Name: cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Not: steril kültür koşullarını korumak için, bu protokol tüm prosedürlerin steril laboratuar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilen ve laminer akış kaputu altında yürütülmelidir. Başlamadan önce, herhangi bir ortam, 37 dengelenmiş olduğundan emin ° C ve uygun gazladı. Geltrex kaplı Kültür Yemekleri hazırlanması Not: CELLstart kaplı kültür kaplarına kullanmak için eke bakınız. <ol><li> Çözülme Geltrex yavaş yavaş 2-8 (1 mL) ° C tüp ve Knockout D-MEM/F-12 99 ml 1:100 onu sulandırmak. Çözüm hafifçe karıştırın. Not: Bazı iPS hücre hatları, optimum büyüme için farklı bir Geltrex seyreltme gerekebilir. Alternatif dilüsyonları için eke bakınız. </li><li> Her kültürün çanak tüm yüzeyi Geltrex çözüm (35 mm yemek için 1 ml, 60 mm yemek için 1.5 ml) ile kaplayın. </li><li> Kurumasını önlemek ve 37 yemekleri az 1 saat inkübe Parafilm ° C ile her tabak sızıntısını önleyiniz Not: Bu noktada, 1 aya kadar 4 ° C&#39;de Geltrex kaplı kültür kaplarına saklayabilir. Geltrex kurumasını önlemek için her tabak Parafilm Seal. </li><li> Kullanmadan önce, bir laminer akış kaputu Geltrex kaplı yemekler aktarmak ve onları oda sıcaklığında (yaklaşık 1 saat) gelmesini sağlar. </li></ol> Komple nakavt SR Besleyici Ücretsiz Orta hazırlanması <ol><li> 10 mcg / ml Temel FGF çözüm, 1 ml hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. -20 ° C&#39;de kısım çözüm ve mağaza, 6 aya kadar. <table border="0"><tbody><tr><td> Temel FGF </td><td> 10 mikrogram </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 mcL </td></tr></tbody></table> Not: BSA aynı konsantrasyonda HSA veya Knockout SR ile ikame edilebilir. </li><li> 50 ml 2 mg / ml Dispase çözüm hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. Filtre 4 çözüm ve mağaza ° C 2 haftaya kadar sterilize. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Besleyici-Free (KSR-FF) Tam nakavt SR 100 mL hazırlamak için aseptik aşağıdaki tabloda listelenen bileşenleri birleştirmek. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Stok Konsantrasyon </td><td> Final Konsantrasyon </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Nakavt DMEM/F12 (Kat. No. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Kat. No: 35.050-061) </td><td> 200 mm </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR (Kat. no: 10.828-028) </td><td> - </td><td> % 20 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR-GFC (Kat. no. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat. No. PHG0024). </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / ml </td><td> 200 mcL </td></tr></tbody></table> Bir haftaya kadar 2-8 ° C&#39;de KSR-FF orta saklayabilir. </li><li> Sıcaklık ve gazlar için tam orta pre-değişikti hemen önce, aseptik 0.1 mM son konsantrasyon için gerekli 2 merkaptoetanol hacmi (55 mM stok konsantrasyonu) ekleyin. Örneğin, 100 ml KSR-F hazırlamak içinF orta, 2-mercaptoethanol (1:550 dilüsyon) Alternatif olarak 55 mM 182 mcL eklemek, 2-merkaptoetanol 1X tamamlanan orta eklenir ve bir haftaya kadar 2-8 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Donma / Kriyoprezervasyon Orta hazırlanması Kriyoprezervasyon orta iki ortam oluşur; Donma Orta ve Donma Orta B. farklı zamanlarda hücreleri eklenir ve kalır ayrılmalıdır. Her Kriyoprezervasyon Orta toplam hacminin% 50 ihtiyaç vardır. Donmuş gibi her flakon için gerekli Kriyoprezervasyon Orta toplam hacim 1 ml. HESC% 90 konfluent 60mm çanak hESC banka 2 şişeleri kriyoprezervasyon medya için kullanılabilir. Tutarı düşmek sağlamak için ekstra 2-5ml her Donma Orta yeterli hacmi hazırlayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Donma Orta A (son hacmi% 50): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Donma Orta B (son hacmi% 50): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> % 20 DMSO </td></tr></tbody></table> Örnek: 20 şişeleri hücre dondurma iseniz, Kriyoprezervasyon Orta 20ml gerekecektir. 24mL Kriyoprezervasyon Orta toplam tutarı düşmek için 4ml ekleyin. Donma Orta 12ml gerekecektir anlamına gelir (24mL% 50) ve Donma Orta B (24mL% 50), 12ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Donma Orta A (12 ml): </td><td> 6 ml DMEM/F12 </td><td> 6 ml KSR </td></tr><tr><td> Donma Orta B (12 ml): </td><td> 9.6 mL DMEM/F12 </td><td> 2.4 mL DMSO </td></tr></tbody></table> Kriyoprezervasyon Orta nihai bileşimi% 65 DMEM/F12,% 25 KSR, ve% 10 DMSO. Dondurularak iPSCs <ol><li> 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Tablo 1below gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız. </li><li> Bir pipet kullanarak kültür damarı harcanan orta aspire ve hücrelerin D-PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yavaşça kültür damarı (örneğin, 60 mm kültür çanak başına Dispase çözüm 1 ml) önceden ısıtılmış Dispase çözüm ekleyin. Tüm hücre yüzeyinde kat Swirl kültür damarı. </li><li> Kültür damarı 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Inkübatör geminin çıkarın, Dispase çözüm aspirat ve D-PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın. </li><li> Hücrelerin, hücre kazıyıcı kullanarak kültürü çanak yüzeyinden hafifçe kazıyın ve 15 mL steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak. </li><li> Nazikçe müstakil olmayan herhangi bir hücre &quot;püskürtme&quot;, KSR-FF ile iki kez kültür çanak durulayın Havuz, 15 mL tüp hücreleri orta durulayın. </li><li> Tüp, oda sıcaklığında pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatantı aspirat ve atın. </li><li> Cryovials yeterli miktarda hazırlayın. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır. </li><li> Yavaşça tam [tüp alttan hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml serolojik pipet kullanarak] hücre pelletini yerinden ve Donma Orta A. hücreleri yeniden askıya tüp fiske. Hafifçe karıştırın hücre süspansiyonu dönen kümeleri tek tip süspansiyon ardından, bir damla akıllıca bir şekilde, eşit miktarda Donma Orta B ekleyin. Not: Bu noktada, hücrelerin DMSO ile temas ve çalışma verimli bir şekilde yapılmalıdır. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır. </li><li> Her cryovial hücre süspansiyonu kısım 1 ml. </li><li> Hızla [hızla dondurma] Mr Frosty şişeleri yer ve -80 ° C gecede transfer. </li><li> ° C - -80 geceleme depolama sonra, uzun süreli depolama için bir sıvı nitrojen tankı hücreleri aktarmak. </li></ol> iPSC flakon çözülme ve hücre kurtarma Not: KSR-FF KSR-MEF-klimalı içeren orta veya besleyiciler ile kullanmak için KSR orta ile değiştirilebilir. Medya hazırlanması için talimatlar için eke bakınız. KSR-FF orta Pre-sıcak 10 ml, 50 ml tüp içinde. <ol><li> Geltrex kaplı yemekler sadece kaplama önce oda sıcaklığına uygun miktar dengelenmesi ve yemeklerinden herhangi bir sıvı aspirer hücreleri. </li><li> HESC Sıvı Azot Depolama Tankı (veya iPSC) flakon dikkatlice çıkarın. </li><li> Sadece küçük bir dondurulmuş yığın flakon kalana kadar hızla 37 ° C su banyosunda hücreler dondurulmuş flakon Çözülme. </li><li> % 70 ile dekontamine ve steril doku kültürü kaputu transfer izopropanol flakon Sprey. </li><li> Aseptik olarak 5 ml pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp içine flakon tüm içeriğini aktarmak. </li><li> KSR-FF 1 ml Flakon durulayın ve 15 ml santrifüj tüpüne ekleyin. </li><li> Yavaşça, KSR-FF 4 mL, 15 mL konik tüp hücrelerin damla-bilge ekleyin. Orta eklerken, hücreler hafifçe karıştırın tüp ileri ve geri hareket ettirin. (Bu hücrelerin ozmotik şok azaltır). </li><li> 15 ml tüp, oda sıcaklığında 2 dakika 1000rpm (200 x g) hücre süspansiyonu ile santrifüjleyin . </li><li> Dikkatlice aspire ve hücre pelletini bozmadan süpernatantı atın. </li><li> Önceden ısıtılmış KSR-FF hücre pelet (örneğin 4mL/60 mm çanak) 5 ml pipet kullanarak hücrelerin hücre pelletini tamamen dağınık olduğu kadar yavaşça yukarı aşağı pipet ve yeniden askıya aldı. Canlılığı% 70&#39;den az ise% 70 daha fazla bir canlılığı bekleniyor, ancak, bu hücreler için izdiham ulaşmak için daha uzun sürebilir. </li><li> Aynı pipet kullanarak, hücre süspansiyonu oda sıcaklığında ön dengelenmiş Geltrex kaplı kültürü çanak açılır akıllıca aktarın. </li><li> Havada% 4 ila 6 CO 2 nemlendirilmiş bir atmosfer ile 37 ° C inkübatör kültür çanak yerleştirin. Kuzey güney, doğu batı desen hücreler eşit olarak dağıtmak için dikkatlice girdap gemi. </li><li> Yavaşça kültür tabak sıvı değiştirmek için 24 saat sonrası çözülme ve hücre enkaz kaldırmak için ve bundan sonra çanak konfluent yaklaşık% 70-80 kadar taze besin sağlamak için günlük. IPS hücreleri devam eden kültür ve Pasajlanması için, &quot;İnsan iPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek kullanarak Besleyici Ücretsiz Kültür ve Pasajlanması Besleyici-Alerjik Orta&quot; başlıklı protokol bakın </li></ol> Beklenen Sonuçlar Hücreleri önce kriyoprezervasyon konfluent kabaca% 70-80 olmalıdır. Kıvrık ve koloni kenarları boyunca koloniler katlayarak sindirim sonuçları Dispase. Sonra hasat hücrelerin dondurulması medyada küçük kümeleri olarak dondurulur. Flakon çözülmüş sonra, hücreler kurtarmak ve küçük kümeleri olarak önceden kaplı çanak eklemek. Bunlar hızla konfluent 5-6 gün içinde bir çanak lider büyür. Tablo 1 - Önerilen Hacimleri <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 35mm Bulaşık </td><td> 60mm Bulaşık </td><td> 100mm Bulaşık </td></tr><tr><td> Komple nakavt SR orta </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Geltrex Çözüm </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> Durulama için D-PBS </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">ek görmek için tıklayınız</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Life Teknolojileri tarafından istihdam edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol freezing containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

2006 yılında, insan ve fare fibroblastlar dikkat çekici embriyonik kök hücrelere benzer nitelikleri ile 1-3 iPS hücreleri üretmek yeniden olabilir keşif pluripotent hücrelerin hücre tedavisi, ilaç keşfi ve temel araştırmalar için değerli bir yeni kaynak yaratmıştır . Gibco medya ve reaktifler yıllardır pluripotent kök hücre araştırmaları ön planda olmuştur. DMEM Nakavt Nakavt Serum Değiştirme ile desteklenmiş, embriyonik kök hücre büyümesi ve şimdi iPS hücre kültürü 3-9 için tercih edilen medya . Bu altın standart medya sistemi artık Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyli ilavesi ile besleyici ücretsiz kültür kullanılabilir. Geleneksel insan ES ve iPS hücre kültürü yöntemleri, fare veya insan fibroblast besleyici katmanları veya besleyici klimalı ortamı gerektirir. Bu kültür yöntemleri ölçekli, emek-yoğun, sert ve tanımlanmamış durumlar nedeniyle farklılaşmamış kalça hücreleri korumak için zordur. Invitrogen Nakavt SR hala korurken, kalça ve embriyonik kök hücre kültürlerinde kolaylıkla geçiş için besleyici ücretsiz izin Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyl geliştirdi.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Görüntüleme.  Life Technologies.  中文 日本語 

Video: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Biyoloji

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Gelişim Biyolojisi

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Biyomühendislik

Otomatik Kültür Sistemi Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Tekrarlanabilirlik için iPSC Kültürünü Otomatikleştirme 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli