ملاحظة : للحفاظ على ثقافة ظروف معقمة ، وتتم كافة الإجراءات في هذا البروتوكول على استخدام الممارسات المختبرية التي أجريت معقمة وتحت غطاء تدفق الصفحي. قبل البدء ، تأكد من أن أية وسيلة إعلامية غير المتوازنة إلى 37 درجة مئوية ، وبالغاز بشكل مناسب. إعداد أطباق الثقافة Geltrex المغلفة ملاحظة : انظر الملحق لاستخدام الأطباق CELLstart الثقافة المغلفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد أنبوب واحد من Geltrex (1 مل) ببطء في 2-8 درجة مئوية ، وتمييع 1:100 في 99 مل من خروج المغلوب D-MEM/F-12. مزيج الحل بلطف. ملاحظة : بعض خطوط الخلايا المحفزة قد يتطلب التخفيف Geltrex مختلفة لتحقيق النمو الأمثل. انظر التذييل لالتخفيفات البديلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي السطح كله من كل صحن الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل عن طبق 35 ملم ، 1.5 مل عن طبق من عيار 60 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم كل طبق مع Parafilm لمنع جفاف واحتضان الأطباق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة : عند هذه النقطة قد تكون لتخزين الأطباق الثقافة Geltrex المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع Geltrex من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام ونقل الأطباق Geltrex المغلفة إلى غطاء تدفق الصفحي ، والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 1 ساعة). </li></ol> إعداد وحدة تغذية متكاملة خالية من ريال خروج المغلوب متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 1 مل من 10 ميكروغرام / مل حل جمعية جيل المستقبل الأساسية ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جمعية جيل المستقبل الأساسية </td><td> 10 ميكروغرام </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> جيش صرب البوسنة 10 ٪ </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> ملاحظة : يمكن أن تكون بديلا BSA HSA مع ريال أو خروج المغلوب في نفس التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحضير 50 ​​مل من 2 الحل Dispase ملغ / مل ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. فلتر تعقيم وتخزين الحل في 4 درجات مئوية لتصل الى 2 أسابيع. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 ملغ </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 مل </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير 100 مل ريال خروج المغلوب كاملة خالية من الطاعم (KSR - FF) الجمع بين جو معقم و مطهر المكونات المذكورة في الجدول أدناه. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> الأسهم تركيز </td><td> التركيز النهائي </td><td> حجم </td></tr><tr><td> خروج المغلوب DMEM/F12 (الفئة رقم 12660-012) </td><td> -- </td><td> 1X </td><td> 76.8 مل </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (الفئة رقم 35050-061) </td><td> 200 ملي </td><td> 2 ملم </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب ريال (لا Cat.. 10828-028) </td><td> -- </td><td> 20 ٪ </td><td> 20 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب SR - GFC (الفئة رقم A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> bFGF (الفئة رقم PHG0024). </td><td> 10 ميكروغرام / مل </td><td> 20 نانوغرام / مل </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> قد قمت بتخزين المتوسطة KSR - FF في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل لحظات ما قبل equilibrating المتوسط ​​كاملة لدرجة الحرارة والغازات ، إضافة جو معقم و مطهر حجم المطلوب من 2 المركابتويثانول (55 ملي تركيز الأسهم) لتركيز نهائي 0.1 ملم. على سبيل المثال ، لتحضير 100 مل من KSR - FF المتوسطة إضافة ميكرولتر 182 من 55 مم 2 المركابتويثانول (1:550 تمييع) بدلا من ذلك ، قد تضاف 2 المركابتويثانول لإكمال المتوسطة 1X وتخزينها في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد. </li></ol> إعداد التجميد / الحفظ بالتبريد متوسطة وسيلة الحفظ بالتبريد يتكون من اثنين من وسائط الإعلام ؛ متوسطة تجميد وتجمد باء متوسطة وأضافوا إلى الخلايا في أوقات مختلفة ، ويجب أن تبقى منفصلة. هم كل حاجة 50 ٪ من إجمالي حجم متوسط ​​الحفظ بالتبريد. إجمالي حجم متوسط ​​الحفظ بالتبريد المطلوب هو 1 مل لكل فيال أن تكون مجمدة. ويمكن استخدام 90 ٪ من صحن 60mm متموجة hESC لقوارير (2) مصرف hESC في وسائل الحفظ بالتبريد. إعداد حجم ما يكفي من كل متوسطة التجميد مع 5mL - 2 إضافية لضمان الفائض. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تجميد متوسطة (50 ٪ من الحجم النهائي) : </td><td> 50 ٪ DMEM/F12 </td><td> 50 ٪ KSR </td></tr><tr><td> تجميد باء متوسطة (50 ٪ من الحجم النهائي) : </td><td> 80 ٪ DMEM/F12 </td><td> 20 ٪ DMSO </td></tr></tbody></table> على سبيل المثال : إذا كنت تجميد 20 قارورة من الخلايا ، وسوف تحتاج 20mL متوسطة من الحفظ بالتبريد. إضافة 4mL عن الفائض عن ما مجموعه متوسطة 24mL الحفظ بالتبريد. هذا يعني أنك سوف تحتاج 12mL من تجميد متوسطة (50 ٪ من 24mL) و12mL باء متوسطة التجميد (50 ٪ من 24mL) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تجميد متوسطة (12 مل) : </td><td> 6 مل DMEM/F12 </td><td> 6 مل KSR </td></tr><tr><td> تجميد باء متوسطة (12 مل) : </td><td> 9.6 مل DMEM/F12 </td><td> 2.4 مل DMSO </td></tr></tbody></table> التشكيل النهائي للمتوسطة الحفظ بالتبريد هو 65 ٪ DMEM/F12 ، KSR 25 ٪ ، وDMSO 10 ٪. Cryopreserving iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع إلى الجدول 1below للحصول على تفاصيل بشأن الكميات المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​أمضى من السفينة الثقافة باستخدام ماصة ، وشطف الخلايا مرتين مع مد برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف قبل تحسنت Dispase حل للسفينة الثقافة (على سبيل المثال ، 1 مل من محلول Dispase في صحن الثقافة من عيار 60 ملم). دوامة السفينة الثقافة معطف سطح الخلية بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سفينة الثقافة على 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السفينة من الحاضنة ، نضح الحل Dispase ، ويغسل بلطف الخلايا مع مد برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف خلايا قبالة سطح الطبق الثقافة باستخدام مكشطة الخلية ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15mL العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأطباق الثقافة مرتين مع KSR - FF ، بلطف &quot;رش قبالة&quot; أي الخلايا التي لم منفصلة. تجمع شطف المتوسطة مع الخلايا في الأنبوب 15mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية وتخلص منه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد وجود كمية كافية من cryovials. مرة واحدة الخلايا على اتصال مع DMSO ، ينبغي aliquoted أنهم والمجمدة خلال 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار بلطف الأنبوب ، لإزاحة الكامل لبيليه الخلية من أسفل الأنبوب واعادة تعليق الخلايا في ألف متوسطة التجميد [من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا باستخدام 5 مل ماصة المصلية]. بعد تعليق موحد للكتل ، إضافة حجم مساو باء متوسطة تجميد إليها ، بطريقة حكيمة انخفاض ، في حين يحوم بلطف تعليق الخلية إلى المزيج. ملاحظة : عند هذه النقطة ، والخلايا على اتصال مع DMSO ، ويجب أن يتم تنفيذ العمل بكفاءة. مرة واحدة الخلايا على اتصال مع DMSO ، ينبغي aliquoted أنهم والمجمدة خلال 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل من تعليق في كل خلية cryovial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان بسرعة قارورة في متجمد السيد [لتجميد بسرعة] وتحويلها إلى -80 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المبيت في تخزين -80 درجة مئوية ، ونقل الخلايا إلى خزان النتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> iPSC أذاب فيال والانتعاش الخلية ملاحظة : يمكن استبدال KSR - FF المتوسطة مع MEF مكيفة KSR المحتوية على ، أو متوسطة KSR للاستخدام مع مغذيات. انظر الملحق للحصول على إرشادات لإعداد وسائل الإعلام. قبل الدافئة 10ML من KSR - FF المتوسطة في أنبوب 50 مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن كمية مناسبة من Geltrex المغلفة أطباق لدرجة حرارة الغرفة ونضح أي السائل من الأطباق قبل الطلاء لكخلايا ص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية hESC (أو iPSC) قنينة من النيتروجين السائل خزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة قارورة من الخلايا المجمدة في حمام المياه 37 درجة مئوية ، حتى مجرد قطعة صغيرة مجمدة لا يزال في القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قنينة رذاذ مع 70 ٪ لتطهير الأيزوبروبانول عليها وتحويلها إلى غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جو معقم و مطهر محتويات القارورة في أنبوب 15 مل المخروطية باستخدام ماصة 5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف فيال مع 1 مل من KSR - FF وإضافة إلى هذا الأنبوب 15 مل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ، إضافة 4 مل من KSR - FF على الخلايا المخروطية في الأنبوب 15mL قطرة من الحكمة. في حين اضاف المتوسط ​​، حرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا لمزج الخلايا. (وهذا يقلل من صدمة التناضحي إلى الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل مع تعليق خلية في 1000rpm (200 × ز) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلية بيليه في مرحلة ما قبل حرارة KSR - FF (مثل الطبق 4mL/60 مم) باستخدام ماصة 5 مل ماصة والخلايا برفق صعودا ونزولا حتى فرقت تماما الخلية بيليه. ومن المتوقع أن بقاء أكبر من 70 ٪ ، ولكن إذا كان بقاء أقل من 70 ٪ ، قد يستغرق وقتا أطول للخلايا للوصول إلى نقطة التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نفسه ، نقل الخلية إلى تعليق الطبق الثقافة Geltrex المغلفة قبل معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة قطرة من الحكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية ، مع ترطيب الجو من ثاني أكسيد الكربون ٪ 04 حتي 06 فبراير في الهواء. سفينة بعناية في دوامة من الشمال إلى الجنوب ، من الشرق إلى الغرب إلى نمط توزيع بالتساوي الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف السوائل تغيير ثقافة طبق لمدة 24 ساعة بعد ذوبان الجليد ، وبعد ذلك يوميا لإزالة الأنقاض والخلية لتوفير المواد الغذائية الطازجة حتى طبق ما يقرب من 70-80 ٪ متموجة. للثقافة واصلت الركض من خلايا الجذع لديك ، لدينا تشير إلى بروتوكول بعنوان &quot;تغذية خالية من الثقافة والركض من خلايا الجذع الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية تبديل المصل الطاعم خالية المتوسطة&quot; </li></ol> النتائج المتوقعة وينبغي أن تكون الخلايا تقريبا 70-80 ٪ متموجة قبل الحفظ بالتبريد. Dispase النتائج الهضم في الشباك حتى وقابلة للطي من المستعمرات على طول هوامش مستعمرة. بعد حصاد الخلايا المجمدة على أنها كتل صغيرة في وسائل الحفظ بالتبريد. بمجرد إذابة القارورة ، وخلايا استرداد ونعلق على طبق قبل المغلفة وكتل صغيرة. أنها تنمو بسرعة مما يؤدي إلى صحن متكدسة في 5-6 أيام. الجدول 1 -- وحدات التخزين الموصى بها <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> 35mm الطبق </td><td> 60mm الطبق </td><td> 100mm صحن </td></tr><tr><td> استكمال خروج المغلوب ريال المتوسطة </td><td> 2 مل </td><td> 4 مل </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> Geltrex الحل </td><td> 1 مل </td><td> 1.5 مل </td><td> 4-5 مليلتر </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0.5 مل </td><td> 1 مل </td><td> 3-4 مليلتر </td></tr><tr><td> D - PBS للشطف </td><td> 2 مل </td><td> 4 مل </td><td> 10 مل </td></tr></tbody></table> الرجاء <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">انقر هنا للاطلاع على التذييل</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

ويعمل واضعو هذه المادة التي تنتج تقنيات الحياة الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>12660-012</td>
<td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td>
</tr>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A10580-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &mu;g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PHG0024</td>
<td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>17105-041</td>
<td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td>
</tr>
<tr>
<td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A10480-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO, 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JT Baker</td>
<td>JT9224-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Tissue Culture Hood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette-Aid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liquid nitrogen storage tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropanol freezing containers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 mL Cryovials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

وقد خلق هذا الاكتشاف في 2006 بأن من الممكن إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان والفأر على توليد خلايا الجذع 1-3 بصفات متشابهة بشكل ملحوظ على الخلايا الجذعية الجنينية مصدرا قيما جديدة من الخلايا المحفزة لاكتشاف المخدرات ، والعلاج الخلوي ، والبحوث الأساسية. وقد GIBCO سائل الإعلام والكواشف في طليعة أبحاث الخلايا الجذعية المحفزة لسنوات. خروج المغلوب DMEM تستكمل مع تبديل خروج المغلوب المصل هو وسائل الإعلام المفضلة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية والثقافة الآن خلية الجذع 3-9. ويمكن الآن هذا الذهب معيار نظام وسائل الاعلام أن تستخدم لتغذية ثقافة حرة مع إضافة ريال خروج المغلوب عامل النمو كوكتيل. ES الإنسان التقليدية وأساليب زراعة الخلايا المحفزة تتطلب استخدام الفأرة أو تغذية طبقات الخلايا الليفية الإنسان ، أو تغذية مكيفة المتوسط. هذه الأساليب هي ثقافة كثيفة العمالة ، من الصعب على نطاق وأنه من الصعب الحفاظ على الوركين خلايا غير متمايزة نظرا للظروف غير معروف. وقد وضعت Invitrogen خروج المغلوب عامل نمو كوكتيل ريال من أجل السماح لك الانتقال بسهولة الوركين والثقافات الخلية المغذية لHES خالية مع الحفاظ على استخدامك للريال خروج المغلوب.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

هذا البروتوكول وصف الإجراء مفصلة لcryopreserving الإنسان الجذع خلايا في وسط ريال خروج المغلوب الحفظ بالتبريد واستعادة هذه الخلايا في كامل مجاني خروج المغلوب الطاعم ريال (KSR - FF) أو المتوسطة المغذية المستندة ريال خروج المغلوب المتوسط.

Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  Life Technologies.  中文 日本語 

Video: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies.  The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy. Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies. The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

توقع فعالية استراتيجية استبدال السكان الذين يستخدمون النمذجة الرياضية

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

التغذية الخالية من التكيف والثقافة والركض للخلايا البشرية باستخدام IPS الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل متوسطة

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...