InDevR bu çalışmaları finanse NIH / NIAID U01AI070276 ve R43AI077112 kabul eder.

1. RT-PCR kullanarak Örnek amplifikasyon <ol><li> Klinik malzeme veya viral bir QIAcube otomatik nükleik asit ekstraksiyon platformu ile birlikte Qiagen MinElute Virüs Spin Kit kullanılarak izole eder. Viral RNA Özü Ekstraksiyonları 60 ul son bir elüsyon hacmi 200 ul numune üzerinde yapılır. Mağaza özleri -70 ° C veya daha sonra kullanmak için daha düşük. </li><li> Bir şablon serbest alanda buz üzerinde, üretici firmanın protokolüne göre RT-PCR master karışımı hazırlar. RT-PCR sırasında biotin birleştirmek için, üretici dNTP karışımı verilen yerine biotinlenmiş dNTP karışımı kullanın. Biotinlenmiş dNTP karışımı kullanarak maliyeti 1 ABD Doları / tahlil dolardan az. Biotin esas biotinlenmiş bir astar kullanımı gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir. Ekle astar Gribi A 1.0 mcM son konsantrasyonlarda karışımları, gribi B 1.0 mcM ve iç kontrol için 0,14 mcM. Grip A astar set matris gen segmenti (1032 nt ürün) güçlendirir ve Flu B astarı kümesi olmayan bir yapısal gen segmenti (811 nt ürün) güçlendirir. Her bir FluChip astar seti tek iplikli DNA, PCR aşağıdaki lambda eksonükleaz ile enzimatik sindirim yoluyla üretimi kolaylaştırmak için bir 5 &#39;fosforilasyonunu grubu ile bir astar içerir. Tek telli ürün çift telli eşdeğer daha kısa hibridizasyon kez gerektirir ve genel tahlil süresi önemli ölçüde kısaltır. Bu primerlerin önceden hazırlanmış karışım yanı sıra iç kontrol şablonu RNA InDevR sınırlı olarak ilgilenen araştırmacılara mevcuttur. </li><li> Kısaca vorteks ve ince duvarlı PCR tüpleri içine ana karışımı 18 ul dağıtmak. </li><li> Şablon eklenmesi için uygun bir çalışma alanı buz tüpler transfer ve Her reaksiyon tüpüne 2 ul şablon ekleyebilirsiniz. </li><li> Transfer termal cycler ve aşağıdaki termal profili çalıştırın PCR tüpleri: 50 ters transkripsiyon ° 95 az 30 dakika, enzim inaktivasyonu / aktivasyonu için 15 dakika, 30 saniye 40 - 95 ° C PCR döngüleri, 55 ° C ° C 30s için C ve 72 ° C&#39;de 1 dakika ve 72 ° C 10 dakika için son bir uzantısı. </li></ol> 2. RT-PCR ürünleri düşük yoğunluklu mikroarray&#39;ler Hibritleşme <ol><li> FluChip hibridizasyon için tek iplikli DNA oluşturmak için, 1.0 ul lambda eksonükleaz enzim, eşlik eden reaksiyon tamponu ul 2.2 ve 0.8 ul nükleaz içermeyen su birleştirerek enzimatik sindirim karışım hazırlayın. Bu tutarlar, tek bir örnek, ama kolayca sindirilir örneklerin toplam sayısı için ölçekli olabilir. Termal cycler örnekleri çıkarın ve PCR ürün fosforile iplikçik sindirmek için her reaksiyon Hazırlanan karışım 4 ul ekleyin. Termal cycler ve program enzimatik sindirim ve ısı parçalanma adımları tamamlamak için 10 dakika boyunca 95 santigrat derece 15 dakika 37 santigrat derece termal cycler numune dönün. </li><li> Uygulamalı Mikroarray&#39;ler A.Ş. (Tempe, AZ) tarafından kullanılan özel grip mikroarray&#39;ler aldehit Fonksiyonlu cam slaytlar yazdırılır. 5&#39;-amino sonlandırılır yakalama dizileri (pozitif kontrol dizisi için ayrıca bir 3&#39;-biotin değişiklik ve 500 nM son bir konsantrasyon fark hariç), optimize edilmiş bir lekelenme tampon ile birleştirilmiş ve 20 mcM bir final konsantrasyon yazdırılır . Optimal bir nokta çapı 300 mm ve 700 mm merkezi pitch merkezi yöntemi lekelenme temassız kullanılır. </li><li> Saklama kutusu mikroarray&#39;ler çıkarın ve koruyucu tabakayı kaldırma ve iyi çevresine sıkıca basarak mikroarray&#39;ler etrafında tek kullanımlık hibridizasyon kuyu uygulamak. </li><li> Yeri 110 ml 60-90 rpm&#39;de orbital çalkalayıcı kullanarak 5 dakika öncesi hibridizasyon yıkama için arıtılmış su içeren bir yıkama bin slaytlar. Yavaşça kuyunun kenarına bir kağıt mendille silecek dokunmadan ve su uzakta kötülerin olmak için izin dizi kurulayın. </li><li> Parçalanmış ssDNA ürünleri her 22 ul, 2x Hibridizasyon Tampon ve mikroarray kuyulara hibridizasyon çözümleri pipetlemeyin 40 ul birleştirin. </li><li> Slaytlar, 60 dakika boyunca kapalı nem odasında melezleşme izin verin. </li><li> Nem odasından slaytları çıkarın, slayt rafın içine yerleştirmeden önce kısaca bir durulama şişe Yıkama Tamponu D dizileri durulayın. Genellikle durulama Yıkama Tamponu D hacmi 2 ml dizi başına. Yeri orbital çalkalayıcı 1 dakika boyunca 60-90 rpm&#39;de 110 ml Yıkama Tamponu A. Yeri bin içeren yıkama bin slaytlar içeren slayt raf. </li><li> Yıkama Tampon slayt rafa kaldırın, kısaca Yıkama Tamponu D, Yıkama Tamponu B içeren bir çöp transfer slayt raf ile temizleyin, durulayın ve 60-90 rpm&#39;de 5 dakika sallayın. </li><li> Her bir slayt dizi yavaşça, kuru ve kurutulmuş slaytlar ampliPHOX Kolorimetrik Algılama adımlar için hazırlık nem odasında yerde. </li></ol> 3. ampliPHOX: ampliTAG ile melezleşmiş ürün ve kalibrasyon cips etiketleme <ol><li> Birleştirmek<html> AmpliTAG 10 ul, 20 ul 2x ampliTAG tampon, ve 10 ul işlenecek her dizi için arıtılmış su. Reaktif hacimleri sadece örneklerin toplam sayısı ölçeklendirilebilir. Gerekli tüm örnek diziler ve kalibrasyon dizileri için hesap için yeterli etiketleme karışımı hazırlamak için emin olun. Gerekli kalibrasyon yongalarının sayısı tam bir kalibrasyon (yeni bir enstrüman ya da yeni reaktiflerin çok) ya da sadece bir araç kontrol yapmakta olup olmadığına bağlıdır. Tam bir kalibrasyon için, 3 kalibrasyon cips etiketli olmalıdır ve reaktif kontrol için, sadece tek bir kalibrasyon çip etiketli olmalıdır. Kalibrasyon dizileri etiketli önce, onlar daha önce grip diziler için açıklanan ön hibridizasyon yıkama adım geçmesi gerektiğini lütfen unutmayınız. </li><li> Her bir dizi için 40 ul etiketi karışımı aktarın ve 5 dakika boyunca kapalı bir nem odasında devam tepki etiketleme izin. </li><li> Yıkama Tamponu D dizileri slaytlar slayt rafa yerleştirmeden önce bir şişe durulama hemen yıkayın. Yıkama Tamponu C 110 ml içeren bin içine raf aktarın ve 5 dakika boyunca 60-90 rpm&#39;de sallamak. </li><li> Arıtılmış su ile dolu bir ikinci yıkama bin kullanarak, tuz artıklarını kaldırmak için üç ardışık kısa su dips gerçekleştirin. Dizilerin bir doku silecek kuyulardan kenarına hafifçe dokunarak kurulayın. </li><li> Mikroarray&#39;ler ampliTAG ile artık düzgün etiketli ve ampliPHOX saptama prosedürü geri kalan yapılabilir. Etiketli dizileri fotoaktivasyon ve görüntüleme 24 saat içinde tamamlanması ve ek dizileri kullanana kadar karanlık bir slayt kutusunda saklanabilir. </li></ol> 4. ampliPHOX: kalibrasyon, sinyal amplifikasyonu ve görüntüleme <ol><li> AmpliPHOX okuyucu açın ve ampliVIEW yazılım fotoaktivasyon için hazır olduğundan emin olun. </li><li> Kalibrasyon yongaları kullanarak optimal fotoaktivasyon zamanı belirleyin. Takip eden kısa bir giriş ek olarak, bu yordamı ampliPHOX Kullanım Kılavuzu da detaylı olarak özetlenen. Kalibrasyon cips, kalibrasyon çip yazılımı tarafından belirlenen bir olumlu sinyal üretmeye satır sayısı en üst düzeye çıkarmak amacı ile, testin hassasiyetini optimize etmek için kullanılan bir biotinlenmiş kontrol dizisi dilüsyonları bir dizi içerir. </li><li> 4 ila ampliPHY çıkarın ° C, oda sıcaklığına kadar ısınmasını bekleyin ve karıştırın kısaca girdap. Pipetleyin 3 ampliPHY şişenin içine ampliPHY arttırıcı ul ve 10 saniye boyunca iyice girdap. </li><li> Eşit kabarcıklar mevcut olmasını sağlamak, ampliTAG etiketli dizi içeren mikroarray 40 ul ampliPHY çözüm transfer. Her uygulama arasında ampliPHY flakon kapatın. Mikroarray slayt ampliPHOX Reader fotoaktivasyon yuvasına takın. </li><li> İlk kalibrasyon dizi için, yazılım sol panelindeki &#39;Zaman&#39; kutusuna varsayılan fotoaktivasyon zaman kullanmak ve fotoaktivasyon başlatmak için yeşil &#39;Başlat&#39; düğmesini tıklatın. Tamamlandığında, dizi kaldırmak ve aşırı ampliPHY kaldırmak için arıtılmış su ile durulayın. Clear polimer oluşumu bazı noktalar şimdi görünür olmalıdır. </li><li> Polimer noktalar 2 dakika kurumasını bekleyin, daha sonra iki damla dizinin üzerine ampliRED dağıtmak ve 2 dakika boyunca devam etmek için boyama izin. </li><li> Daha sonra, hızlı bir şekilde saf su ve kuru bir kağıt mendille silin mikroarray durulayın. </li><li> Mikroarray ampliPHOX Reader görüntüleme yuvasına yerleştirin ve Görüntüleme sekmesinde &#39;Capture Yeni Resim&#39; düğmesini tıklatın. Bir kez görüntülenmiş, kırpma ayarlayabilir ve görüntü kaydetmek. </li><li> Analiz sekmesinde, analiz başlatmak için Kalibrasyon Chip maskesi ve &#39;Otomatik Yerleştirme&#39; düğmesini seçin. Yazılım otomatik olarak sayısal sonuçlarını gösteren bir &#39;Özet Record&#39; üretecek. Bu sonuçlara göre, ikinci kalibrasyon dizi için fotoaktivasyon süresi 10 saniye ayarlanabilir, ve prosedür tekrarlanır. </li><li> En uygun fotoaktivasyon zamanı tespit edildikten sonra, örnek dizileri kalibrasyon diziler için kullanılan aynı sinyal amplifikasyon ve görüntüleme protokolü kullanarak işlenebilir. </li><li> Sonra örnek diziler için yakalanır, grip dizisi düzeni burada açıklanan özellikle dizi düzeni için bir maske created.The ampliVIEW yazılım otomatik görüntü analiz yapan ve her bir örnek için influenza alt tipleme sonuçları üretme yeteneğine sahip olabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 ampliPHOX kolorimetrik tespit yöntemi şematik gösterimi. (A) biotinlenmiş hedef DNA dizi her yerinde melezleşmiştir ve (B) ampliTAG ile etiketlenir. (C) ampliPHY çözüm eklendikten sonra, ve (D), görünür polimer noktalar oluşturmak için ışığa maruz. (E) oluşan polimer noktalar daha sonra kontrastı geliştirmek için toksik olmayan boya ile boyandı. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 (A) İnfluenza düşük yoğunluklu mikroarray düzeni. Diziler 1-7 ve 10-13 hedef İnfluenza A ve dizileri 8, 9 hedef influenza B (B) ampliPHOX ve (C) aynı algılama modeli gösteren bir 2009 romanı H1N1 (domuz gribi &#39;) örnek floresan görüntüleri hem de yöntemleri. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 Soldan sağ, influenza A H3N2, insan kaynaklı H1N1, 2009 romanı H1N1 (domuz kökenli), ve bir negatif örnek temsilcisi ampliPHOX görüntüleri. Tüm 3 alt tipi dizi görsel olarak farklı desenler gösterir. Sadece MS2 iç kontrol görülen negatif Bildirimi, RT-PCR belirten inhibe değildi.

<ol>
	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarrays+in+the+clinic:+infectious+diseases.">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li><li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays.">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li><li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology.">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li><li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MChip:+A+Single+Gene+Diagnostic+for+Influenza+A.">MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A.</a> Influenza: Molecular Virology. , (2010).</li><li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray.">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li><li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluChip:+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray.">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li><li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays.">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li><li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip,+a+three-dimensional+biochip,+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses.">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li><li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays.">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li><li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays.">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li><li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

Tüm yazarlar InDevR A.Ş., kar amacı gütmeyen bir kuruluş çalışanları. InDevR Burada açıklanan ampliPHOX teknolojisi ticarileştirmek.

Burada sunulan ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi, düşük yoğunluk mikroarray uygulamalar için tek renkli floresan tespiti için hızlı, ucuz bir alternatif. Şekil 1&#39;de şematik olarak gösterilmiştir, algılama ilkesi kullanımı ile ilgili bir photoinitiator etiket (1B) dayanır. Monomer içeren bir çözüm (1C) varlığı, ışığa maruz kalma photoinitiator (ampliTAG) yalnızca etiketli bölgelerde bir polimerizasyon reaksiyonu tetiklemek için (1D) neden olur. Influenza tanı...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman </th><th> Üretici </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Virüs Spin Kiti </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> tek 60 ul elüsyon </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> isteğe bağlı </td></tr><tr><td> ABI 9800 Hızlı Termal Cycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kiti </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> kiti kullanıldı. dNTP </td></tr><tr><td> 2x Spotting Tampon </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinlenmiş dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda eksonükleaz </td><td> Epicentre Biyoteknoloji </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip astar Karışımı </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> satilik henüz mevcut değil. </td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı </td><td> Madell Teknoloji </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Kovaları yıkayın </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Raflar yıkayın </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2x Hibridizasyon Tampon </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Kalibrasyon Chips </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponlar AD yıkayın </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Tampon </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY arttırıcı </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA mikrodizilerinin patojen tespiti için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin 1-5, tip ve alt tip grip virüsü yeteneğini pek çok örnek gösterilmiştir DNA mikrodizilerinin grip 6-11 tanımlama ve alt tipleme hem kamu uygulamalar vardır sağlık ve klinikte erken teşhis, hızlı müdahale ve bir influenza pandemisi etkisini en aza indirmek için. Geleneksel floresan şu anda en yaygın olarak kullanılan mikroarray tespit yöntemi. Ancak, klinik kullanımına yönelik mikroarray teknolojisi ilerledikçe, 1 düşük maliyetli algılama teknolojisi, floresan, benzer bir performans özellikleri sergileyerek, pahalı aletlerle yerine mikroarray deneyleri daha cazip ve uygun maliyetli hale getirecek. AmpliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi araştırma uygulamaları için tasarlanmıştır ve floresan mikroarray için gerekli konfokal mikroarray tarayıcılar ile karşılaştırıldığında yaklaşık on kat daha düşük cihaz maliyeti olan bir ana avantajı ile, geleneksel floresan 11 büyüklükte bir düzen içinde algılama sınırı vardır . algılama. Diğer bir avantajı, geleneksel floresan araçların aksine, taşınabilirlik ve esneklik sağlayan cihaz, kompakt boyutu. Polimerizasyon teknolojisi floresan algılama gibi doğal doğrusal olmadığından, ancak, bu gibi patojen tespiti diziler için belirli bir sırayla varlığı için bir evet / hayır cevabı istenilen düşük yoğunluklu mikroarray uygulamaları, en uygundur. Şu anda ampliPHOX algılama ile uyumlu en yüksek nokta yoğunluğu ~ 1800 lekeler / dizi. Çünkü nokta yoğunluğu sınırlamaları, yüksek yoğunluklu mikroarray&#39;ler ampliPHOX tespiti için uygun değildir. Burada, grip virüsleri tespit ve karakterizasyonu (FluChip) için geliştirilen bir düşük yoğunluklu mikroarray sinyal amplifikasyon yöntemi olarak ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mevcut. Bu protokol, benzer bir şekilde etiketlenir ve tespit edilebilir biotinlenmiş hedef içeren herhangi bir mikroarray ampliPHOX algılama, belirli bir uygulama olarak FluChip (DNA mikroarray) kullanmasına rağmen. Çekilecek hedef mikroarray tasarım ve biyotinilasyon kullanıcının sorumluluğundadır. Biotinlenmiş hedef dizi esir edildikten sonra, ilk etiketleme ampliPHOX algılama streptavidin-etiket konjuge (ampliTAG) ile dizi yapılabilir. (AmpliPHY) monomer çözüm ampliPHOX Reader enstrüman, polimerizasyon kullanarak ışık maruz kalma sonucunda ampliTAG etiketli hedefler içeren bölgeler yalnızca oluşur. Oluşan polimer sonradan basit bir yazılım paketi (ampliVIEW) kullanarak görüntüleme ve analiz takip görsel kontrastı artırmak için non-toksik bir çözüm lekeli olabilir. Yaklaşık 6 saat içinde sonuç un çıkarılan örnek tüm FluChip tahlil yapılabilir ve yukarıda açıklanan ampliPHOX algılama adımları yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza at JoVE.com

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray&#39;ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  InDevR Inc.. ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Video: ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...