1. Thermo Scientific Solaris qPCR Testi Tasarım Algoritma <ol><li> Solaris qPCR prob / primer çiftleri tasarımında kullanılan algoritma ve böylece evrensel bisiklet koşulları sağlayan her bir bileşenin Tm ayarlar. MGB Ortaklık veya küçük oluk bağlama, prob içinde benzer parçaları Tm artırır ve daha fazla tahlil esneklik ve performans için tasarlanmış gibi kısa probları olanak sağlar. Kendi adından da anlaşılacağı gibi, MGBs DNA sarmalını küçük oluk içine sığabilecek bir sınıf antibiyotiklerin. MGBs bir DNA prob sonuna kadar 3 ya da 5 bağlıdırlar. Çözüm, probun FAM muhabiri floresan Eclipse Dark Quencher ile söndürülür. Prob hedef dizisine bağlanır, prob 3-D yapısındaki değişimin güçlü bir floresan sinyal sağlar. DNA prob hedef sırasına Cilt PCR için uygun erime sıcaklığını korurken, son derece özel, kısa probları kullanımına izin verir MGB tarafından stabilize edilir. Böylece, sinyal algılama hedef amplifikasyon tavlama aşamasında oluşur. MGB prob disassociates uzatma adım sırasında, floresan tekrar söndürülür. Prob kesilir, çünkü PCR verimliliği etkilemez. </li><li> Solaris algoritması bir başka özelliği kullanımı Superbases. Superbases bağlar AT istikrarı geliştirmek ve GG guanin zengin dizileri kendine dernek ortadan kaldırmak için bağlayıcı yetenekleri gelişmiş üsler modifiye edilmiştir. Ayrıca, 5 terminus bağlı bitişik fluorophores söndürmeyecek. Bu bazlar hedef dizilerinin kullanılabilirliğini genişletmek için, seçici algoritmasına göre yerleştirilir. Bu mümkün aksi astar ve sondalar tasarımı önlenmiş olur GC zengin bölgeler olarak dizileri, kullanımı mümkün kılar. </li><li> Mümkün olduğunca, Solaris algoritması, hedef site ekzon kavşağı kapsayan bölgelerde içermektedir. Bu kirletici genomik DNA amplifikasyon kaçınarak özgüllük artar. </li><li> Önemlisi, algoritma, aynı zamanda tek bir prob / astar seti ile kaplı olduğu gibi, bilinen tüm ek varyasyonları için bir konsensüs dizisi, tanımlar. Yani, sadece bir testi ilgi belirli bir gen için ihtiyaç vardır. </li><li> Son olarak, Solaris qPCR Testi tasarım algoritması GC içeriği, uzunluğu, Tm, ve homojen nükleotidlerin uzanan dahil olmak üzere, kritik tasarım konuları için çok sıkı parametreleri kullanır. Genomik, transkript, pseudogene: sonuçlanan dizileri analiz özgüllük için 3 farklı veritabanları kullanılarak BLAST. </li></ol> 2. Solaris Reaktifler Alınması <ol><li> Uygun Solaris reaktifleri elde etmek için, ziyaret <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Bir kez web sitesinde &quot;GENEius Ürün Arama&quot; üzerine tıklayın. GENEius ürün arama doğrudan gitmek için, gitmek <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Sorgulama, arama kutusuna tıklayın ve uygun bir hedef organizma seçin. </li><li> GENEius ürün arama, birçok farklı gen tanımlayıcıları işleyebilir. Burada, Ref Seq Katılım, Gen kimliği, Gen Sembol, Gen Açıklama, Sanger kimliği veya Katılım sayısı, ya da bir katalog numarası da dahil olmak üzere ilgi geni bulmak için önerilen Arama terimlerinizi girin. Daha sonra, &quot;Ara&quot; tıklayın. </li><li> Ilgi gen belirlenmesi ve sol tarafta &quot;Select&quot; tıklayın. Bu ilgi gen farklı Thermo Scientific ürünleri gösteren bir pencere açılacaktır. &quot;Ürünler&quot; başlığı altında &quot;qPCR Algılama&quot; sekmesini seçin. </li><li> Başlığı &quot;Solaris Gen İfadesi Testi&quot; altında, bir optimal Solaris prob / astar tahlil tasarlanmış göreceksiniz. Bu bir testi gen hedef bilinen tüm splice varyantları kapsayacaktır. Istenilen miktar seçin. 100, 200, 400 mevcuttur ve 1000 X 25 ul reaksiyonlar (tahlil için sipariş olarak tespit ise, 100 paket boyutu mümkün olmayacaktır). &quot;Sepete Ekle&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Daha sonra, kullanılacak olan termal cycler için uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı makine ile mevcut olan en iyi çalışacak belirlemek için, tıklayın &quot;Master Mix PCR Cycler ile en iyi çalıştığını öğrenin!&quot; </li><li> Menü kullanımı hangi karışımı belirlemek için kullanılan olacak qPCR cycler bul. </li><li> GENEius ürün arama penceresine geri dönün ve uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı, 100, 200, 400, ve 1000 reaksiyon boyutları gelmektedir. &quot;Sepete Ekle&quot; yi tıklatın. </li><li> Önerilen referans genler ve verso cDNA sentezi kitleri de tam bir QRT-PCR analizi için sipariş edilebilir. </li><li> Solaris qPCR reaktifler geldiğinizde, kullanıma hazır olana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Aşağıdaki reaktifler alınan olmalıdır: 200 nm, sequ sağlanan her bir gen spesifik prob 800 nM iki primer içeren 20X çözümprob ve primerler ve 2X bir konsantrasyonda Solaris qPCR Gen İfadesi Master Mix için referans bilgileri. Solaris qPCR Gen İfade Tahliller en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlanan dondurulmasından kaçının. </li></ol> 3. qPCR kurulum <ol><li> QPCR protokolü cDNA ile başlayın. Toplam RNA bir spin kolon yöntemi ile elde edilmelidir. Thermo Scientific Verso cDNA sentezi kiti cDNA oluşturmak için ters transkripsiyon için tavsiye edilir. </li><li> Astar, sondalar, çözülme ve buz üzerinde ana karışımı qPCR için hazırlayın. Ayrıca yanda PCR sınıf su ve real-time PCR hassasiyeti artırabilir, opak beyaz qPCR tabak, var. </li><li> 1) Thermo-Başlangıç ​​DNA polimeraz, Thermoprime DNA polimeraz sıcak bir başlangıç ​​sürümü: master karışımı da dahil olmak üzere, gerçek zamanlı PCR tüm bileşenleri içerir. Bu tür polimeraz reaksiyon ayarlamak sırasında non-spesifik amplifikasyon önlemek için kullanılan ve Etkinleştirme adımını 95 ° C&#39;de 15 dakika gerektirir. 2) Solaris Master karışımı dNTP dTTP Solaris astar / sonda deneyleri ile çalışmak üzere optimize Tescilli reaksiyon tamponu amplifikasyon verimliliğini 3), en üst düzeye çıkarmak için dUTP yerini almıştır. Bu reaksiyon tamponu, reaktif ve plastik arasındaki kontrastı arttırmak için mavi boya içerir. 4) ROX qPCR araç gerektiriyorsa ROX. </li><li> Çözümleri çözülmüş sonra, tüp (vorteks) hafifçe vurarak karıştırın. Reaktif kaybını önlemek için onları aşağı spin. </li><li> Sonra, numune sayısına göre ölçekleme ilgi gen, artı için bir referans gen, reaksiyon karışımı kurmak için 15 ml steril Falcon tüp hazırlar. Üç analiz için standart eğri yöntemi kullanılacaksa, bir şablon kontrolü (NTC) ve standart eğri örnekleri de dahil olmak üzere, her bir örnek için hazırlanmış olabilir çoğaltır öyle ki yeterli hazırlayın. </li><li> 96 plaka üzerinde çalışan her bir örnek için, aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 5 mcL, 0,5 Solaris Primer / Prob seti (20X) ul, ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 25 mcL olacak eklenir. 384 plaka üzerinde çalışan her bir numune için aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 12.5 mcL, Solaris Primer / Prob seti (20x) 1.25 ul ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 10 mcL eklenir olacaktır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plaka uygun kuyular için ana karışımı aktarın. Master miks içerisinde yer alan mavi boya beyaz tabak izleme pipetleme ilerleme yardımcı olacaktır. Ardından, 1-5 mcL cDNA şablon (96 plaka için) veya cDNA şablonu 1-2 mcL (384 plaka) ekleyin. Karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Santrifüj plaka koyun ve bu floresan okumaları ile engel olacak şekilde, herhangi bir kabarcıkları aşağı doğru döndürün. </li><li> Program termal cycler: enzimi ile aktive edilmelidir 95 ° C 15 dakika (1 döngü). Sonra 40 döngü 95 ° C, 15 saniye denatürasyon, tavlama ve uzatma, 60 ° C 60 saniye boyunca. </li><li> QPCR araç plaka yerleştirin. Programı başlatın. </li></ol> Solaris kullanarak Temsilcisi qPCR sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. PCR verimliliği ve r2 değerleri tarafından değerlendirilecek Solaris testleri, çok düşük girdi konsantrasyonlarda bile güvenilir şekilde algılanmasını sağlar . Sentetik RNA Amplikon dizisi veya DNA Amplikon dizisi sentezlenen cDNA On 10 kat dilüsyonlarının sırasıyla F2RL1 veya CDC20, Solaris qPCR Gen İfade Testi kullanarak bir ABI 7900HT enstrüman güçlendirildi. Log-ölçek büyütme eğrileri ve standart eğrileri, verimliliği, r2 değeri, 10 log10 dilüsyonları dinamik aralık ve algılama alt sınırı da dahil olmak üzere her bir testin performansı ile birlikte gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Solaris Tahliller hatta farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar verir. ALDOA ve PPIB yanı sıra hedefleme Kontrolü (NTC) hedefleyen siRNA&#39;lar, 100, 10, 1 ve 0.1 nM son konsantrasyonları HeLa hücrelerine transfekte edildi. Hücreler hasat ve 48 saat tedavi sonrası total RNA izole edildi. Thermo Scientific Verso cDNA Sentezi Kit kullanılarak cDNA sentezlendi. Roche LightCycler 480 (384-iyi) platformu üzerinde Solaris qPCR Gen İfade Tahliller ALDOA, PPIB ve GAPDH tespiti için coğrafi olarak ayrılmış iki laboratuvarlarda cDNA bir kısım güçlendirildi. Demonte ΔΔCq (GAPDH referans gen ve NTC-tedavili hücrelerde normalize) yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Demonte ile aynı düzeyde, hem de araştırmacılar her iki site arasındaki gen hedefleri hem için gösterildi.

Bu makalenin yazarları, Thermo Scientific çalışanları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Tahliller qPCR analiz yapmak için basit, gelişmiş bir yöntem sağlar. MGB teknolojisi ve Superbases içeren, yüksek darlığı algoritması kullanarak, bu astar ve prob setleri qPCR deneylerin doğruluk ve sağlamlık en üst düzeye çıkarmak. Bir astar ve prob seti, belirli bir gen bilinen tüm ek varyantları tanır. Hedef site, mümkün olduğunca bu genomik DNA amplifiye değildir sağlamak için ekzon kapsayan bölgeler, içerir. Bu özellikler mümkün karmaşık deneyler gerçekleştirmek için gereken zaman miktarını büyük ölçüde azaltarak, aynı anda çok sayıda örnekleri çalıştırmak için. Ana karışımı mavi olduğundan, beyaz opak pipetleme takip kaybetmeden, qPCR duyarlılığını artırmak tabak, kullanmak mümkündür. Hep birlikte ele alındığında, Solaris qPCR Testi tasarım özellikleri bu romanı qPCR tahlil, hem özel ve hem de sağlam bir yüksek performanslı, henüz basit bir tahlil yapmak.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Solaris qPCR Gen İfade Testi, testin duyarlılığı ve hassasiyeti korurken qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış primer / prob seti bir roman türüdür. Bu primer / prob setleri&gt;% 98, daha önce mevcut teknolojilerin insan ve fare genomlarından ve özellik önemli iyileştirmeler için önceden tasarlanmış. Bu gelişmeler Thermo Scientific biyoinformatik uzmanları tarafından geliştirilen yeni tasarım algoritması sayesinde mümkün olmuştur. Birçok kullanışlı özellikleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR performans sürecini kolaylaştırmak için Solaris qPCR Testi içine dahil edilmiştir. İlk olarak, protokol sık istihdam alternatifleri benzer, bu yüzden qPCR sırasında kullanılan yöntemleri aşina olmak için muhtemeldir. İkinci olarak, ana karışımı, mavi izlemek için qPCR reaksiyonlar daha kolay ayar yapar. Üçüncü olarak, termal döngü koşulları mümkün bir anda birçok örnekleri çalıştırmak ve hata potansiyelini azaltarak, (genler), tüm testleri için aynıdır. Son olarak, prob ve primer sırası bilgilerinin, yayın sürecinin basitleştirilmesi sağlanır. Burada, sipariş web sitesi (www.thermo.com / solaris) ve standart eğri yöntemi kullanılarak qPCR gerçekleştirmek için Solaris reaktifleri kullanmak bulundu GENEius ürün arama özelliğini kullanarak uygun Solaris reaktifleri elde etmek için nasıl gösterilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solaris qPCR Gen İfadesi Tahlilleri testinin özgüllük ve sağlamlık ödün vermeden qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış yeni önceden tasarlanmış qPCR primer / prob kombinasyonları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.6K Görüntüleme.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biyoloji

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...