleyin.
Ve süspansiyonun oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Kuluçka periyodundan hemen sonra hücreleri buza yerve hücreleri 500 kez G'de santrifüj edin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Sonra supernatant aspire.
Daha sonra hücreleri bir mililitre buz gibi PBS ile 200 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini beş mililitre likte bir tampon halinde, yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Sonra buz üzerine örnekleri koyun ve 10 dakika sallayarak onları kuluçka.
Bundan sonra tüpleri 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Sonra dikkatle supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. Hücreleri beş mililitre likis tampon iki ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için homojenize.
Sonra sallayarak 10 dakika boyunca buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminden sonra tüpleri 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, 1X proteaz inhibitörü ile tampon bir kesme hücre pelet yeniden askıya.
Sonra hücre süspansiyonuna 10 dakika kuluçkaya yat. Hava kabarcıkları oluşmamak için dikkat alarak sonicator tüpleri hücre süspansiyon 140 mikrolitre aktarın. Tüpleri yedi derece santigrat derecede odaklanmış bir ultrasonicator yerleştirin ve 10 ila 7 ve 1/2 dakika yamaç.
Hücre süspansiyonuna 1.5 mililitrelik tüpler aktarın. Numuneleri 15, 700 kez G'de 10 dakika 4 santigrat dereceye kadar santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni bir tüpte toplayın. İlk olarak, bir 1.5 mililitrelik tüp her yağış için protein A kaplı boncuk 20 mikrolitre hazırlayın.
Boncukbir dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleşmek için izin ve supernatant kaldırın. Daha sonra boncukları 40 mikrolitre 1X talaş tamponu ile yıkayın. Boncukbir dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleşmek ve supernatant kaldırmak için izin verin.
1X chIP tampon bir orijinal hacminde boncuk yeniden askıya önce bu yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Boncuklara BSA proteaz inhibitörü, 5X chIP tamponu ve ChIP-seq sınıfı su ekleyin. Sonra, yıkılmış kromatin ekleyin.
NFAT2'yi yakalamak için 10 mikrogram anti-NFAT2 antikor ve kontrol olarak 2,5 mikrogram IgG antikor kullanın. Karışımları bir gecede dört santigrat derecede, altı RPM'de dönen bir tekerleküzerinde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün tüpleri 7,000 kez G'de beş saniye döndürün ve bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.
Sonra supernatant aspirate ve yıkama tamponlar bir kez boncuk yıkama kayırken bir, iki, üç, ve dört ardışık. Tüpleri manyetik raftaki tüpleri bir dakika kuluçkaya yatırmadan önce 7000 kez G'de beş saniye döndürün. Bundan sonra, supernatant çıkarın ve sonraki yıkama tampon ekleyin.
Son yıkamadan sonra tüpleri 7000 kez G.Incubate bir dakika boyunca manyetik raftaki tüpleri beş saniye döndürün. Supernatant çıkarın ve elüsyon tampon bir 100 mikrolitre boncuk almak. Daha sonra dönen tekerleküzerindeki tüpleri 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, kısaca tüplerspin ve bir dakika için bir manyetik raf üzerine yerleştirin. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve dört mikrolitre elüsyon tamponu iki ekleyin. Giriş kontrol oluşturmak için bir mikrolitre yıkıntMa kromatin ile 99 mikrolitre elütion tampon bir ve elüsyon tampon iki dört mikrolitre karışımı.
Sonra numuneleri 4 saat boyunca 65 derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tüplere% 100 isopropanol 100 mikrolitre ekleyin. Girdap ve 7000 kez G.Then her örnek için manyetik boncuk 10 mikrolitre ekleyin beş saniye boyunca örnekleri spin.
Girdap ve bir saat oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde örnekleri kuluçka. Daha sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika lığına manyetik bir rafa yerleştirin. Supernatant aspire ve yıkama tampon bir 100 mikrolitre boncuk resuspend.
Tüpleri karıştırmak ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırmak için ters çevirin. Sonra, kısaca tüplersantrik. Bir dakika için bir manyetik raf yerleştirin ve supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın.
Sonra yıkama tampon iki 100 mikrolitre ekleyin. Tüpleri karıştırmak ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırmak için ters çevirin. Bundan sonra, kısaca tüplersantrik ve bir dakika için bir manyetik raf yerleştirin.
Aspirasyon yoluyla yıkama tampon ulaştırılması iki çıkarın ve elüsyon tampon 55 mikrolitre boncuk resuspend. Çökelmiş DNA'yı eleştirmek için numuneleri oda sıcaklığında dönen bir tekerleğe 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika lığına manyetik bir rafa yerleştirin.
Son olarak, yeni 1.5 mililitrelik tüpler için supernatant aktarın. Bu protokol ilk olarak Jurkat hücreleri ile potansiyel bir NFAT2 hedefi olarak LCK'yi analiz ederek gerçekleştirilmiştir. Burada gösterildiği gibi, il-2 pozitif kontrol ve LCK DNA'sının önemli ölçüde zenginleşmesi ile optimal sonuçlar belgelenmiştir.
Suboptimal kesme veya eksik fiksasyon düşük kaliteli DNA yol açabilir. Son olarak, bu protokol cd40L pozitif kontrol ve Deneysel hedef olarak LCK hizmet veren birincil insan CLL hücreleri ile yapılmıştır. LCK DNA'sının güçlü zenginleşmesi ile gösterildiği gibi, LCK birincil insan CLL hücrelerinde doğrudan NFAT2 hedefidir.
Yetersiz yamultma ile sonuçlanan yetersiz kaliteDE DNA, optimal olmayan sonuçları geri getirebilir. Bu yordamı denerken fiksasyon ve sonication adımları bu yöntemin başarısı için çok önemli olduğunu ve analiz edilen hücrelere ayarlanması gerekebilir hatırlamak önemlidir.
