Bu laboratuvar, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada (MSSC) Multipl Skleroz Derneği tarafından desteklenmiştir. GSTS MSSC Doktora Bursu layık görüldü. Bu yazıda pek çok yararlı tartışmalar ve yorumlarınız için Dr. Joan Boggs (Toronto Hasta Çocuklar, Hastanesi) için minnettarız. Biz Biotium ek NucView 488 kaspaz-3 cömert hediye için teşekkür ediyoruz.

1. Çözülme ve Kültürleme Hücreleri <ol><li> Uzun süreli sıvı azot mağazalardan donmuş ölümsüzleştirdi N19 oligodendroglial hücreleri stok alın. </li><li> 37 ° C su banyosuna daldırın flakon içeren hücreler, hücre süspansiyonu, tamamen çözülene kadar. </li><li> % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve% 1 penisilin / 10 cm kültür plakasına streptomisin ile desteklenmiş yüksek-glukoz ile 7 mL DMEM (Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta) ekleyin. </li><li> Hücre süspansiyon plaka açılan, bilge ve hafifçe ajitasyon ve hücreler eşit olarak dağıtmak için Petri plaka kaya ekleyin. </li><li> 34 ° C /% 5 CO 2 inkübatör Kültür hücreler. </li><li> 4 saat sonra, dölveriminin olarak kullanılır olmuştu kalan DMSO (dimetil sulphoxide) kaldırmak ve taze medya (7 ml DMEM yüksek-glukoz medya% 10 FBS ile desteklenmiş ve% 1 penisilin / streptomisin) yerine plakaları aspirat medya . </li></ol> 2. Pasajlanması Hücreleri <ol><li> % 70-80,izdiham (4-7 gün büyüme), medya hücreleri aspire. </li><li> Plaka için 1 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Pipet tripsin hücreleri (yaklaşık 5 dakika) ayırmak için. </li><li> Deneysel koşullar ve geçişi için uygun dilüsyonları bir hücre yoğunluğu az olduğu için 0.1 x 10 6 hücre / ml gelecek deneyler için ek bir 10 cm plaka olun. </li></ol> Not: deneyler için onları kullanmadan önce çözülme sonra en az iki kez geçit hücreleri gerekir. 3. Hücreler Sayma ve Kaplama <ol><li> Canlı hücre görüntüleme için plaka hücreleri için, daha önce açıklandığı gibi trypsinize. </li><li> Hücreleri yaklaşık 30 mcL çıkarın ve bir haemocytometer kullanarak saymak. </li><li> 6 plaka kaplamasız bir cam lamel yerleştirin. % 34 az 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ° C /% 5 CO 2 ile desteklenen 0.1 x 10 6 hücre / ml 2 ml fenol-DMEM yüksek glukoz medya yoğunluğu, iyi hücreleri ekleyin. </li><li> Izin vermek34 (16-20 saat) gece boyu büyümeye hücreleri ° C /% 5 CO 2 transfeksiyon önce. </li></ol> 4. Transfeksiyon <ol><li> 100 mcL serum özgür medya, plazmid DNA ve 4 mcL FuGENE HD (Roche) 0,5-4 mg saflaştırılmış birleştirin. Vortex yavaşça karıştırın. </li><li> Tekrar kısa bir süre vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA karmaşık ve daha sonra kültür hücreleri doğrudan FuGENE HD DNA karışımı ekleyin sağlar. Yavaşça karıştırın plaka yatırın. </li><li> 34 ° C /% 5 CO 2 tedavi veya deney öncesinde ek bir 48 saat için Kültür hücreler. </li></ol> 5. Canlı Hücre Görüntüleme için hazırlık Hücreler (LCI) <ol><li> LCI Chamlide canlı hücre aracı kontrol kutusu üzerinde deney başlamak istiyorum önce en az 1 saat açın. Kontrol kutusu da LCI Chamlide içinde sıcaklık ve nem düzenler ve önceden karıştırılmış% 5 CO 2 akışını düzenler. </li></ol> Not: Bu tavsiye edilirbaşlayan deneyler tüm aşamada 34 ° C ye ulaştığı sağlamak için önce 3 saat kadar kontrol kutusunu açmak Bu adım, görüntüleme sırasında, odak kayması, ısıtır gibi metal sahne fluxulation ve ısıl genleşme neden olduğu azaltacaktır. <ol start="2"><li> Chamlide manyetik tip kültür odası, bir akış-luk Çalışma sprey ve cımbız,% 70 etanol ve 5 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Inkübatör hücreleri çıkarın ve sağlıklı olduğunu onaylayın. Onlar yapışık görünür ve çok sayıda membran süreçleri ile cam lamel iyi yayılır. Transfeksiyon gelen vurguladı hücreleri deney için uygun değildir ve süreç uzantıları sayısı azaltılmış olacak ve genellikle düzensiz şekilli bir çekirdek kadroya sahip. </li><li> 6 plaka Tilt ve cımbız ile lamel kaldırmak. Kültür odasının alt plaka hızla lamel hücrenin yan yerleştirin. Lamel kurumasına izin vermeyin. </li><li> Manyetik ana takınkültür odası beden ve orijinal 6-lamel üstüne plaka medya 500 mcL ekleyin. Yeniden kullanarak bu ortamın çevresel değişikliklere yol açtığı hücrelerin üzerine yerleştirilen stres miktarı azalacak, hem de ekstraselüler salgıladığı faktörleri değerlendirmek için yararlı olabilir. </li><li> Kültür odası cam kapak yerleştirin. </li><li> Mikroskobu ile müdahale lamel altındaki herhangi bir kalıntı malzemeyi kaldırmak için% 70 etanol ile püskürtülür KimWipe kullanın. </li><li> 34 kültür odası yerleştirin ° C /% 5 CO 2 kuvöz, 30 dk . Bu adım, odanın kendisi 34 ısıtır emin ° metal ısınır C lamel değişen azaltmak için. </li></ol> 6. Mikroskop Ayarlar Görüntüler özel bir röle lens ve kartuş yükleme için birden fazla tekerlekleri emisyon filtre salyangozunu (Çekirdek Technologies Inc, G Leica DMIRE2 inverted mikroskop kullanılarak elde edildiuelph, ON). <ol><li> Aydınlık - Lamba 2,5 V ve pozlama 240 ms zaman ayarlayın. </li><li> Kırmızı Floresan Protein (RFP) - Kazancı 200 ms 140 olarak belirlenmiştir. </li><li> Yeşil Floresan Protein (GFP) - Kazanç 500 ms 140 olarak belirlenmiştir. </li><li> Mikroskop hücrelere ışık miktarını kontrol etmek için dönen bir disk yerine daha kısılabilir lambası vardır. Biz maksimum lamba yoğunluğu% 90 ile deneyler ışığında çalıştırın. </li></ol> 7. Apoptoz indükleyicileri ve NucView 488 Kaspaz-3 substrat Hücre Tedavisi <ol><li> Konsantrasyonları deneyler arasında tutarlı olacak şekilde, vaktinden önce apoptozis indükleyicileri büyük stoklar alikotları olarak hazırlamak ve onları dondurmak için çok önemlidir. </li><li> NucView 488 yüzey ışığa duyarlı. -20 ° C alüminyum folyo kaplı dondurma / çözdürme ve mağaza tüpleri azaltmak için 15 mcL hacimde hazırlayın. NucV maruz kalmayı azaltmak için mümkün olduğunca düşük ortam aydınlatması ile çalışıniew 488 substrat kullanımı öncesinde, ışık. </li><li> Hücrelerin sıcaklığı azalmaya maruz böylece inkübatör hızla kültür odası al. Kültür odasının mikroskop çevre odasının üzerine yerleştirin ve hareket kültür odası tutmak için kelepçeler kullanmak. Bu noktada oda ışıkları loş da olmalıdır. </li><li> Çift regülatör ile% 5 önceden karıştırılmış CO 2 tank açın. </li><li> 10x objektif kullanarak, parlak alan mikroskobu kullanarak bilgisayar monitörü hücreleri bulmak için odak Not: pozlama süresini azaltmak için istenen büyütme amacı, en büyük sayısal diyafram kullanmak isteyeyim. </li><li> Halinde 80 mM potasyum, ya da 100 mM glutamat) hücrelerinin (apoptozis indükleyici sunun, aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılabilir. Biz tipik bir kültür ortamı 10x konsantre olarak çözünmüş KCl kullanılarak, örnek olarak 80 mM potasyum teslim kullanabilirsiniz. <ol><li> Media döviz by yavaş ve yerel perfüzyon: - 80 mM potasyum içeren yeni medya kültürü odasında değişim medya peristaltik bir pompa kullanın. - Hortumun bir ucu odasından medya kaldıracaktır 10 ml, 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş bir stok ve hortumun diğer ucunu sunacak. - Odanın sol medya potasyum konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için medya en az 10x döviz istiyorum. Medya alışverişinde sonra, odasında medya NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. </li><li> Direkt olarak 80 mM K + ve NucView 488 kültür odasında medya substrat: - 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş 10x stok solüsyonu hazırlayın. - 50 mcL 10x 80 mM potasyum NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. 500 mcL fenol-DMEM kültür odasında ekleyin. Not: Bu yöntemEğer büyüme ya da özgün ortam mevcut olabilecek diğer salgıladığı faktörleri korumak veya değerlendirilmesinde ilginizi çekiyorsa tercih etti. Biz NucView 488 Yüzey sürece 36 saat süren deneyler için hücre kültürü kararlı olduğunu bulduk </li></ol></li></ol> 8. Live-hücreli Görüntüleme <ol><li> Transfekte hücreler kırmızı kanal görüntülemek için tıklayın. </li><li> Seçin ve bir düzine kare etrafında birkaç transfekte hücreler vardır ve bu &quot;XY noktaları&quot; kaydedin. Bilgisayar belleği miktarına bağlı olarak, elde etmek mümkün olacaktır sahne puan sayısı sınırlı olabilir. </li><li> Bu kaydedilmiş aşamasında mikroskop yakalama görüntüleri (parlak alan, kırmızı kanalı ve yeşil kanal) var, her 6 dakikada bir işaret etmektedir. </li><li> Deneylerinin erken aşamalarında görünen herhangi bir yeşil boyama muhtemelen transfeksiyon ve / veya çevresel stres nedeniyle genellikle zaten apoptozis gören hücreler, gösterir. Apoptdeneysel tedaviler nedeniyle osis deney daha sonraki bir timepoint tespit edilecektir. </li></ol> 9 - İstatistiksel Analiz <ol><li> Her bir deney için, verimli bir şekilde ayarlamak büyük bir veri toplamak için birden fazla XY puan elde etmek için mikroskop programı. Her deney yinelenen veya üç yapılır, ve veri, farklı günlerde yapılan ayrı deneyler derlenmiştir. Her bir veri kümesi, 15 alan görüş analiz ve kaspaz-pozitif hücrelerin (kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı görünümü / alan hücrelerin toplam sayısı) kaspaz-negatif hücrelerin oranı karşılaştırmak. </li><li> Her veri seti kaydedilen ölçümleri daha büyük bir örneklem kümesi halinde gruplandırılmış ve sonra bir ANOVA tablosu (p = 0.05) kullanılarak başka bir ile karşılaştırıldığında. Biz her bir deney (SEM) ortalama standart hataları göstermek ve sonra wh belirlemek için Tukey karşılaştırma testi anlamına gelir (p = 0.05) yaparak anlamına gelir farkı karşılaştırmakich tedavileri birbirinden önemli ölçüde farklıdır. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Biz NucView 488 substrat ekstrasellüler potasyum konsantrasyonu yüksek olan bir tedavi N19-OLG hücre kültürleri apoptozis oranında herhangi bir artış gösterir nasıl göstermek için bir deney tarif var. N19-hücreleri RFP ile transfekte ve ya 3 mcL NucView 488 substrat (kontrol), ya da 3 mcL NucView 488 substrat ve 80 mM ile tedavi edildi [K +] (tedavi). Hücreler monitorize edildi ve görüntüleri nörolojik hakaret (Şekil 1A) içeren çalışmalar için yeterli bir 12 saat zaman ders, üzerinden satın alındı. Kontrol koşullarında, 80 mM göre apopitoz önemli miktarda gözlemleyebilirsiniz vermedi [K +] 12 saat sonra (Şekil 1B) yaklaşık% 45 hücre ölümü gösterdi tedavi kültürleri (karma kutu). Arka plan yeşil sinyal gözlemlemekkontrol d ekstrasellüler potasyum ilavesi olmadan apoptozis gören hücreler gösterir. Diğer durumlarda deneyler uzun süre çalıştırmak için gerekli olabilir, ancak 12 saatlik bir zaman noktasında kontrol deneme sergi apopitoz hücrelerin hemen hemen hiçbiri. Görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edildi. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Şekil 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Şekil 1. (A) A N19 OLG kültürlerin 12 saat zaman elbette deney 48 saat sonrası transfeksiyon NucView 488 substrat (yeşil kanal) 3 mcL ile birlikte RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade. Kültürler ya 80 mM nihai bir konsantrasyon ile tedavi edildi [K +] (sol panelleri), ya da bir kontrol (sağ panelleri) olarak hiçbir tedavi . Görüntüler 6 dakika aralıklarla satın alındı ​​ve önemli bölünmüş kaspaz-3 aktivasyonu (yeşil sinyal) gözlemlemek olabilirbölünmüş kaspaz-3 hücreleri (görüş alanında hücrelerin toplam sayısına bölünmesiyle hesaplanan d 80 mM tedavi kültürlerde [K +] kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında hücre çekirdekleri (karma kutu) içinde (B) Yüzde kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı). Koşulları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, K + tedavi 12 saat sonra yaklaşık% 45 hücre ölümü gözlenen SVideo 1 N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman elbette deney 48 saat aydınlık alan görüntüler ve üç yönlü bir NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) ile birlikte, RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon Birleştirilen görüntünün, tedavi sonrası 80 mM [K +]. SVideo 2. N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman ders deney 48 saat NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon, parlak alan imag ile birliktees ve üç yollu birleştirilen görüntü. Kültürlerin tedavi uygulandı ve 80 mM tedavi edilen hücre kültürleri aksine N19-OLGs mikroskop alanında aracılığıyla geçiş görülebilmektedir [K +] (1 svideo ile karşılaştırın) .

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

Yazarlar, ifşa etmek için hiçbir çıkar çatışmaları var.

Bu apoptozis tespiti için mevcut tek EPA bir ürün olmamasına rağmen, NucView 488 substrat kullanarak birçok önemli avantajlar vardır . Önemli avantajlarından birisi de birçok alternatif ürünler ya hücre parçalama gerektiren veya hücre geçirgenliği zayıf iken, gerçek zamanlı olarak canlı hücrelerinde apoptozis takip yeteneği. Diğer faydaları kaspaz-3 tanıma, hücre geçirgenliği yüksek, düşük sitotoksisite ve apopitoz ilerlemesi ile hiçbir girişim için yüksek hassasiyet. Yüzey bölünmüş kadar düşük eşiğe ve eşiğe ortadan kaldıran çekirdeği girer. Kaspaz-3 tanıma sırası, 3 negatif yük içeren ve bir pozitif yük 2 DNA bağlayıcı boya vardır . DEVD NucView 488 molekül böylece kaspaz aktif değil hücrelerin DNA aktivasyonu ve boya bağlayıcı engelleyen bir net negatif yük vardır. Annedeneyler arasında tutarlılık intaining çoğaltır arasında anlamlı karşılaştırmalar çizebilir gerekmektedir. Transfeksiyon oranını etkiler tutarlı tutmak için ana parametreleri biri, hücre yoğunluğu. Yüksek transfeksiyon oranları elde edilmesi ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre kültürleri gibi HeLa veya HEK293 gibi diğer ortak hücre hatları ile daha zordur ve tecrübemizi 12, 13, yüksek yoğunluğuna bağlıdır . Bu hücreler için elimizden geleni transfeksiyon verimliliği Fugene HD (Roche) ile elde edilen ve normalde yaklaşık% 15, ancak inşa bağlı olarak,% 30 üzerinden ulaşabilirsiniz edilmiştir. Dikkatli hücre sayımı tutarlı transfeksiyon oranları elde edilmesinde yardımcı olacaktır. Apopitoz oranlarını ölçmek, özellikle çevresel stres aynı derecede farklı tedaviler hücreleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Özellikle, hücrelerin transfeksiyon reaktifler, ya da ışığa maruz kalma miktarı maruz üzerinde süresini önemli çevre değişkenables dikkate almak ve deneyler boyunca sabit kalmalıdır. Uygulamalar için, toplama alanları görünümü çok sayıda istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapmak için yeterince büyük bir örneklem büyüklüğü sağlar bulduk [age] .

Özel reaktifler ve ekipman Tablo <table border="1"><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Canlı Hücreler NucView 488 Kaspaz-3 Testi Kiti </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD transfeksiyon reaktif </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25% tripsin </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm cam lamel </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide SPK manyetik 25 mm için kültür odası lamel </td&gt; <td> Çekirdek Teknolojileri </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart doku kültürü 10 cm yemekleri </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-iyi doku kültürü yemekleri </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

Merkezi sinir sistemi, gerilmeler ve sonuçta nöronal nüfus ve işlev azalmasına neden sayısız olumsuz etkileri olabilir nörolojik hakaret, bir dizi deneyimi yaşayabilirsiniz. Hasarlı aksonlar da, astrositler ve oligodendrosit 8, 16 de dahil olmak üzere destekleyici glial hücreler daha fazla hakaret ve yaralanma üretebilir ekstraselüler matriks içine potasyum veya glutamat eksitatör moleküller de dahil olmak üzere serbest bırakabilirsiniz. Hakaret devam ederse, hücreler bir dizi köklü sinyal iletimi kaskadlar 14 tarafından düzenlenen ve aktif programlanmış hücre ölümü (apoptosis) tabi tutulacaktır. Apoptozis ve travmatik beyin yaralanması, serebral iskemi ve nöbet sonrası doku nekrozu oluşabilir. Apoptotik yönetmelik klasik bir örnek, bağımlı-sistein aspartat yönettiği proteazlar, veya caspases aile. Caspases dahil olmak üzere Aktive proteazlar da kronik nöro yanıt olarak hücre ölümüne suçlanmıştırAlzheimer, Huntington, Multipl Skleroz 4, 14, 3, 11, 7 gibi dejeneratif hastalıklar. Bu protokolde, aşağıdaki gibi yüksek konsantrasyonlarda gibi farklı ekstrasellüler streslere maruz N19-oligodendrosit ölümsüzleştirdi (OLG) hücre kültürleri 15, 5 kaspaz-3 aracılı apoptoz hızını ölçmek için NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımını tanımlamak potasyum veya glutamat. Koşullu ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre hattı (O2A progenitör temsil eden) Dr Anthony Campagnoni (UCLA Semel Nörobilim Enstitüsü) 15, 5 elde edilmiştir ve miyelin gen ekspresyonu ve önde gelen sinyal iletimi moleküler mekanizmaları incelemek için daha önce kullanılmakta olan farklılaşması (örneğin 6, 10) OLG. Biz eksojen miyelin bazik protein (MBP) ile transfeksiyon saygı ile sağlam olması bu hücre hattı bulduk RFP veya GFP (kırmızı veya yeşil floresan protein) 13, ya erimiş yapıları12. Burada, N19-OLG hücre kültürleri, 9 apopitoz indükleyen ekstraselüler matriks içine aksonal kaçak taklit 80 mM potasyum klorür ya da 100 mM sodyum glutamat ya ile tedavi edildi . Biz bir DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) kaspaz-3 tanıma alt birim ve DNA-bağlayıcı bir boya 2 içeren bir fırının kaspaz-3 substrat kullanılır . Substrat, hızlı bir şekilde hücre içi kaspaz-3 tarafından bölünmüş sitoplazma girer. Boya, NucView 488 serbest ve apoptozis sinyalizasyon, 488 nm dalga boyunda DNA ve fluoresces yeşil bağlar, hücre çekirdeğine girer . NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımı gerçek zamanlı 1, 10, canlı hücre görüntüleme için izin verir. Bu video olarak, biz de ölümsüzleştirdi N19 OLG hücreler kültür ve transfeksiyon gibi canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme kullanarak<em&gt; NucView</em&gt; 488 kaspaz-3 substrat. Bu teknik, çeşitli hücre tipleri ve dokular bir gerçek-zamanlı olarak programlanmış hücre ölümü testleri için geçerli.

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K Görüntüleme.  University of Guelph. Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme kullanarak NucView 488 kaspaz-3 substrat. Bu teknik, çeşitli hücre tipleri ve dokular bir gerçek-zamanlı olarak programlanmış hücre ölümü testleri için geçerli.

Video: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Sinirsel aktivite ve bağlanırlığı İntrakraniyal EEG veri SPM yazılım programıyla analiz

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

STED Mikroskobu Kullanılarak Nöronlarda Mitokondriyal Üst Yapının Ortaya Çıkarılması

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal Yaşlanmanın Kodunu Çözme 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...