הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי. הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות הערה: ראה נספח לשימוש CELLstart מנות תרבות מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ&quot;ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ&quot;ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון. הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ&quot;ל למנה 35 מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;ל למנה 60 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה). </li></ol> הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 מ&quot;ל של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יסוד FGF </td><td> 10 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 50 מ&quot;ל של תמיסת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 100 מ&quot;ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> במלאי ריכוז </td><td> הריכוז הסופי </td><td> נפח </td></tr><tr><td> נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (קט &#39;מס&#39; 35050-061) </td><td> 200 מ&quot;מ </td><td> 2 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> bFGF (לא קט. PHG0024). </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ&quot;ל של KSR-Fבינוני F להוסיף μL 182 מ&quot;מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. </li></ol> הכנת הקפאה / cryopreservation בינוני בינוני cryopreservation מורכב משני התקשורת; בינוני מקפיא A ו-B בינוני הקפאת הם הוסיפו לתאים בזמנים שונים חייבים להישאר מופרדים. הם כל אחד 50% מהנפח הכולל של בינונית cryopreservation הצורך. סך היקף בינוני cryopreservation שצריך הוא 1 מ&quot;ל על כל בקבוקון להיות קפוא. צלחת 90% 60mm ומחוברות של hESC יכול לשמש לבנק 2 בקבוקונים של hESC בתקשורת cryopreservation. הכן נפח מספיק בינונית כל הקפאה עם תוספת 2-5 מ&quot;ל כדי להבטיח overage. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (50% של נפח סופי): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (50% של נפח סופי): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> דוגמה: אם אתה מקפיא 20 בקבוקונים של תאים, תצטרך 20mL של cryopreservation בינוני. הוסף 4mL עבור overage עבור סכום כולל של בינונית cryopreservation 24mL. כלומר, תצטרך 12mL של הקפאת בינוני (50% 24mL) ו 12mL של B בינוני הקפאה (50% 24mL). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בינוני הקפאה (12 מ&quot;ל): </td><td> 6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 6 מ&quot;ל KSR </td></tr><tr><td> בינוני B מקפיא (12 מ&quot;ל): </td><td> 9.6 מ&quot;ל DMEM/F12 </td><td> 2.4 מ&quot;ל DMSO </td></tr></tbody></table> ההרכב הסופי של המדיום cryopreservation הוא 65% DMEM/F12, KSR 25% ו 10% DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק &#39;for15 ° C אמבט מים. עיין 1below טבלה לקבל פרטים על אמצעי האחסון הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ&quot;ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות &quot;ריסוס את&quot; כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כמות מספקת של cryovials. ברגע שהתאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפיצי בעדינות את הצינור, באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור מחדש להשעות את התאים א בינוני מקפיא [על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות 5 מ&quot;ל סרולוגיות פיפטה]. בעקבות השעיה אחיד של גושים, מוסיפים נפח שווה של B בינוני מקפיא אליו, בצורה טיפה חכם, בעוד בעדינות מתערבל ההשעיה תא לערבב. הערה: בשלב זה, התאים נמצאים בקשר עם DMSO, עבודה חייב להתבצע ביעילות. לאחר התאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של השעיה על התא cryovial כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום בקבוקונים ב פרוסטי מר [במהירות להקפיא] ולהעביר אותו -80 מעלות למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אחסון ולינה -80 ° C, להעביר את התאים מיכל חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך. </li></ol> iPSC להפשיר בקבוקון והתאוששות תא הערה: KSR-FF עשוי להיות מוחלף עם המדיום MEF ממוזג KSR המכילים, או בינוני KSR לשימוש עם המאכיל. ראו נספח הוראות להכנת אמצעי התקשורת. טרום חמים 10 מ&quot;ל של מדיום KSR-FF בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הכמות המתאימה של Geltrex מצופה הכלים בטמפרטורת החדר לשאוב כל נוזל הכלים לפני ציפוי אותךr תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את hESC (או iPSC) בקבוקון מטנק חנקן נוזלי אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון קפוא להפשיר במהירות של תאים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים, רק עד נתח קפוא קטן נשאר הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס בקבוקון עם 70% isopropanol כדי לטהר אותו ולהעביר אותו את מכסה המנוע רקמה סטרילית תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את כל תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבקבוקון עם 1 מ&quot;ל של KSR-FF ולהוסיף את זה צינור 15 צנטריפוגות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט, להוסיף 4 מ&quot;ל של KSR-FF נפתח חכם התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. בעוד הוספת בינוני, בעדינות להזיז את הצינור הלוך ושוב לערבב את התאים. (פעולה זו מפחיתה את הלם אוסמוטי על התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 15 מ&quot;ל עם ההשעיה התא 1000rpm (200 x ז) ​​למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התא גלולה מראש חימם KSR-FF (למשל 4mL/60 צלחת מ&quot;מ) בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה עד התא גלולה מפוזרת באופן מלא. הכדאיות של יותר מ 70% צפויה, אולם אם הכדאיות הוא פחות מ -70%, זה עלול לקחת זמן רב יותר עבור התאים להגיע למפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה אותו, להעביר את ההשעיה תא נפתח חכם צלחת Geltrex מצופה תרבות טרום equilibrated לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה, עם אווירה humidified של CO 4-6% 2 באוויר. בזהירות מערבולת כלי בצפון לדרום, ממזרח למערב דפוס כדי לפזר באופן שווה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות נוזל לשנות את המנה תרבות 24 שעות לאחר ההפשרה ואת יום לאחר מכן להסיר את פסולת התא כדי לספק מזון טרי עד המנה הוא כ 70-80% ומחוברות. עבור התרבות המשך passaging של תאים iPS שלך, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת &quot;מזין ללא התרבות Passaging של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני&quot; </li></ol> תוצאות צפויות התאים צריכים להיות בערך 70-80% ומחוברות לפני cryopreservation. Dispase תוצאות עיכול להתכרבל מתקפלים המושבות בשולי המושבה. לאחר קצירת התאים הם קפואים כמו גושים קטנים בתקשורת cryopreservation. לאחר הבקבוקון הוא מופשר, תאים להתאושש לצרף צלחת מצופה מראש כמו גושים קטנים. הם גדלים במהירות המוביל צלחת ומחוברות בתוך 5-6 ימים. לוח 1 - כרכים מומלצים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> 35mm דיש </td><td> 60mm דיש </td><td> 100mm דיש </td></tr><tr><td> השלם בנוקאאוט SR בינוני </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Geltrex פתרון </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td><td> 4-5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 3-4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> D-PBS עבור שטיפה </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">לחץ כאן כדי לראות את התוספתן</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי החיים טכנולוגיות המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol freezing containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS 1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי. התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים 3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה. ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך מעבר בקלות הירכיים ותרבויות הס תא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Life Technologies.  中文 日本語 

Video: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Developmental Biology

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Bioengineering

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived chimeric antigen receptor (CAR) expressing NK cells has emerged as a promising avenue for "off the shelf" cancer immunotherapy. Here, we utilized an NK cell-optimized CAR construct that includes the transmembrane domain of NKG2D, the 2B4 co-stimulatory domain, and the CD3&#950; signaling domain, which has been demonstrated to stimulate robust antigen-specific NK cell-mediated antitumor activity. The use of iPSCs for CAR NK cell generation offers several advantages, including homogenous CAR expression, scalability, reproducibility, and the potential for clinical application. This detailed step-by-step protocol from cell engineering to differentiation enables the generation of NK cell-optimized iPSC-derived CAR-expressing NK cells, providing a standardized and targeted cancer immunotherapy with improved antitumor activity and highlighting their potential as a promising treatment option for various malignancies.

Here, we present a method to differentiate and expand human iPSC-derived chimeric antigen receptor (CAR)-expressing natural killer cells with improved killing against various malignancies. This protocol demonstrates the differentiation and expansion of natural killer (NK) optimized iPSC-derived CAR-NK cells and the measurement of antitumor activity against various tumor cell lines.

התקדמות בתאי הרג טבעיים המבטאים קולטני אנטיגן כימריים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...