Biz Dr. S. Ressler (Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü, Baylor College of Medicine) hücre kültürü Süpernatantları MMP&#39;lerin konsantrasyonu artırmak için protein yoğunlaştırıcıların kullanımı önermek için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje Bayan Clifford Yaşlı Beyaz Graham donatılmış Araştırma Fonu ve CB NIH / NIAMS (AR059838) hibe ile desteklendi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Yükleme ve Jel Koşu <ol><li> Tüm numuneler enzimlerin fonksiyonunu korumak için yeterince hazırlıklı ve toplandıktan sonra hemen kullanılabilir veya -80 dondurularak saklanan olmalıdır ° C Örnekler indirgeyici ajanlar içermeyen (böyle bir β-mercaptoethanol) veya jel yüklemeden önce kaynatılmalıdır. </li><li> Bir kaset içinde jel içeren kese aç kaseti, deiyonize su ile durulayın. <ul><li> Kasetin alt ve üst jel tarak koruyucu bandı çıkarın. </li><li> Çalışan tampon (1X için deiyonize su ile seyreltilmiş) kuyular üç kez durulayın. </li><li> Mini-Cell, kaset küçük yan içe karşı karşıya olduğu sağlamak jel yerleştirin. Jel Gerilim Kama ile yerine kilitleyin. Mini Hücre paralel olarak, bir ya da iki jeller çalışmasına olanak tanır. </li><li> Kuyuları seviyesi üstünde 1X tamponu ile (iç) üst kamara doldurun, herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntı durumunda, tampon çıkarın ve jel yeniden konumlandırmak. </li><li> 1X tamponu ile alt kamara doldurun. </li></ul></li><li> Iyi bir protein moleküler marker 10 mcL yükleyin. <ul><li> Jel yükleme ipuçları (her bir numune arasında değişmektedir) kullanarak jel kuyulara jel yükleme tamponu ile örnek ve yük eşit miktarda karıştırın. Bu kuyular 20 mcL toplam yüklenebilir. </li></ul></li><li> Mini-Cell kapak yerleştirin ve elektrot kabloları güç kaynağına bağlamak. Güç kaynağı açın ve 90 dakika boyunca sabit 125 V çalıştırmak için ayarlayın. Mevcut dolaşımını gösteren küçük kabarcıkların oluşumu, alt odasının tel kontrol edin. </li><li> Ilk jel çalışırken, bir göstergesi olarak yükleme tamponu dahil Bromophenol Mavi kullanarak, her 15 dakikada bir göç ilerlemeyi izlemek. Göstergesi boya jel alt ulaşıncaya kadar jel çalıştıralım. </li></ol> 2. Jel Renaturing ve Gelişmekte Olan <ol><li> Her jel için, 1X renaturing tampon ve tampon denatüre 200 ml, 100 ml deiyonize su hem de hazırlar. </li><li> Bromophenol Mavi izleme boya jel alt ulaştığında, güç kaynağını kapatın, Mini-Cell açık ve jel çıkarın. Jel bıçak kullanarak (ya da bir tartı spatula) kaset iki tarafı ayırın. Jel yönünü işaretlemek için bir köşe kesin. </li><li> Jel 100 ml renaturing tamponu ile bir kap içine kaset ve yerden dikkatlice çıkarın. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Renaturing tamponu çıkarın ve jel tampon gelişmekte 100 ml. Yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jel, gelişmekte olan tampon 100 mL daha eklemek. 37 ° gece boyunca inkübe edin (16-18 saat) ° C </li><li> Gelişmekte olan tampon çıkartın ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak altında deiyonize su ile üç kez (5 dakika) sonra durulayın. </li><li> Jel, jel boyama sonra daha az ya da görünmez olacak gibi standart protein bantları tam konumlandırma kaydetmek için tarayın. </li><li> Leke Jel 20 ml SimplyBlue Safestain ekleyerek jel. Yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> SimplyBlue SafeStain ve yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat için 100 ml veya daha fazla deiyonize su içinde de leke jel çıkarın. </li><li> Daha iyi sonuçlar için, yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında bir saat veya daha fazla taze deiyonize su ve inkübe ile değiştirin. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Jel, su ve bir plastik levha koruyucusu yerden dikkatlice çıkarın. </li><li> 300 dpi veya daha yüksek çözünürlüğe sahip jel tarayın. TIFF formatında görüntü kaydetme (Şekil 1A). </li><li> ImageJ (veya başka bir benzer yazılım) ile bant yoğunlukları ölçün. <ul><li> ImageJ (Şekil 1A) TIFF dosya açın. </li><li> Seçerek siyah ve beyaz olarak gözünüzde canlandırın &quot;Image&gt; Yazım&gt; 8-bit&quot; (Şekil 1B). </li><li> En az iki kat daha yüksektir (bu bir yazılım gereksinimi) geniş daha bir dikdörtgen çizim, ilk grup anahat dikdörtgen seçim aracını kullanın. </li><li> &quot;1&quot; tuşuna basın veya &quot;Analiz&gt; Jeller&gt; Seç ilk şeritli&quot; ve grubun ana hatlarıyla olacak. </li><li> Yeni bir dikdörtgen görünür, bir sonraki grup taşımak ve &quot;Analyze&gt; Jeller&gt; Seç sonraki şeritli&quot; seçecektir. Bütün bantları (Şekil 1B) seçilene dek tekrarlayın. </li><li> &quot;3&quot; tuşuna basın veya her bir band (Şekil 1C) Profil arsa üretmek için &quot;Analyze&gt; Jeller&gt; Arsa şerit&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Ilgi tepe tamamen kapalı bir alan olduğunu, bu nedenle temel çizgiler çizmek için, düz bir çizgi seçimi (zaten otomatik olarak seçili olmalıdır) kullanın. </li><li> Değnek aracını seçin ve seçmek için her tepe noktası içini tıklatın. </li><li> Seçilen her pik alanı içeren bir tablo elde etmek için &quot;Analyze&gt; Jeller&gt; Etiket tepeler&quot; seçin. Bu veriler, (F gibi çizilebilirigure 1D) veya seçilen bir grubun değerine normalize edilebilir. Bu normalleşme, sonuçların istatistiksel olarak anlamlı belirlemek için çeşitli çoğaltmak jeller değerler havuzu özellikle önemlidir. </li></ul></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Biz, MMP-2 (Şekil 1A) farklı miktarlarda içeren farklı hücre kültürü süpernatantlar yüklü 11 kuyusu olan bir jel göstermektedir. Bu jel, doğrudan gözlem, MMP-2 konsantrasyonları bazı kuyuların arasında belirgin farklılıklar gösterir. Örneğin, kuyular # 4 ve 5 çok daha iyi # 11 veya # 10 MMP-2 içerdiği açıktır. Bantlar objektif ölçümü için de # 11 ve kuyu # 4 ve 5 ve yaklaşık 2 kat fark arasında MMP-2 miktarlarda yaklaşık 4 kat fark teyit ImageJ yazılım (Şekil 1B-D) ile dansitometrisi kullanmış MMP-2 de # 10 ve kuyu # 4 ve 5 arasında tutarındadır. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, MMP-2 jelatin zymography Algılama . Jelatin jel Taranan görüntü. Peki numaraları jel üst kısmında gösterilir. B, Aynı jel gibi siyah ve beyaz dansitometrisi için gösterilir. Her bandın ImageJ bir dikdörtgen ile seçildi. C, A ve B iki örnek gösterilen jel dansitometrisi profilleri (bantları # 4 ve # 11). Kapalı bir alan oluşturmak için her tepe dibinde düz bir çizgi çizildi. D, A ve B # 1 bant yoğunluğu önce (sol) ve sonrası (sağ) normalleştirme gösterilen jel için pik alanları Arsa. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Bu rakam zymography yarı-kantitatif bir teknik olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir . 7 kuyularda üst üste seri dilüsyonları (01:01 dilüsyonları adımlarla) yüklenir ve pro-MMP-2 ve MMP-2 hem de bant yoğunlukları ölçüldü.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

Biz, MMP-2 hücre kültürü Süpernatantları zymographic analizi gerçekleştirmek için nasıl göstermiştir. Ampirik ilgi kökeni ve MMP bağlı olarak örnek bir jel üzerinde yük miktarı tespit edilmelidir. Sadece bir proteaz bant alanında sindirimi çok substrat var çok yüklenirken biraz algılanmasını önlemek çok Yükleniyor doygunluk yol açabilir. Gerekirse, örnek, yükleme tamponu ya da gelişmekte olan zaman ile karıştırılarak önce deiyonize su ile seyreltilmiş de 4 saat için bir gecede indirilmiştir. Bu konsantratörleri (örneğin Millipore katalog # UFC803024) kullanarak bir çözüm proteinlerin konsantre olmak da mümkündür. Bantlar zor görünür kalırsa, hatta 48 saate kadar, uzun bir süre için jeller geliştirmek için gerekli olabilir. Doku kültürü süpernatantlar örnekler hazırlarken, fetal sığır serumu (ve diğer sera) sonuçları etkileyebilir MMP&#39;ler içerdiğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, serum serbest ortamda kültürden sonra bizim süpernatantlar toplamak. Protokolün paragraf 2.9 ve 2.10 &#39;da açıklanan yıkar sindirilir bantların boyama arka plan çıkarmak için gereklidir. Daha uzun yıkama süreleri boyunca substrat jel boyama daha fazla arka plan kaldırmak, ancak aynı zamanda loş. Uzun yıkama süreleri gerekli ise, jel, en iyi kontrast ile tarama seçmek için birkaç saatte bir tarama önermektedir. Bu teknik diğer MMP&#39;ler tespit etmek için kullanılabilir. Örneğin, jelatin tercih ettikleri substrat olarak MMP-9 daha düşük bir oranda MMP-1, MMP-8 ve MMP-13 Jellerin tespit ve olabilir. Kazein, MMP-11 için tercih edilen substrat ve algılama MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 ve MMP-13 için de sağlar MMP-1 ve MMP-13 en iyi kollajen zymography tespit 9 - MMP-7 (matrilysin) ve kolajenazlar (MMP-1 ve MMP-13), kazein veya Jellerin düşük seviyelerde tespit etmek zordur. Jel yükleme sırasında örnek heparin eklenmesi için algılama sınırı MMP-7 önemli ölçüde artırır. MMP-1 ve MMP-13, heparin elektroforetik vadede şekilde 12 altında zaten sonra jel eklenecek gerekiyor. Zymography enzimlerin denatürasyon ve Yeniden doğallaştırmanın sonra enzimatik aktivite ölçer, örnek mevcut tüm MMP aktivitesini ölçmek. Bu enzimler, pro-enzimler ve endojen inhibitörleri (örneğin TIMP-2) bağlı enzimler içerir. Bu örnek MMP aktivasyonunun aktif enzim grubun yoğunluğu karşılaştırarak ve biraz daha yüksek moleküler ağırlığa sahip olan, pro-enzim düzeyini belirlemek için ancak mümkündür. Zymography genellikle bir MMP tanımlamak için yeterli değildir. Karşılaştırma bilinen molekül ağırlığı standartları ile MMP göç düzeyi belirlenmesinde yardımcı olur ama bu standartların bazı indirgen içerir ve bu düşürücü olmayan koşullar altında kullanıldığında 9 farklı molekül ağırlıkları gösterebilir dikkat edilmelidir. Test örnekleri aynı jel üzerinde bir çözünür rekombinant MMP yüklemek için bir seçenek. MMP Ancak, molekül ağırlığı belirgin bir değişiklik indükleyen diğer proteinler ile ilişkili olabilir. Seçici MMP inhibitörleri interest.A ikinci tekniği (Western Blot, immünsitokimya veya ELISA) MMP tavsiye edilir kimliği farmakolojik araçları gibi gelişmekte olan tampon kuluçka sırasında jel (ya da yarım bir jel kesme parçası) eklenebilir ilgi MMP belirlenmesinde yardımcı olur. Western blot için algılama sınırları, bu tekniği kullanarak bir potansiyel yalancı negatif sonuçlara yol açan, sık sık zymographic jeller oranla çok daha düşük olduğu unutulmamalıdır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Matriks metalloproteinazlar (MMP) çinko içeren endopeptidazlar. Bunlar peptit bağlarının ayrılması ile proteinlerin bozulmasına yol açar. Yirmiden fazla MMP&#39;ler tespit edilmiş ve kendi yapısı ve substrat özgüllüğü (kolajenazlar, gelatinases, membran tipi [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ve diğerleri) göre altı gruba ayrılır. MMP hücre işgali, kıkırdak bozulması, doku remodeling, yara iyileşmesi, ve embriyogenez kritik bir rol oynamaktadır. Bu nedenle hem normal süreçleri ve romatoid artrit, kanser veya kronik obstrüktif akciğer hastalığı 1-6 gibi pek çok hastalıkların patogenezinde katılırlar . Burada, MMP-2 (jelatinaz A, Tip IV kollajenaz), yaygın olarak ifade MMP üzerinde durulacak. Biz tarafından 1980 yılında açıklanan ilk olarak C. Heussen ve EB Dowdle 7-10 yaygın olarak kullanılan, çok hassas ama basit ve teknik zymography, MMP-2 hücre kültürü süpernatantlar nasıl algılamak için gösterecektir . Bu teknik, yarı-kantitatif, bu nedenle aynı jel 11 rekombinant MMP bilinen konsantrasyonlarda yüklendiğinde test örneklerinde MMP düzeylerini belirlemek için kullanılan olabilir. Ve jelatin (MMP-2 için substrat), MMP (örneğin hücre kültürü süpernatantlar, idrar veya serum) içeren çözeltiler, sodyum dodesil sülfat (proteinler linearize SDS) içeren bir poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Örnek tamponu (jel yükleme kolaylaştırmak için) örnek viskozitesini arttırmak için tasarlanmış, bir izleme boya (Bromophenol Mavi örnek göç izlemek için), denatüre moleküllerin (proteinler linearize) sağlamak ve örnek pH kontrolü. Proteinler, daha sonra sürekli bir göç oranı sağlamak üzere tasarlanmıştır çalışan bir tampon bir elektrik akımı altında göç izin verilir. Göç mesafe proteinin moleküler ağırlığı (küçük proteinler jel ile büyük proteinler daha hızlı hareket ve bu nedenle jel daha aşağı göç) ile ters ilişkilidir. Geçişten sonra, jel proteinler enzimatik aktivite için gerekli üçüncül yapısı, yeniden sağlamak için bir renaturing tampon yerleştirilir. Jel sonra proteaz substrat sindirmek için izin verecek şekilde tasarlanmıştır gelişmekte olan bir tampon yerleştirilir. Gelişmekte olan tampon da aktif MMP-proteolitik olmayan pro-MMP etkinleştirmek için p-aminophenylmercuric asetat (APMA) içerir. Bir sonraki adım, substrat (bizim örneğimizde jelatin) boyama oluşur. Jel kapalı aşırı boya yıkadıktan sonra, proteaz sindirim alanları net bantları olarak görünür. Net grup, daha konsantre proteaz içerir. Band boyanma yoğunluğu gibi ImageJ gibi bir yazılım kullanarak, örnek karşılaştırma için izin dansitometrisi tarafından belirlenir.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography at JoVE.com

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Bu protokol, kültür süpernatantlar veya vücut sıvıları matriks metalloproteinazların tespit etmek için bir faaliyet tabanlı test açıklamaktadır.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biology

83.5K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu protokol, kültür süpernatantlar veya vücut sıvıları matriks metalloproteinazların tespit etmek için bir faaliyet tabanlı test açıklamaktadır.

Video: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.