Bu eser NINDS (NS066071) ve NIAAA hibe desteklenmiştir. (P50AA017823) ECO. Yazarlar, Dr Robert Quinn ve hayvan bakımı Laboratuar Hayvan Kaynakları Bölümü personel teşekkür. Biz Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (SURF) gibi yardım için, teknik destek için Nicole Belletier Judson Belmont ederim. Biz de yorum yapmak için Dr David Cameron teşekkür yazının önceki bir sürümünde düzenler.

Plazmid Yeşil Floresan Protein Ekspresyonu ile 1. Ex utero Electroporations <ol><li> Plazmid DNA enjeksiyon çözeltileri GKD 2 O. içinde 0.33 mg / ml &#39;lik nihai konsantrasyona seyreltildi çalışma CAG-eGFP DNA 27 ile hazırlanır Qiagen Endo-Free Maxi-Preps dönüştürülmüş bakteriler plazmid arındırmak için kullanılır. ~% 0.02 (w / v nihai) çabuk bir yeşil boya enjeksiyon İzleyici olarak DNA çözeltisine ilave edilir. </li><li> Cerrahi alan hazırlamak için,% 70 etanol çözeltisi ile tezgah üstü ve diseksiyon mikroskop sahne yıkadığınız ve kurulayın. Öncesinde diseksiyonu% 70 etanol ile cerrahi makas ve forseps püskürtün ve kurulayın. </li><li> Tüm hareket en az 1 dakika süreyle durdu kadar Timed Hamile İsviçre / Webster barajlar basınçlı silindirden CO 2 ile doldurulur ve baraj izlenen bir odasına transferi ile E13 üzerinde kurban edilir. CO 2 solunum yoluyla kurban sonra embriyolar rahim kaldırılır ve yerleştirilir10 cm&#39;lik Petri kabı içeren buz gibi soğuk Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). </li><li> Dikkatle çevredeki extraembryonic membranların her embriyo incelemek ve buz HBSS tutmak. </li><li> Soğuk HBSS içeren ikinci bir 10 cm Petri kabı ayrı ayrı her bir embriyo transfer. Gelecek analizi için kortikal alandan mekansal ayrı bir kortikal alanda enjekte bakımı, sol serebral hemisfer ventrikül içine DNA Hızlı yeşil karışımı 2-3 ul enjekte etmek için bir Hamilton şırınga kullanın. </li><li> Elektroporasyonu için forseps ile yavaşça embriyo tutun ve hafifçe başının dorsal orta hat üzerindeki cımbız elektrodun pozitif raket yerleştirin ve hafifçe embriyo çene altındaki negatif kürek yerleştirin. Electroporations 950 msn aralıklarla ayrılmış 50 msn süresince beş 30 V bakliyat, teslim etmek için programlanmış bir BTX830 Elektroporatör ile elde edilir. Bu ayarlar BTX830 model oluşturuyor. Diğer sistemler, üreticinin TALİMATLAR göre kullanılabilecekns. </li></ol> 2. Tüm Yarımküre Eksplantasyon Hazırlama <ol><li> Elektroporasyonun ardından embriyoların buz-soğuk HBSS içinde tekrar yerleştirilir. Beyin embriyo baş cilt ve kıkırdak kafatası kaldırmak için iki # 5 kuyumcu forseps kullanılarak kaldırılır. Bir forsepsle sonra kafatası bozulmamış beyinde çıkarmak için beyin altında kaydırılır. Electroporated yarımkürede (sol) ve sonra beyin uzak disseke edilir ve ekli orta beyin doku çıkarılır. Diseksiyon prosedürü dikkatle boyunca sol kortikal yarımkürede örten zarları tahrip etmeyecek alınır. </li><li> Sonra her bir embriyo bir kesim 1 ml pipet ile bir pipet kullanarak HBSS aktarılır disseke. Yarımkürede hafifçe kollajen kaplı kültürü insert üzerine atılır. Altı adede yarımkürede eksplantlar her 24 mm uç üzerindeki medial tarafı aşağı düzenlenmiştir. Bir kez düzenlenmiş fazla HBSS elemanı kaldırılır ve insert daha sonra da bir 6 da çanak biri 35 mm içine yerleştirilir. Iyi EXA içerirOrtamın ctly 2.7 ml DMEM-F12 ortamı Glutamax içeren ve% 2 B-27,% 1 G5 ve% 1 Penisilin-Strep desteklenmiştir. Kuyudan bir ortam birkaç damla her eksplant üstüne pipetle edilebilir, ancak çukur başına 2.7 mL orijinal fazla medya ekleme. </li><li> Eksplantlar Kollajen filtreler üzerine konulduktan sonra eksplantlar içeren 6 sıra çanak Billups Rothenberg (BR) odası (aynı zamanda bir su nemlendirme tabak içeren) içine yerleştirilir. A% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz karışımı odasının kapalı mühürleme ve% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz tüpü çıkarmadan önce en az 1 dakika süreyle odasına demlenir. BR oda sonra kültür periyodu, 1-2 DIV geri kalanı için bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Histoloji için Eksplantasyon Doku fiksasyonu <ol><li> Bir davlumbaz olarak ısıtılmış (~ 80 ve de 100 ml paraformaldehid ilk çözücü 8 g tarafından Pagano tesbit çözeltisi hazırlamakg, C) GKD 2 O. NaOH çözünürleştirme teşvik ve hafifçe karıştırın konsantre 1-3 damla ekleyin. Bir kez 500 mM sakaroz, 100 mM Hepes, pH 7.4, 50 mM MgCl2, 250 mM sakaroz, 50 mM Hepes içinde% 4 paraformaldehid bir nihai konsantrasyon için 5 mM KCl, olduğu bir çözelti ile% 8 paraformaldehid çözelti 1:1 Karışım çözündürülmüş , 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4. </li><li> Eksplantlar 37 ° C&#39;ye Pagano düzeltme çözüm ısıtmak düzeltmek için Hızla de her kültürden DMEM/F12 medyanın en çıkarmak ve eksplant her kuyucuğa Pagano Fix 5 ml ekleyin. Düzeltme tamamen her eksplant kapsayacak emin olun. Oda sıcaklığında 1 saat için düzeltildi. Önceki fiksasyon 1 hr filtresinden eksplantlar çıkarmayın. </li><li> Tespit Pagano düzeltme çözüm kaldırmak ve sabit olmayan Pagano çözeltisi (250 mM sukroz, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4) ile değiştirin sonra. Gömme kadar 4 azından% 10 sodyum azid ve mağaza ° C&#39;de bir kaç damla ekleyin. </li></ol> 4. Gömme ve SHistoloji için ectioning <ol><li> Ilık su (55-60 ° C), 100 ml buzağı cilt jelatin 10 g çözücü ile bir% 10 buzağı cilt jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözündüğünü kadar ° C ve girdap aralıklarla 60 için ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde jelatin solüsyonu yerleştirin. </li><li> 10 cm&#39;lik Petri kabı içine alt% 10 jelatin solüsyonu, yaklaşık 10 ml dökülür ve 30 dakika katılaşmaya izin. Bu eksplantlar gömmek için bir &quot;pad&quot; oluşturacak. Bu pedler önceden hazırlanmış gün olması ve 4 ° C&#39;de depolanabilir Petri kabı alt kısmında bir ızgara çizmek ve ızgara her kutuya tek eksplantlar aktarmak için bir cetvel kullanın. Rezidüel Pagano çözüm çıkarın ve bir pipet kullanarak, sıcak% 10 jelatin çözeltisi ile her eksplant kapak ve katılaşmaya izin. Her eksplant tamamen çok fazla kerede jelatin sıcak ilave edilmesi ile ped erime vermemeye dikkat ederek, jelatin ile çevrelenmiştir kadar jelatin çözeltisinin yavaş ilavesi devam edin. ~ 1 saat için sertleşmesine jelatin için izin ver. Bir kez münferit sertleştirilmişKitabında eksplantları jelatin küçük bloklar halinde kesip olabilir. Bloklar daha sonra önce bir vibratome ile kesit 24-48 saat süreyle düzeltmek Pagano yayınladığınız-sabittir. </li><li> Jelatin blok Eksplantlarından koku ampul kadar konumlandırılmış ve 100 mikron kalınlığında koronal düzlemde kesitler vardır. Bölümleri toplanan ve saklanan PBS içinde 4 az +% 0,1 sodyum azid ° C immunohistokimyasal işleme kadar. </li><li> Immünohistokimyasal algılama bir 24 gözlü bir levha (kuyu başına 2-3 bölümleri) bölümleri içine aktarılması ile gerçekleştirilir. İlk blok non-spesifik antikor 0.5 ml PBST ekleyerek bağlayıcı + B nazik sallayarak her şey, inkübe 1 hr (PBS +% 0.5 Triton X 100 ve% 2 BSA). Uygun birincil antikor daha sonra PBST + B ile seyreltilir ve çukur başına 0.4 ml RT&#39;de bir gece kuluçka için ilave edilir. Birincil 3X PBS en azından 10 dakika için her bir yıkama ile yıkanmıştır. İkincil antikor ve 2 ug / ml Hoechst 33342 leke nükleer sonra PBST + B ile seyreltilir ve numuneler oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedirnazik sallayarak ile. PBS üç yıkama (her biri 10 dakika) yapılmakta ve daha sonra bölümleri ile% 90 gliserol, 50 mM Tris pH7.4, montaj ortamı kullanarak kaydıraklar üzerinde monte edilmiştir. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz gelişmiş ve deneysel modelini değerlendirdi - Bütün yarımkürede eksplantlar - erken kortikal gelişim çalışması için (E13-E15). Modeli serebral korteks 25,37 tabaka 6 teşkil eksitatör nöron soy göç ve farklılaşma analizi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sistemin prensibi avantajları hazırlık sadeliği ve beyin gelişiminin bu erken, kritik döneminde elektroporasyon, Farmakolojik manipulasyon ve görüntüleme için nöronlara 3) deneysel erişim)) 2 DIV organotipik büyüm...

Gittikçe üretilen nöronların uyumlu proliferasyon, göç ve farklılaştırılması yoluyla memeli serebral korteks formları. Her bir nöron ventriküler zonunda (VZ) doğdu ve kortikal plaka (CP) 1 oluşturan, ara bölge (IZ) içine VZ göç ediyor. Edilir Onlar farklı kortikal alanları geçerken, göç nöronlar gelişmekte doku içindeki ekstraselüler çevre ve diğer hücresel elementler (örneğin radyal glia) bağlıdır göç 2,3 çoklu ekran modları. Kortikal nöronlarda sonra nöronal göç yakalanması ve dendritogenesis 4 çakışık süreçlerinde şekillendirme kortikal plaka üstünde göç tutukla. Kortikal gelişme embriyonik gün ilkel pleksiform tabakada 6 veya preplate (PP), o örter VZ öncü nöron tabakası kurulması yoluyla 11-13 (E11-13) 5 ile başlatılır. MuhtemelSonra katman 6 kortikal nöronların (VZ doğumlu yani ilk kortikal nöronlar) şark onların basmakalıp bir desen somata ve PP 7 içinde ayrı bir tabaka halinde birleşme. Bu olaylar bir yüzeysel marjinal (gelecek kortikal tabaka 1) ve derin bölge subplate hücreleri (geçici kortikal tabaka 7) oluşan ikinci içine preplate bölünmüş. Bu süreç, preplate yarma adlandırılan, serebral korteks 8 gelecekteki büyüme temel bir olaydır. Pek çok genetik mutasyonlar kortikal geliştirme 9 çeşitli yönlerini bozan olduğu tespit edilmiştir. Kortikal gelişimi de olumsuz gibi kokain 10 ve alkol 11 olarak yutulur toksinler tarafından etkiledi olabilir. Gelişimi sırasında ortaya çıkan kortikal malformasyonlar nörolojik bozukluklar (örneğin otizm, şizofreni) muhtemelen katkıda olduğundan, kortikal gelişim için pertürbasyonların ampirik araştırmalar doğasında vardırönemli ly. Genetik ya da toksin etkilerinin hızlı testler izin değil, aynı zamanda beyin gelişimi 12 bu erken dönemde ayırt nöronlar, diğer hücre türleri ve ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki olası etkileşimler koruyan kortikal gelişim eğitim yaklaşımları kurmaya büyük önem taşımaktadır . Dilim eksplantları 13 böyle bir sistemi temin olan ve yaygın olarak tahlil kortikal Nöron gelişme 14-16 için kullanılmıştır. Ancak, dilim deneyleri nöronal migrasyon ve laminasyon muhtemelen gelişmekte olan beyin ve çapa radyal glial iskele çevreleyen meningeal hücreler hasar nedeniyle 17 anormal olabilir dezavantajı muzdarip olabilir. Radyal glial lifler dilimleme bazal lamina kortikal nöron göçü 18 kesinti için önemli bir substrat olarak yerel radyal glial mimarisi bozabilir ve altere kortikal göç yol açabilir. Buna ek olarak slieksplant ced yüzeyleri bu alanlarda ECM normal kompozisyonu değiştirebilir ölü hücrelerin bir bölge sağlar. Daha yeni yaklaşımlar uygun sağlıklı hücre tipleri ve ECM çevrili dilim derin yerleşimli hücrelerin üzerinde kendilerine analizi odaklanmıştır. Ancak, bazı durumlarda bu yeni yaklaşımların dilim nispeten normal iç analizi 19-21 için uygun hale getirilir, böylece orijinal kalın kültürlü dilim fiksasyon sonra kriyo-kesitli veya parafin-kesitli olmasını gerektirebilir. Kültür gibi analiz için sabit dilimlerin sonraki cryosectioning için canlı dilimleri hazırlamak için kesit orijinal vibratome Her ikisi de bu deneyler için çaba ve dikkat çalışma gerektirir. Erken kortikal gelişim çalışmaları için basit, tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz erken kortikal gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için varolan bir dilim yaklaşımlar 13 değiştirdiniz. Biz bir wh geliştirdik65 dakikadaki dönüş ve 16-18 saat 22,23 için izin organotipik büyümeyi sallayarak kültürleri dahil varolan E14 bütün yarımkürede modeline benzer ole yarımkürede eksplant modeli. Bizim yaklaşım, bütün yarımkürede eksplantlar 48 saat süreyle organotipik kortikal büyüme genişletmek için yüksek oksijen kültür atmosferi 21,24 içinde yarı geçirgen bir zar 13 yerleştirilir. Bu yaklaşım, aynı zamanda kortikal nöronlarda geliştirilmesi tutarlı elektroporasyon için olanak sağlar. Embriyolar rahim kaldırılır ve plazmid DNA tanıtmak electroporated ve telencephalon sonra disseke edilir edilir. Her hemisfer izole ve kollajen kaplı filtre üzerinde medial yüzü aşağı yerleştirilir. Eksplant sonra 48 saat, preplate yarma 8 kapsayan bir dönem bir süre için yetiştirilir. Kültür döneminde, L6 nöronlar kortikal plağındaki doğru konumlandırılmış farklılaşmış nöron 25 habercisidir gelişir. Bu dönemde gelişmekte boyuncanöron in vivo olarak buna karşılık gelen hücre karşısına uygun ECM ve hücre türleri tarafından çevrelenmiştir. Bu sistem zaten etanol toksisitesi 26 kat 6 oluşumu ve preplate bölme 7,25 altında yatan hücresel olayları çözmekte değerli kanıtlamıştır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikal gelişme nöronlar ve öncü hücreleri, kan damarları, zarları ve ilişkili ekstrasellüler matriks içeren nöronal olmayan elemanlar arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir. Onlar uygun bir organotipik ortamı sağlamak için, kortikal dilim eksplantlar genellikle nöronal farklılaşma ve gelişimini kontrol bu etkileşimlerin araştırılması için kullanılır. Yararlı olsa da, dilim eksplant modeli aberan hücresel laminasyon ve göç gibi sakıncaları muzdarip olabilir. Burada kortikal dilimleri ve gösterileri tutarlı organotipik göç ve laminasyon daha hazırlamak kolaydır erken kortikal gelişim çalışmaları için bir bütün serebral hemisfer eksplant sistemi rapor. Bu model sistem, erken laminasyon ve göç yollarını, preplate bölme dönemi de dahil olmak üzere, in vitro iki günlük bir süre için normal prospektif kortikal tabaka boyunca altı formları devam edin. Biz o eski utero elektroporasyon (EUEP) geliştirdidorsal medial korteks gelişen nöronlar GFP hedefleme ~% 80 başarı elde yaklaşım. Bütün yarımkürede eksplant modeli elektroporasyon, farmakolojik müdahale ve canlı görüntüleme yaklaşımları için erişilebilir erken kortikal gelişim yapar. Bu yöntem transfeksiyon ve alansal hedefleme tutarlılığı hem artırırken utero elektroporasyon (IUEP) yaklaşımlar gerekli sağkalım cerrahi önler. Bu yöntem nöronal proliferasyon, göç ve farklılaşma deneysel çalışmalar kolaylaştıracaktır.

Embriyonik kemirgen korteks gelişim dönemi boyunca bir enine nörogenetik degrade sergiler, öyle ki yanal neokorteks dorsal medial neokorteks 28 yaklaşık 1 gün daha olgun olduğunu. Katman 6 nöronların toplu böylece lateral korteks bölgesindeki E12 üzerinde (ayrıca Saha 40 5 denir) ve E13 de dorsal medial korteks (ayrıca Tarla 1 5 denir) (S-fazı nihai sergilemek gibi) oluşturulur. Preplate yarma Katman 6 nöron üretimi yaklaşık 1 gün sonra başlar ve böylece ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır<em&gt; Ex utero</em&gt; Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Görüntüleme.  SUNY Upstate Medical University. Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır Ex utero Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.

Video: Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...