Mevcut ve eski Rubel laboratuvar üyeleri.

1. Alan Diseksiyon hazırlanması <ol><li> Kabarcık (pH 7,2-7,4 arasında, ozmolarite 295-310 mOsm / l)% 95 O 2 /% 5 CO2 karışımı ile sürekli yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF). </li><li> ACSF köpürme iken,% 70 EtOH ile çalışma alanı temizleyin. Vibratome ve dilimleme bıçağı temizleyin. Distile su (dH 2 O) ile durulayın bıçak. </li><li> Uygun kesme aletleri ile diseksiyon alanı temiz sıvı emilimi pedi yerleştirin. </li><li> Tutkal vibratome-dilimleme odasının sahneye agar bloğu (40 mg agaroz dH 2 O / ml, yani% 4,) *. * İpucu: diseksiyon önce agar hazırlamak. Buzdolabında kapalı bir petri içinde Mağaza önceden yapılmış agar. Agaroz Merck Kimyasallar veya Invitrogen satın aldı. </li></ol> 2. 6-Kültür ve Orta iyi Tabaklar hazırlanması <ol><li> Steril bir Kaputun altında, 1 ml kültür ortamı ve inkübe 35 ile 6 plaka hayvan başına 1 doldurmak ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Gerektiği gibi gibi birçok kültür membran ekler hazırlayın ve daha sonra kullanmak için bir başlık koyun. </li></ol> 3. Tavuk İşitsel Beyin Sapı, İzolasyon <ol><li> Yeri yumurta embriyo (genellikle yumurta büyük yan) hava dolu bir uzay boşluğu belirlemek için parlak bir ışık kaynağının altında. </li><li> Membran kese açığa yumurta büyük bir tarafı açık kırın. Bistüri ile zar kese dilim olun ve tavuk embriyo baş hafifçe kaldırın. </li><li> Hızla makasla başkanı başını kesmek. </li><li> Yeri ve gözler arasında biraz arka jilet ucu. Sadece hafif bir basınç uygulayarak kafatası yoluyla bir rostral-kaudal orta hat insizyonu olun *. * İpucu: uygulanan basınç, embriyonun yaşına bağlıdır (yani, genç = daha az, daha büyük = daha fazla) </li><li> Deri ve tüy, kafatası maruz ve orta hat kesme doğrulamak için yavaşça kenara itin. </li><li> Bir jilet ile dilimleme kafatası rostral kısmı engelleyin. Gözleri posterior ve hızla tüm kafatası ve beyin dokusu kesti Pozisyon bıçak *. * İpucu: güçlü bir baskı rostral bölümü tamamen kaldırmak için gereklidir. </li><li> Başın her iki tarafında görülebilir boyun kasları biraz ön kafatası kaudal bölgede küçük makas, orta hat-lateral insizyon olun. Kafatası ve maruz serebellum ve beyin doku dışarı doğru çekin. </li><li> Bağlı doku, küçük makas ile keserek hafifçe kafa tabanı, beyin sapı çıkarın. Tüm doku kesilir sonra, beyin, kafatasının uzakta serbestçe hareket etmelidir *. * İpucu: Eğer kafatası (beyin aşağı) bağlı doku kesmek için çevirmek gerekebilir. </li></ol> 4. Dilimleme için Beyinsapı hazırlanması <ol><li> Kafatası çıkarıldı, optik tecta aracılığıyla beyin sapı aşağı pin. </li><li> Tamamen beyincik hafifçe peduncles, küçük bir makas ile kesme, dördüncü ventrikül zemin açığa çıkarın. </li><li> Cımbız ile beyin yüzeyinde herhangi bir membranöz doku ve kan damarı çıkarın ve beyin sapı izole optik tecta ile yan keser. </li><li> Agar bloğu önünde vibratome aşaması (vibratome bıçak doğru), süper yapıştırıcı küçük bir miktar koyun. </li><li> Cımbız kullanarak, nazik ve hızla vibratome bıçak aşağı doğru rostral tarafında ve sırt tarafında, omurilik ve yer doku süper yapıştırıcı üzerine beyin sapı kaldırma *. * İpucu: aşırı yapıştırıcı ile absorbe edilmelidir kim-silin ya da bir sonraki adım önce kağıt filtre. </li><li> Oksijenli ACSF vibratome aşamasında içine yavaşça dökün *. * Not: Bu ACSF sürekli O 2 / CO 2 ile kabarmış olabilir. Ancak, beyin sapı dilim istenmeyen hareketi çözüm sonuçlarının gibi küçük bir hacim (ve olası hasar) ACSF, köpürme. Hızla gerçekleştirildiği takdirde, zaten diseksiyonu ACSF yeterli oksijenli. </li><li> Vibratome bıçak 20-22 ° açı olmalıdır. Başlangıç ​​vibratome (salınım maksimum genlik set olması lazım) ve doku üst dilimleme önce bıçak ile paralel olacak şekilde bıçak doğru sahne yukarı taşımak. </li><li> Beyin sapı doku hızla doğru bıçak taşıyın. , Doku ile bıçak temas ölçüde hemen önce yavaşlayın. </li><li> Yavaş mümkün ileri hareket doku dilimleme başlayın. Tüm doku koronal bölümü aracılığıyla, nazik bir fırça ya da kırık bir cam dilim bıçak uzaklaşmaya, cilalı pipet lastik bir ampul ile bir ucunda uygun ateşledi. </li><li> Alt 300-500 mikron adımları sahne ve tekrar dilim. Anatomik imzaları beyin sapı doku görünür olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Şu anda, 200-1000 mm dilim beyin sapı işitsel yapıları içeren doku, doku ve deneysel ihtiyaçları yaşına bağlı olarak, kalınlıkları. </li><li> Dikkatli bir şekilde korumak, yani dilimleme amacıyla kullanılabilir dilim 1. dilim devrenin en kaudal bölge (düşük frekanslı ses işleme) temsil eden ve son dilim en rostral bölümü (yüksek frekanslı processi temsil ederng) *. * Not: kültür kullanmak için dilimleri yerleşim için, bölüm 6 gitmek. In-vitro fizyoloji depolama için, bir sonraki bölüme bakın. </li></ol> 5. In-vitro Fizyolojisi Dilim Depolama <ol><li> Her hayvan, tavuk embriyo ve dilim kalınlığı yaşına bağlı olarak 1 ila 6 dilim vermelidir. </li><li> Yavaşça lastik bir ampul bir ucuna monte yangın parlatılmış cam pipet kullanarak odasında tek tek dilimleri yerleştirin. Odası numaralı olmalıdır. Bazı tonotopic özgüllük (örneğin, 1 kamara en kaudal dilim ve son odasında en rostral dilim) korumak için, yanı başına sadece bir dilim koyun. Odası ACSF ile dolu ve sürekli olarak% 95 O 2 /% 5 CO 2 (pH 7.4, ozmolarite 295-310 mOsm / l) oluşan bir karışım ile kabarmış olmalıdır. </li><li> Dilimleri, yaklaşık 1 saat (36 ° C) ılık bir banyo odasının koyarak gelmesini sağlayınız. </li><li> Ilık bir banyo odasının çıkartın ve oda sıcaklığında yaklaşık yarım saat dinlenmek için izin. </li><li> Oda sıcaklığında yarım saat sonra, dilimler elektrofizyolojik deneyler için bir mikroskop üzerine monte ~ 0.5 mL kayıt odasına tutarak odasına transfer olabilir. </li><li> Dilimler çıkarıldıktan sonra sıcak bir banyo ~ 6 saate kadar kullanılmış olabilir. </li></ol> 6. Organotipik Dilim Kültürler hazırlanması 8 <ol><li> Hemen transferi dilim bir ucunda bir buz üzerinde 48 plaka bir kauçuk ampul takılmış yangın parlatılmış cam pipet kullanarak ~ 500 mcL ACSF dilimleme prosedürü izleyerek (bkz. Bölüm 6). Bir de her dilim *. * İpucu: Dilimler, en az 300 mm ve 1000 mm kalınlığa kadar olması gerekir. </li><li> Dilimleri toplanmıştır sonra, kaput 48-plaka aktarın. </li><li> 6-iyi bir kuluçka plaka içeren kültür ortamı dışarı çıkarın ve kaput transfer. </li><li> Hemen önce iyi bir kültür ortamı ile (bkz. Bölüm 2.2), membranlar üzerine tek bir beyin dilimleri hazırlanan membran ekler birini yerleştirerek. Hiç hava kabarcığı membran altında bulunduğundan emin olun. </li><li> Cam bir pipet kullanarak, bir dilim ACSF kültür membran üzerine bir damla transferi ve mikropipet aşırı ACSF kaldırmak. Kalan dilimleri için bu işlemi tekrarlayın (membran başına azami 4 dilim) *. * İpucu: dilim membran jant dokunmayın böylece membran merkezi birbirine temas ve yer dilim yok emin olun. </li><li> Gerektiği gibi birçok beyin dilimleri için tekrarlayın *. * İpucu: kültürler, daha sonraki bir zaman noktada manipüle Eğer kültürler inkübatör kaldırılır süresini azaltmak için, 6-plaka başına 3 membran miktarını sınırlamak için avantajlı olabilir. </li><li> Kültür ortamı haftada 3 kez bir başlık altında değiştir: membran eklemek iyi bir çift forseps kaldırdı ise, bir vakum tüp steril bir ucu eski orta çıkarın. Iyi membran eklemek iyi kaldırdı ise 1 ml taze kültür ortamı ekleyin. Tüm orta değiştirildiğinde, kuvöz içine arka plaka koymak. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Tavuk işitsel beyin sapı Binaural devresi koronal bir bölümünün (A) Şematik ve tavuk işitsel beyin sapı (BF), in-vitro dilim görüntüler. (A) devre nükleus magnocellularis (NM) ve çekirdek angularis (NA) işitme siniri (AN) afferent eksitatör girişleri gösterir. NM nükleus laminaris (NL), beyin sapı her iki iki tarafında ikili eksitatör giriş projeler. NA, NM ve NL üstün olivary çekirdeği (SON) projeleri inhibitör giriş. De in-vitro dilimleri (BF), ardışık görüntüler yüksek frekans bölgelerinde düşük temsil kaudal (B) tavuk işitsel beyin sapı rostral (F) (her biri 200 mikron), sırasıyla . Devresi, öncelikle ses lokalizasyonu için kullanılan ses zamansal özellikleri kodlama için sorumludur. Ölçek çubuğu IN (B) = 500 mikron ve görüntüleri (CF) için de geçerlidir. NL, tek bir hücre gövdesi katmanı, (D) noktası oklar. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Kültüre nöronların normal fizyolojik yanıtı özellikleri gelişir. Akut (A &amp; C) ve 4 (B) ve 7 (D) kültürü gün (DIC) kültüre doku geçerli adımları hiperpolarizan ve depolarizan yanıt membran voltaj değişiklikleri süperempoze. Not yaş eşdeğer akut doku ile karşılaştırıldığında dilim kültür yaklaşımı benzer şekilde gelişir gerilim &quot;sarkma&quot;, dışa akım güçlü bir azalma, tek bir AP ateş hiperpolarizan değişir. Şu enjeksiyonları 50-100 pA 200 ms, adımları. RMPs -55 ve -60 mV arasında idi. <img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Kültür sli anatomik yapısıces E11 kültür 7 gün sonra bir tavuk (DIC), işitsel beyin sapı Sol yarısı. Soma ve dendritler oluşur mikrotübül ilişkili protein 2 (map2), karşı bir antikor, yeşil etiketli. Bir küme çekirdeği magnocellularis (NM) nöron ve aksonlar bir Alexa dekstran boya elektroporasyon yoluyla kırmızı olarak etiketlenir. NM ve NL hücre hattı her ikisi de görülebilir. Ipsilateral NM akson terminalleri dorsal NL dendritler (beyaz ok başları) için projelendirme görülebilir.

<ol>
	<li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K++currents.">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li><li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken.">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li><li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons.">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li><li>Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+glutamatergic+synaptic+transmission+in+binaural+auditory+neurons.">Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).</li><li>Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+in+the+chick:+ontogeny+of+postsynaptic+responses.">Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses.</a> J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+underlying+the+firing+of+neurons+in+the+avian+cochlear+nucleus.">Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).</li><li>Monsivais, P., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accommodation+enhances+depolarizing+inhibition+in+central+neurons.">Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons.</a> J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).</li><li>Lu, T., Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus.">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways.">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li><li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons.">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li><li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure.">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li></ol>

Birkaç on yıl için, akut dilim hazırlık tavuk beyin sapı işitsel işleme 9, 10 çalışma için kullanılır olmuştur. Bu yaklaşım, muazzam bir gelişim ve olgun hem de devletler 4, 11, 12 Binoral işleme in-vitro fizyolojik verilerin miktarı sağladı . Bu son derece özel bir devre ve her bir çekirdeği, 13, 14 ses temporal işleme oynadığı rol hakkında çok bilinir. Aslında, bu iyi karakterize bir devre yapısı ve işlevi, kısa vadeli deneysel manipülasyon...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken ACSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-11624</td>
<td>130 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M-10576</td>
<td>26 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9333</td>
<td>3 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8282</td>
<td>1.25 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>M33-500</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>423525000</td>
<td>2 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken culture medium (store at 4&deg;C)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen</td>
<td>12492-013</td>
<td>48.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Earl's balanced salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E-2888</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7513</td>
<td>1.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose solution (200 g/l, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G-7528</td>
<td>2.75%</td>
</tr>
<tr>
<td>horse serum (heat inactivated, sterile filtered)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1138</td>
<td>24.00%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-0781</td>
<td>1.00 ml 
* = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Specific equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millicell-CM cell culture inserts</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plate</td>
<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator</td>
<td>Forma Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and culture of chicken auditory brainstem slices

Tavuk işitsel beyin sapı, yaygın kalkınma 1-4 sağduyulu dönemlerde de, merkezi sinir sistemi 5-7 temporal kodlama için mekanizmaları gibi işitsel işleme anatomi ve fizyoloji çalışmak için kullanılan bir köklü bir model sistem. Burada akut deneysel yöntemler ya da uzun vadeli deneysel manipülasyonlar için kültür Organotipik dilim kullanılabilir tavuk işitsel beyin sapı dilimleri hazırlamak için bir yöntem mevcut. Tavuk işitsel beyin sapı, magnocellularis, laminaris ve üstün zeytin çekirdeği angularis oluşmaktadır. Bu çekirdeklerin Binoral ses işleme ve tek koronal dilim hazırlıkları tüm devreleri korumak için sorumludur. Sonuçta, Organotipik dilim kültürleri, sinaptik aktivite, pre ve postsinaptik bileşenler ifade, uyarılabilirlik ve diferansiyel gen ekspresyonu yönlerini kontrol ifade gibi çeşitli gelişimsel parametreleri işlemek için fırsat sağlayabilir Bu yaklaşım, nöral devre geliştirme, arıtma ve olgunlaşma hakkında genel bilgi genişletmek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices at JoVE.com

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Tavuk işitsel beyin sapı Binoral ses işleme için sorumlu çekirdekleri oluşur. Kültürlü bir yaklaşım, nöron yapısı ve işitsel fonksiyonu, moleküler, hücresel ve ağ seviyelerinde gelişimini incelemek için eşsiz bir hazırlık sağlarken tek bir koronal dilim hazırlık tüm devre tutar.

Tavuk İşitsel Beyin Sapı Dilimleri hazırlanması ve Kültür

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Görüntüleme.  University of Washington. Tavuk işitsel beyin sapı Binoral ses işleme için sorumlu çekirdekleri oluşur. Kültürlü bir yaklaşım, nöron yapısı ve işitsel fonksiyonu, moleküler, hücresel ve ağ seviyelerinde gelişimini incelemek için eşsiz bir hazırlık sağlarken tek bir koronal dilim hazırlık tüm devre tutar.

Video: Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...