Biz finansmanın bir kısmını sağlamak için İç Güvenlik US Department teşekkür ederim.

1.. Bakteriyel Suşlar ve DNA şablonu hazırlama <ol><li> E: bakteri suşları büyümek coli O157: H7, non-O157 ve bir gece boyunca çalkalama ile örneğin 37 ° C&#39;de Salmonella ve Shigella gibi diğer patojenik türleri,. </li><li> Uygun bir kit (malzemelerin tabloya bakınız) kullanılarak ve üreticinin talimatları bakteriyel kültürlerden DNA ayıklayın. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA konsantrasyonları belirlemek için optik yoğunluk (OD 260) ölçülür. </li></ol> 2. Primer ve QPCR Probe Assay için tasarım <ol><li> E. coli O157: H7 sekansları, GenBank erişim numarası AE00517411 vardır. Astar tasarımı ve (ayrıntılar için bakınız malzeme tablosu) gerçek-zamanlı PCR için primer ve prob tasarımı için uygun yazılım kullanarak prob. Primer ve prob sekansları, aşağıdaki gibidir: Z3276-İleri (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-Reverse (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> Bir primer çalışma çözeltisi olarak 10 uM bir konsantrasyonda elde edilen, su ile toz primer sulandırın. </li><li> Prob iş çözümleri olarak 10 mcM probları sulandırmak. Etiketli prob gruplar ile potens değişir. Bu nedenle, optimal performans için qPCR kullanmadan önce etiketlenmiş sondaların her parti titre edilir. </li></ol> 3. QPCR test koşulları ayarlama <ol><li> 2x gerçek zamanlı PCR ana karışımı 25.0 ul, ileri primerden 200 nM, geri primerden 200 nM ve 100 nM prob oluşur, reaksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> 50 ul bir son hacme ulaşmak için 5 numune DNA (100 pg) ul su ve uygun bir hacim. </li><li> Nontemplate kontrolü için, DNA örneği yerine su 5 ul kullanın. </li><li> , 10 saniye denatürasyon için ve 60 ° ve 95 ° C 40 döngü, ardından 95 ° C &#39;TaqMan aktivasyonu için 10 dakika için aşağıdaki gibidir: QPCR koşulları ayarlama176., C tavlama / uzatma 1 dakika karıştırıldı. </li></ol> 4. QPCR Duyarlılık Testi <ol><li> (; Kaplama ile yaklaşık 1.5 x 10 8 CFU / ml OD 600 = 0.5) orta üslü fazda bir kültürden bir seri 10-misli seyreltme olun. </li><li> , Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plaka üzerine hücre seyreltmelerinden 100 ml ilave edilir. </li><li> 10 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüje plaka. </li><li> Her bir oyuğa DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ml ilave edilir. </li><li> Bir çok kanallı bir pipet ile yeniden süspanse edin hücre topakları. </li><li> 10 dakika için bir su banyosu içinde plaka kaynatın, bir film ile plaka Seal ve 2 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüj. </li></ol> 5. PMA Tedavi için Canlı ve Ölü Hücre Karışımları hazırlanması <ol><li> E. 10 ml büyütün coli O157: orta üslü faza kadar 37 ° C&#39;de H7 ve iki eşit bölüme kültür bölün. </li><li> Ölü hücreler için bir su banyosu içinde 10 dakika için bir hücre, bir kısım kaynatın ve canlı hücreleri için diğer bir kısım bırakın. </li><li> DoğrulayınYeniden LB agar plakaları üzerinde hücreleri kaplama ile ısı-ölümlü kısım hiçbir canlı hücrelerdir. </li><li> Canlı ve ısıyla öldürülmüş hücrelerin 2 ml alın ve 8 &#39;ye konsantrasyonu ayarlamak x 10 6 CFU / ml LB ortamı ile. 8 x 10 0 8 x 10 6 CFU / ml arasında değişen hücre seyreltileri dört set oluşturun. </li><li> PMA ile muamele edilmiş ya da muamele edilmemiş hücrelerin canlı hücre dilüsyonları ilk iki set kullanın. </li><li> Canlı ve ölü hücre karışımları için - hücreli dilüsyonları üçüncü ve dördüncü setleri için, her bir hücre seyreltme (8 x 10 6 8 x 10 0) 8 x 10 6 ölü hücreleri ekleyin. </li><li> PMA ile seyreltme, üçüncü bir dizi tedavi ve kontrol için seyreltme dördüncü dizi kullanımı. </li></ol> 6. Hücreler PMA ile Tedavisi <ol><li> 10 mM stok solüsyonu ve karanlıkta -20 ° C&#39;de saklanır yapmak dimetil sülfoksit (veya su), PMA çözülür. </li><li> Canlı hücreler, ölü hücreleri ve canlı ve ölü hücreleri içinde karışımın alikosu 400 ulüç ayrı mikrotüpler. </li><li> 50 uM bir nihai konsantrasyona kadar her bir hücre için 10 kısım mM PMA 2.0 ml ilave edilir. </li><li> Yavaşça birkaç kez, 3 saniye, her zaman titreme, karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 96 oyuklu bir plaka üzerinde numunelerin 100 ul ekleyin. </li><li> Bir optik film ile plaka yalıtılır ve bu üzerinde plaka koydu. </li><li> 20 cm 650 W halojen ışık kaynağından plakasını ayarlayın ve ışık pozlama için 2 dakika süreyle maruz. </li><li> 10 dakika boyunca 2.500 x g&#39;de santrifüj plaka, yavaşça süpernatantı atmak ve dikkatle emici bir kağıt parçası üzerinde plaka boşaltın. </li><li> Pipetleme ve bir çok kanallı Pipetman yirmi kat aşağı DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ul yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> 2 dakika boyunca 2500 x g&#39;de 10 dakika su banyosu içinde ve santrifüj kaynatın, bir film ile plaka kapatın. Plakadaki Süpernatan, PMA ve QPCR hazır işlemden hücrelerinden DNA&#39;dır. </li><li> Descri olarak qPCR gerçekleştirinYukarıda yatak, DNA 5 ul kullanılmıştır. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmanın birincil amacı, E bir ORF Z3276, benzersiz bir kullanımını gerektirir E. coli O157: H7, qPCR tahlil için bir tek belirteç olarak. Şu anda, en qPCR deneyleri stx1, stx2 ve EAEA 1,2,5,6 veya uidA 3,4, rfbE ve FLIC genler 8,9 gibi paylaşılan fenotipik genler gibi virülans genleri hedefliyoruz. Bu genler farklı türler ya da yanı sıra suşları 16 mevcut olduğu gibi Bazen, bir tür ya da zorlanma kesinlikle bu tür STX 1ve stx 2 genleri gibi, virülans gen (ler) tarafından tespit edilemez. , Hedef gen için rfbE ve FLIC kullanarak, her iki gen tam tanımlanması 17 için kullanılmak üzere ihtiyaç vardır. Bir biyolojik olarak ORF Z3276 kullanan bu tahlil QPCR hassas ve spesifik deney, (Tablo 1) olarak gösterilmiştir. H7 suşları (n = 3: Bu deney O157 de dahil olmak üzere katı dışlamayan ve seçkin testleri, tabi tutulmuşturSalmonella ve Shigella gibi 67), 100 den fazla olmayan O157 suşları ve diğer patojenik türleri,. Tüm O157: H7 incelenmiştir suşları pozitif tespit edildi, ve çapraz-reaktivite olmayan O157 suşları (Tablo 1) için tespit edildi, ORF Z3276 E. tespiti için özel ve güçlü bir biyolojik olduğunu belirten E. coli O157: H7. Bu çalışmanın amacı, diğer seçici bir DNA ekstraksiyon önce PMA işlenerek ölü hücrelerden canlı hücreleri tespit etmektir. PMA tehlikeye membran ile ölü hücrelere nüfuz DNA&#39;ya bağlanan ve böylece PCR 13 ölü hücrelerin DNA amplifikasyonu inhibe edebilir. Biz, PMA-muamele prosedürü değiştirilmiş ve işlem için bir 96 oyuklu plaka formatı için adapte edilmiştir. Işığa maruz bırakılmanın doğru yoğunluğu en uygun çapraz bağlama etkiyi elde etmek için gereklidir. Daha önce, bu aşama mikrotüpler 13-15 kullanılmıştır. Ancak, ayrı mikrotüpler ışık eski işlemek zordurmaruziyet adım ve bu tüpler iyi çapraz sevme elde etmek için kesinlikle şeffaf değildir. 96 oyuklu bir plaka kullanarak, PMA muamelenin etkinliğini arttırıyor. Bu değişiklikler, çeşitli şekillerde etkileyebilir tahlili: özellikle çok sayıda örnekleri ile daha kolay bir tam ve düzgün bir çapraz-bağlama etkisini elde etmek için yapmak, muamele edilmiş numuneler için mümkün hale getirmek için başka bir plakadan hareket ettirilebilen çok sayıda algılama örneklerin ve onlar tüm süreç için otomasyon potansiyeli ile bu PMA-qPCR tahlil sağlamak. Bu PMA-qPCR deneyinin sınırlama PMA tedavi biraz PCR tahlili maliyetini artırır ve PCR tahlilin duyarlılığı azaltılmış olmasıdır.

PCR E tespiti için yaygın bir tekniktir coli O157: gıda ve çevre örnekleri H7. E. özgü biyolojik göstergeleri coli O157: H7 PCR analizlerinde başarılı algılama için önemli faktörlerden biridir. Genel olarak E: tespiti için PCR analizlerinde kullanılan biyolojik E. coli O157: H7 Shiga toksin (STX 1 ve STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7 ve FLIC genler 8,9 içerir. Bu biyolojik tanımlanması için değişken etkinlik sağlayabilir, ancak biyolojik çoğu E. tespiti için özel bir belirteç olarak kullanılamaz E. coli O157: H7. Hedef genlerin farklılaşma gelen bu yetersizlik E: tanımlanması için daha özel ve güçlü bir biyomarker (ler) için çağrı E. coli O157: H7 10. E gen veya varsayımsal açık okuma çerçevelerinin (ORF&#39;ler) için çok sayıda probları coliO157: H7 11 laboratuvarda DNA genotiplendirme microarrays gelen ve Biyoteknoloji Bilgi Ulusal Merkezi Gen bankasındaki içinde arama yaparak ipuçları dayalı QPCR tahlil için tasarlanmıştır. Bir saçaklı gen 11&#39;dir Z3276 ORF, sekansı QPCR tahlili için seçildi. Daha sonra, deney QPCR Bu gibi primerlerin ve problann konsantrasyonları, hem de tavlama ve uzatma sıcaklıklarda (veriler gösterilmemiştir) gibi PCR parametrelere çok sayıda araştırmalar yoluyla geliştirilmiştir. E.on gibi referans suşları üzerinde teşvik dışlamayan ve münhasırlık testlerden sonra coli O157: QPCR H7, non-O157 ve Shigella suşları, ORF Z3276 E tanımlanması için özel ve güçlü bir genetik işaretleyici olarak tanımlandı E. coli O157: H7. Sonra E. belirlenmesi için bu eşsiz biyogöstergesini kullanarak yeni QPCR yöntemi geliştirmeyi E. coli O157: H7. E. tespiti başka zorluk coli O157: H7 in fo kirlenmişods ve çevre örneklerinde canlı hücrelerin doğru belirlenmesidir. Ölü hücreler ve PCR deneyinde canlılığı ayırt etmek için yetersizlik DNA genişletilmiş varlığı tespiti canlı hücre sayıları fazla değerlendirilmesine sonuçlanan yanlış pozitif okumaları neden olabilir. Sonuç olarak, bu gıda kaynaklı patojenlerin 12 doğru tespiti PCR kullanımını sınırlar. Ölü hücrelerin DNA ayırt etmek için yeni bir yaklaşım son birkaç yıl içinde 13-15 PCR prosedürü ile propidyum monoazide (PMA) tedavisi birleştirerek alınmıştır. PMA ölü hücrelerin içeri ve ışığa maruz kaldığında DNA&#39;nın bölgeye girmesini mümkün olmakla birlikte, bu, canlı hücrelerin DNA ile tepkimeye canlı hücreler içinde gidemez. Bu yüzden, canlı ve ölü hücreler PMA ile muamele edilen karışımlarda, ölü hücrelerin DNA PCR 13 amplifiye olamaz. Bu seçici olarak canlı E. tespit etmek için yeni geliştirilmiş QPCR deneyi ile PMA tedavi kombine E. coli O157: H7 hücreleri. Ayrıca, PMA-qPCR a yaptıkyüksek verimli tespiti için mümkün ssay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

Benzersiz bir açık okuma çerçevesi (ORF) Z3276 E için belirli bir genetik işaretleyici olarak tanımlandı E. coli O157: H7. Bir deney, QPCR E: saptanması için geliştirilmiştir coli O157: ORF Z3276 hedefleyerek H7. Bu deneyde ile, E. DNA genomunun bir kaç kopya gibi düşük algılayabilir E. coli O157: H7. Tahlilin duyarlılığı ve spesifisitesi E: çok sayıda, yoğun doğrulama testleri ile doğrulanmıştır coli O157: H7 suşları (n = 369) ve non-O157 suşlar (n = 112). Ayrıca, ölü hücreleri canlı hücrelerin selektif deteksiyonu için yeni geliştirilmiş QPCR protokolüne propidyum monoazide (PMA) prosedürü birleştirdik. PMA ile muamele edilmiş ölü hücrelerden DNA amplifikasyonu neredeyse tamamen PMA ile muamele edilmiş, canlı hücrelerden DNA bir ilgisi amplifikasyon aksine inhibe edilmiştir. Ek olarak, iletişim kuralı örneklerin çok sayıda kolay ve tutarlı bir kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve adapte edilmiştir. Tonun yöntemi doğru mikrobiyolojik gıda güvenliği ve çevre kaynağının epidemiyolojik izleme üzerinde bir etkisi olması bekleniyor.

E. tespiti coli O157: ORF Z3276 kullanarak qPCR H7 Bu testin en önemli faktörlerden biri QPCR kullanılan Z3276 sonda duyarlılığı ve özgünlüğü olduğunu. Bu E. DNA genomunun bir kaç kopya gibi düşük algılayabilir coli O157: H7 Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi,. Altı büyük olmayan O157 STEC suşlar, O104 de dahil olmak üzere incelenen 120 olmayan O157 suşları, içinde: Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, H4 suşlar, Salmonella, Shigella ve suşlar, herhangi bir çapraz reaktiflik, bulunmuştur. QPCR ile PMA tedavi kombinasyonu Kuluçka E. coli O157: 5 karanlıkta dakika ve 2 dakika boyunca ışığa maruz bırakılması için PMA (50 mM) ile H7 hücreleri PMA işleme koşulları için seçildi. Ayrıca, PMA tedavi prosedürü değiştirilmiş. Çapraz bağlama aşamasında kullanılan çeşitli saydam mikrotüplerde ile karşılaştırıldığında, 96 oyuklu bir plaka için daha verimli olduğu bulunmuşturuygun çapraz bağlama etkisi ve ışığa maruz kalma sırasında numune tüpleri, çok sayıda işleme göre daha uygun ulaşır. QPCR PMA ile muamele edilmiş, canlı ve ölü hücrelerden DNA amplifikasyonu Bu tahlilde QPCR ölü hücrelerden DNA amplifikasyon PMA aracılı inhibisyonunun etkileri, iki seri 10-misli canlı veya ölü hücre dilüsyonları türetilen DNA kullanılarak, Şekil 1 &#39;de gösterildi. Sonuçlar, PMA (kırmızı eğri) ve PMA (mavi eğri) olmadan muamele edilmiş canlı hücrelerden üretilen eğriler doğrusal ve birbirine hemen hemen aynı gibi olduğunu göstermektedir. Hafif bir CT değeri farkları PMA tedavi QPCR içindeki canlı hücre DNA amplifikasyonu üzerinde çok az etkisi olduğunu düşündürmektedir PMA ve PMA (Şekil 1A) olmadan muamele edilmiş canlı hücreler arasında gösterildi. Ama 15 - CT değer farkı (32.000 kat) PMA ile muamele ölü hücreler arası ve PMA, demo olmadan gösterildiPMA tedavi etkili bir ölü hücreleri (Şekil 1 B) elde edilen DNA amplifikasyonu baskıladığını nstrating. QPCR canlı ve ölü hücre karışımlarından canlı hücre tespiti Canlı hücre seyreltilerde (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) İki takım canlı / ölü hücre karışımları canlı hücreleri algılamak için PMA ile veya PMA olmadan tedavi edildi. QPCR Sonuçlar (Şekil 2A), muamele edilmemiş örneklerin (mavi bar) ile muamele edilmiş canlı hücreler (mor bar) arasında sayı ile ilişkili olarak CT değerleri arasında bir ters paralel ilerleyen bir eğilim göstermiştir. Muamele edilmiş hücreler, canlı işlem görmemiş canlı hücre daha biraz daha yüksek bir CT değeri elde edilmiştir. CT değerleri arasında benzer bir ters aşamalı bir eğilim Şekil 2B&#39;de de PMA (yeşil çubuklar) ile muamele ölü / canlı hücre karışımları içinde canlı hücre gerçek sayısı ile gözlenmiştir. Buna ek olarak, CT değerleri bu düşüş trendi oldu106 ölü hücrelerin varlığına rağmen karışımları içinde canlı hücre sayısı ile saptanmıştır. Bu sonuçlar, ölü hücrelerden DNA amplifikasyon verimli bir şekilde PMA işlenerek bastırıldı ise ölü / canlı hücre karışımlarının CT değerleri, tek başına canlı hücrelerinden DNA temsil ettiğini göstermiştir. Ancak, PMA ile muamele ölü / canlı hücre karışımlarının CT değerleri, dalgalı ve Şekil 2B&#39;de (sarı bar) &#39;de bunların karışımları olarak canlı hücre sayılarının söz konusu başarısız olduğu görülmüştür. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> Şekil 1. Canlı ve ölü hücre ya da PMA ile QPCR deneyde PMA olmadan işlemden geçirildi. (A) içinde bir seri canlı E. 10-kat sulandırılmış coli O157: H7 hücre seyreltileri (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU), PMA ile veya PMA olmadan muamele edilmiştir.CT değerleri QPCR deneyde üç kopya CT ortalama değerleri temsil eder. (B) q QPCR karşılaştırma deneyinde PMA ve PMA olmadan muamele edilmiş, canlı hücreler ve ölü hücrelerin DNA amplifikasyonu karşılaştırılması. ΔRn yoğunluk değişimi floresan ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> Şekil 2. . PMA-QPCR hücre kültürlerinin 10-kat seyreltileri (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) dört grup ile ölü / canlı hücre karışımlarından canlı hücre farklılaşması belirtildiği gibi yapılmıştır. Ikinci hücre seyreltme DNA ekstre önce ya da muamele edilmemiş ise hücre seyreltme (A) ilk kümesi PMA ile muamele edilmiştir.(B) 8 x 10 6 ölü hücreler gösterildiği gibi ölü / canlı hücre karışımları iki takım için hücre dilüsyonları üçüncü ve dördüncü setleri ile karıştırılmıştır. Hücre karışımları kümesi PMA ile muamele edildi ve diğer set DNA ekstre önce PMA olmadan muamele edilmiştir. Her çubuk ± SD üçlü deney ortalama BT değerleri temsil eder. <table><tbody><tr><td> Organizma </td><td> Serotip </td><td> Test edilen suşların No </td></tr><tr><td rowspan="15"> E. coli </td><td> 2006 ıspanak O157: H7 salgını izolatlar </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 Taco Bell O157: H7 izolatların </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 Taco John O157: H7 izolatların </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Diğer O157 DMB suşu koleksiyonlar: H7 vakaları </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Ø103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Ø145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Diğer </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Zehirlenmeye neden olan mikrop </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Newport </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella dysenteriae </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> Bilinmeyen </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Toplam </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tmümkün 1. E. belirlenmesi için gerçek-zamanlı PCR tahlilinde doğrulama için kullanılan suşlar E. coli O157: H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

H7 benzersiz bir genetik işaretleyici, Z3276 hedefleme: A QPCR tahlil Escherichia coli O157 tespiti için geliştirilmiştir. QPCR canlı hücre algılaması için propidyum monoazide (PMA), tedavi ile kombine edilmiştir. Bu protokol, çok sayıda numune, kolay ve uygun kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve uyarlanmıştır

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

detection-of-live-escherichia-coli-o157h7-cells-by-pma-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K Görüntüleme.  Food and Drug Administration.  H7 benzersiz bir genetik işaretleyici, Z3276 hedefleme: A QPCR tahlil Escherichia coli O157 tespiti için geliştirilmiştir. QPCR canlı hücre algılaması için propidyum monoazide (PMA), tedavi ile kombine edilmiştir. Bu protokol, çok sayıda numune, kolay ve uygun kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve uyarlanmıştır 

Video: Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.