Questo progetto è stato finanziato attraverso dal NIH / NCI codice di autorizzazione R00 CA127357 e l&#39;Università del Kansas Cancer Center Endowment.

1. L&#39;isolamento e l&#39;estrazione del collagene donatore di topi C57BL/6J <ol><li> Sacrificio matura normali topi di sesso femminile C57BL/6J utilizzando metodi approvati IACUC. </li><li> Raccolta le code e immergersi in etanolo al 70% per 45 minuti per sterilizzare i tessuti. Asciugare le code con carta velina, avvolgerlo in un foglio di alluminio. Conservare le code a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Mettere le code in un ambiente sterile come una cappa a flusso laminare. Utilizzando le forbici, dividere la pelle alla radice della coda e staccarsi dalla coda. Rimuovere 0,5 a 1 cm da entrambe le estremità della coda e dividere la coda rimanenti in tre o quattro pezzi. Sezionare i tendini dalle code e separare i tendini in singole fibre utilizzando una lama di bisturi o un rasoio. </li><li> Trasferire le fibre del tendine di un contenitore sterile e lavare con acqua distillata sterile. Tendini trasferimento dalla coda dei topi 5-7 per un tubo 50 ml contenente 35 ml sterile acqua deionizzata contenenti 50 unità / ml di penicillina penicillina, 50 mg / ml di streptomicina e 250 ng / ml di amfotericina, e 0,034 N acido acetico diluito una soluzione stock di acido acetico glaciale (17 N). Luogo il rocker a 4 ° C per una settimana per estrarre il collagene. </li><li> Spin down detriti in una centrifuga da tavolo a 3000 g per 15 minuti. Trasferire il surnatante, circa 30 ml a due tubi in policarbonato adattato per il rotore 50,2 Beckman Ti e girare a 35.000 g (circa 17000 rpm) per 1 ora. </li><li> Il volume del surnatante dovrà essere ridotto a raggiungere una concentrazione di 1-2 mg / ml. Trasferire il surnatante in un ultracel 50 unità di filtrazione k Amicon e spin in una centrifuga da tavolo a 3000 rpm per 15 a 4 ° C. Trasferire il filtrato in una provetta sterile conica e salvare. Ripetere la centrifugazione fino a quando il volume è ridotto a 5-6 ml. </li><li> Leggi la concentrazione di proteine. Usiamo un test standard di Bradford (Biorad), utilizzando standard di BSA (Biorad) e campioni non diluiti. Misurare un campione dal filtrato, come controllo negativo. </li><li> Ulteriore controllo per la purezza di estrazione, risolvendo un campione di collagene purificato su gel di poliacrilammide al 6% SDS, 10 corsie, spessore 1,5 gel mm. Preparare 20 mg di campione in 30 microlitri 1x SDS-PAGE tampone di caricamento glicerolo contenente 63 mM Tris HCl 10%, 2% SDS blu 0,0025% bromofenolo in 1,5 ml provette Eppendorf. Preparare una quantità equivalente di proteine ​​da collagene di tipo coda di topo io come controllo positivo. Inoltre, preparare una serie di standard BSA a 2,5, 5, 10, 20 mg diluito in PBS e tampone di caricamento 1X. Bollire i campioni a 95 ° C per 5 minuti. </li><li> Lasciate raffreddare i campioni e brevemente microcentrifuga (velocità massima per 10 secondi) di rallentare condensa. </li><li> Caricare i campioni campioni insieme ad un marcatore di peso molecolare. Per esempio, carico 5 ml di standard di proteine ​​Biorad Caleidoscopio. Elettroforesi a 150 volt per circa 1 ora o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo. </li><li> Rimuovere il gel e macchia nel buffer Coomassie blu. Preparare questo buffer mescolando 2 g di Coomassie blu, 75 ml di acido acetico glaciale, 500 ml di etanolo in un volume totale di 1000 ml contenente acqua deionizzata. Anche preparare la stessa quantità di tampone Decolorare utilizzando la ricetta, tranne senza reagente Coomassie blu. Coprire il gel con un volume sufficiente per Coomassie blu e posto su una sedia a dondolo. </li><li> Roccia dolcemente per 1 ora a temperatura ambiente e decantare la macchia. Sostituire la soluzione Decolorare quando diventa blu scuro. Trattenere il gel durante la notte o fino a quando le singole bande sono risolte sul gel. Individuare due fasce di collagene (peso molecolare = 90 kDa e 130 kDa) e nota la forza delle bande contro le norme ei controlli. L&#39;immagine del gel mediante un sistema di gel doc, se necessario. </li></ol> 2. Isolamento e la coltura delle cellule di carcinoma mammario donatore e da fibroblasti normali e topi PyVmT C57BL/6J <ol><li> Età sacrificio corrispondente femminile topi normali o transgenici PyVmT dopo 10 settimane di età quando i tumori sono evidenti e tangibili in PyVmT topi transgenici con metodi approvati IACUC. </li><li> Esporre il mouse sulla sua schiena su una superficie piana e immobilizzare gli arti con nastro adesivo. </li><li> Effettuare una incisione a T rovesciata tra i capezzoli della ghiandola mammaria toracica e inguinale e tirare il lembo cutaneo torna ad esporre le ghiandole mammarie. Rimuovere i tessuti mammari e tritare in piccoli pezzi con le forbici chirurgiche. </li><li> Preparare 100 ml di un cocktail digestione enzimatica contenente: 200 mg tripsina, collagenasi 500 mg, 4 mg DNAsi, 100.000 unità ialuronidasi in PBS sterile e antibiotici durante la notte sul ghiaccio e poi per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) per ogni campione e centrifuga pellet di cellule in una centrifuga da tavolo a 1500 rpm per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare delicatamente il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5-7 ml di FBS% PBS/10. Ripetere lo spin e lavare due volte. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente 10% FBS contenente 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina e 250 ng / ml di amfotericina in 10 piatti centimetri rivestito con collagene di tipo I. Per piastre cappotto con il collagene, diluire il 1 ml di collagene (utilizzando magazzino 1,5 mg / ml) in 39 ml di 0,02 N acido acetico diluito in acqua distillata sterile o PBS. Pipettare 5 ml di soluzione di collagene di lavoro su 10 piatti cm. Incubare a temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti. Aspirare collagene in eccesso. Piastre Parafilm inutilizzati e conservare a 4 ° C per una settimana. </li><li> Cambiare il supporto 2 - 3 volte a settimana. Digestione successo dei tessuti sarà caratterizzata dalla presenza di focolai epiteliali circondate da cellule a forma di fuso fibroblastica. </li><li> Separare i fibroblasti e cellule epiteliali da tryspinization selettiva. Aspirare i media e lavare le cellule con PBS una volta. Pipettare 1 ml di 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA su cellule e incubare a temperatura ambiente. I fibroblasti sono più liberamente aderenti rispetto alle cellule epiteliali. Verificare la presenza di distacco fibroblasti al microscopio dopo 2 minuti, le cellule devono galleggiare in sospensione o arrotondato, mentre focolai epiteliale dovrebbe essere ancora aderito alla superficie. </li><li> Toccare leggermente il piatto per allentare i fibroblasti e delicatamente pipetta 10 ml di siero supporto contenente nel piatto per rimuovere i fibroblasti. </li><li> Pipettare il supporto contenente fibroblasti in un tubo da 15 ml e centrifugare come descritto al punto 5). Replate queste cellule sul collagene rivestito 10 piatti cm e ripetere il processo selettivo tripsinizzazione fino fibroblasti e cellule epiteliali sono completamente separati. </li><li> Verificare la purezza delle cellule di immunofluorescenza per i marcatori epiteliali come CK14 e CK18 e marcatori dei fibroblasti, come actina alfa del muscolo liscio (α-SMA). </li></ol> 3. Immunofluorescenza di cellule in coltura <ol><li> Luogo coprioggetto di vetro in 6 piatti cm. Sterilizzare dall&#39;esposizione ai raggi UV per 5 o 10 minuti in una cappa a flusso laminare. </li><li> Rivestire il coprioggetto con 1-2 ml di soluzione madre di lavoro collagene per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare in eccesso. </li><li> Trypsinize e la piastra di 200.000 cellule epiteliali e fibroblasti per campione. Aggiungere 3-5 ml di mezzi di comunicazione completa e incubare per 24 ore. </li><li> Aspirare i media, lavare le cellule con PBS e fissare in metanolo ghiaccio freddo a -20 ° C per 7 minuti. </li><li> Lavare le cellule con PBS due volte per eliminare l&#39;etanolo, e bloccare con 1-2 ml di PBS contenente l&#39;1% FBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere i coprioggetti e posto in un grande contenitore poco profondo coperto con parafilm o superficie idrofoba altri. </li><li> Diluire i seguenti anticorpi primari 1:100 in soluzione bloccante: anti-actina del muscolo liscio (α-SMA, anti-CK14 (basale marcatore epiteliale), anti-CK18 (luminale marcatore epiteliale). </li><li> Pipettare 100 l di anticorpi direttamente sul coprioggetto per 1 ora a temperatura ambiente. Incubare un coprioggetto separata di cellule in soluzione di blocco; questo campione servirà come controllo anticorpo secondario. </li><li> Aspirare anticorpo e pipetta 1 ml di PBS direttamente sul vetrino da lavare. Aspirare e ripetere 3-5 volte. </li><li> Diluire i seguenti anticorpi secondari in soluzione bloccante: anti-topo-alexa 488 a 1:100, anti-topo biotinilato a 1: 500, anti-topo-Alexa-568. </li><li> Avvolgete il contenitore con il coprioggetto in foglio di alluminio. Pipettare 100 l di appropriati anticorpi secondari direttamente sul coprioggetto: α-SMA con anti-topo-Alexa 568, CK 14 colorazione con anti-topo biotinilato e CK18 con anti-topo-alexa 488. Coprire il contenitore per proteggere i campioni dalla luce visibile. </li><li> Aspirare anticorpi e lavare con PBS come al punto 9). Lasciare i campioni in PBS, fatta eccezione per CK14 colorazione. </li><li> Diluire streptavidina coniugata con Alexa 568 1:500 in PBS. Incubare la CK14 campioni colorati con strepatividin-alexa 568 per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare in PBS come al punto 9) </li><li> Diluire DAPI 1: 500 in PBS. Aspirare il PBS dai campioni e incubare con DAPI per 10 minuti RT al buio. </li><li> Lavare i campioni con PBS. Pipettare 100 l di prolungare anti-sbiadimento reattivo sul vetrino, girare il coprioggetto sopra in modo che le cellule si trovano ad affrontare il vetrino. Inclinare il coprioggetto a un solo angolo per fare delicatamente contatto con i media di montaggio. </li><li> Immagine i campioni utilizzando un microscopio immunofluorescenza. Conservare i campioni al buio per proteggere il segnale di immunofluorescenza, che durerà circa 2 settimane. </li></ol> 4. Preparazione delle cellule collagene embedded per l&#39;innesto <ol><li> Per incorporare le cellule del collagene, è necessario abbassare il pH del collagene per ottenere polimerizzazione mescolando il collagene con una soluzione di impostazione. Preparare la soluzione impostazione mescolando 100 ml di soluzione salina bilanciata Earl di 10X (EBSS) con 2,45 g di NaHCO3, 7,5 ml di NaOH 1 M e 42,5 ml di acqua distillata sterile. Ulteriori sterilizzare con un top bottiglia 0,22 unità filtro micron attaccato ad una bottiglia sterile. </li> &lt;li&gt; Mescolare il collagene (azione concentrazione di 1 mg / ml) con impostazione soluzione a partire 4: 1 rapporto. Per un trapianto, mescolare 100 ml di collagene con 25 ml di impostazione soluzione in una provetta Eppendorf. Vortex brevemente o pipettare il campione su e giù per mescolare il campione accuratamente. </li><li> Aggiungi collagene o soluzione impostazione in incrementi di 5-10 microlitri e mescolare bene fino a quando il colorante rosso fenolo nella colorazione passa ad un rosa chiaro al colore arancione, riflettendo un pH neutro. Un colore giallo indica pH acido, mentre rosa scuro riflette pH basico. Mantenere la miscela in ghiaccio per prevenire la polimerizzazione. </li><li> Rimuovere i fibroblasti e cellule epiteliali dalla piastra da tripsinizzazione. In primo luogo, aspirare i media e lavare con 5 ml di PBS. Pipettare 1 ml di 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA in HBSS per piastra. Fibroblasti incubare a temperatura ambiente per 2-5 minuti. Incubare cellule epiteliali a 37 ° C per 2-6 minuti. Toccare le piastre leggermente per allentare le cellule. Verificare la presenza di distacco con una microscope.Quench la tripsina pipettando 9 ml di terreno completo sul piatto e trasferire le cellule ad una sterile tubo 15 ml. </li><li> Togliere 50 ul e contare le cellule emocitometro. Si noti il ​​volume totale di cellule in ogni tubo (circa 10 ml). </li><li> Agglomerare le cellule a 1500 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il pellet e risospendere le cellule ad una concentrazione di 100.000 cells/100 microlitri. Per esempio, 500.000 risospendere le cellule in un volume totale di 500 ml di mezzi di comunicazione completo. </li><li> Mix 250.000 cellule stromali (250 microlitri) e 100.000 cellule tumorali (100 l) in un tubo separato. Microcentrifuga 10 sec rpm 1000, rimuovere il surnatante pipettando. Aggiungere 50 microlitri della soluzione del collagene regolato cellule. Pipettare su e giù per disperdere le cellule in modo uniforme. Pipettare i 50 microlitri di una piastra di coltura sterile 6 centimetri di tessuto per formare una goccia circolare. Incubare l&#39;innesto a 37 ° C per 10 minuti per polimerizzare. </li><li> Delicatamente aggiungere 5 ml di supporti completo nella piastra inclinando la piastra in un angolo e lentamente pipettaggio i media da un lato del piatto. Inclinare il piatto circa fino a quando i media copre l&#39;innesto. </li><li> Incubare per 24 ore a 37 ° C. Trapianto immediatamente. </li></ol> 5. Ortottica trapianto di cellule collagene incorporate nei topi C57BL/6J <ol><li> Realizzare una canna sottile di vetro per la chirurgia dei trapianti. Scaldare una pipetta Pasteur di vetro con un becco Bunsen. Utilizzando pinze, tratto alla fine della pipetta fuori a 2-3 mm di spessore. Lasciate raffreddare, e sterilizzare in etanolo al 70%. </li><li> Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici in autoclave e il 70% di etanolo: fine forbici chirurgiche, smussato forbici chirurgiche, pinze smussato, pinze sottili, clip, ad avvolgimento di base </li><li> Anestetizzare mouse utilizzando con 2-3% isoflurano usando una macchina isoflurano scavenging. La media O 2 velocità di flusso utilizzato è di 1 L / minuto attraverso il cono di naso. </li><li> Posare il mouse sul dorso e immobilizzare gli arti con nastro o altro adesivo rimovibile. Rimuovere i capelli con Epilatore chimici come Nair. Sterilizzare l&#39;addome con tampone di cotone in alternativa tra il 70% di etanolo e betadine in un obiettivo-come la moda. </li><li> Tenere una parte della pelle da parte della ghiandola mammaria con pinza smussato con una mano. Con l&#39;altra mano, usando smussato forbici chirurgiche di fare una testa in giù T-incisione tra il # 9 e # 10 capezzoli o # 4 e # 5 capezzoli delle ghiandole mammarie inguinale per esporre le ghiandole mammarie. </li><li> Fare un&#39;incisione sotto la tasca dei linfonodi o arteria mammaria con piccole forbici chirurgiche primavera. </li><li> Rimuovere l&#39;innesto di collagene dal piatto coltura di tessuti utilizzando pinze. Rimuovere il liquido in eccesso dal trapianto collagene tamponando delicatamente su una sterile pulire e far scorrere l&#39;innesto di collagene completamente nella tasca con una bacchetta di vetro sottile. </li><li> Sutura del lembo cutaneo utilizzando # 2 suture assorbibili nell&#39;intestino o graffette ferita. </li><li> Lasciate il mouse recuperare nella gabbia. </li><li> Monitorare i topi due volte alla settimana come minimo, la palpazione per i tumori. Sacrificare i topi quando il tumore raggiunge 1 cm di diametro. Harvest tessuti per l&#39;analisi. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: L&#39;isolamento e l&#39;estrazione del collagene dai topi C57BL/6J Queste procedure sono state adattate da 1. Estrazione di proteine ​​da collagene coda del mouse 5-7 produce circa 1-1,5 mg / ml in un volume finale di 6 ml o 6 - 9 mg di proteina. Da coommassie macchia, bande corrispondenti a 90 kDa e 130 kDa vengono rilevati nelle corsie caricato con campioni estratti da code di topo, che indica la presenza di collagene di tipo I e pro-collagene, rispettivamente (Figura 1). Isolamento e la coltura delle cellule di carcinoma mammario e fibroblasti di topi normali e PyVmT C57BL/6J. Le procedure sono state adattate da 2. Cellule di carcinoma PyVmT e fibroblasti possono essere distinti da differenze nella morfologia delle cellule e l&#39;espressione di specifici epiteliali e mesenchimali marKERS. Cellule di carcinoma PyVmT sono identificati per forma di ciottoli e co-express CK18, un marcatore del lume epiteliale e CK14, un marker basale epiteliale, ma non esprimono α-SMA (Figura 2). Fibroblasti mammari sono più grandi cellule con un fenotipo a forma di fuso ed esprimono alti livelli di α-SMA, ma non esprimono o CK14 CK 18 (Figura 2). Questi dati indicano oltre il 95% per la purezza delle cellule fibroblasti e cellule epiteliali utilizzando le procedure descritte. Ortottica trapianto di cellule collagene incorporate nei topi C57BL/6J Queste procedure sono state adattate da 3, 4. Trapianto di topi riceventi sono sacrificata quando i tumori in entrambi i gruppi sperimentali raggiungere 1,0 centimetri di diametro, o circa 60 giorni. Mentre il trapianto di cellule PyVmT solo risultati nei tumori palpabile dopo 30 - 40 giorni, raggiungendo una massa tumorale media di 0,335 grammi a 60 giorni, co-trapianto di cellule di carcinoma mammario PyVmT con risultati fibroblasti in una massa tumorale media di 0,630 grammi, indicando la valorizzazione della crescita tumorale da parte dei fibroblasti (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Analisi Coomassie macchia di collagene di tipo I estrazione da code di topo. BSA (~ 66 kDa) è indicata da una freccia. Commerciale collagene coda di topo (20 mg di proteine), e collagene purificato coda di topo (20 mg di proteine) sono indicati da box (~ 130 kDa, ~ 90 kDa proteine). Std = standard di peso molecolare. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Immunofluorescenza donatore di cellule di carcinoma mammario PyVmT e fibroblasti. Pannelli a e b rappresentano PyVmT cellule di carcinoma mammario immunostained per gli anticorpi anti CK14 e CK18. Pannello c rappresenta fibroblasti colorate con anticorpi α-SMA. Le immagini con DAPI sovrapposizione di ingrandimento 20x. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Lo sviluppo dei tumori mammari nei topi C57BL/6J in presenza o assenza di fibroblasti. Tumori mammari sono state raccolte dai topi trapiantati con cellule di carcinoma PyVmT in presenza o in assenza di fibroblasti mammari e pesato. Media + errore standard della media. N = 6 per gruppo.

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A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+non-invasive+single+marker+tracking+of+mammary+stem+cells+in+vivo+reveals+stem+cell+dynamics+throughout+pregnancy.">A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy.</a> PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).</li><li>Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracarotid+injection+of+fluorescence+activated+cell-sorted+CD49d-positive+neural+stem+cells+improves+targeted+cell+delivery+and+behavior+after+stroke+in+a+mouse+stroke+model.">Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model.</a> Stroke. 39, 1300-1306 (2008).</li><li>Duda, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells.">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li></ol>

Sperimentazione animale: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal comitato IACUC presso l&#39;Università del Kansas Medical Center.

Il contributo funzionale dei fibroblasti nella progressione tumorale è stata dimostrata attraverso modelli di trapianto, in cui il carcinoma fibroblasti associati co-trapiantati con mammarie benigne risultati cellule epiteliali in una maggiore crescita del tumore e l&#39;invasività 5. Approcci di trapianto convenzionale hanno comportato l&#39;utilizzo di topi SCID o nudi di co-trapianto di cellule stromali ed epiteliali provenienti da diversi background genetico del mouse o specie diverse. Topi immunocompro...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> C57BL/6N topi </td><td> Harlan </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> MMTV-PyVmT topi transgenici </td><td> Jackson laboratori </td><td> 002374 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Pescatore </td><td> SH3039603PR </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> VWR </td><td> 10000113873 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Pescatore </td><td> MT-30-001 </td><td></td></tr><tr><td> amfotericina </td><td> pescatore </td><td> BP2645-20 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon filtrazione colonne ultracel 50k </td><td> Millipore </td><td> UFC905008 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi per Beckman TI rotore </td><td> Beckman </td><td> 355618 </td><td></td></tr><tr><td> Ratto coda collagene </td><td> Pescatore </td><td> CB 40236 </td><td></td></tr><tr><td> EBSS 10x </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7510-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina 1X, 0,25% in HBSS w / o Calcio e Magnesio </td><td> Pescatore </td><td> MT-25-050-CI </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> Pescatore </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Coomasie blu </td><td> Pescatore </td><td> BP101 25 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T3924-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> Sigma AldrichC0130-50 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hyalronidase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3884 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Caleidoscopio proteine ​​di serie </td><td> Biorad </td><td> 1610375 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Pescatore </td><td> 12545-78 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto </td><td> VWR </td><td> 101400-042 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin anticorpi S-20 </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-7558 </td><td></td></tr><tr><td> α-actina del muscolo liscio anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab5694 </td><td></td></tr><tr><td> CK14 anticorpi </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> sc-53253 </td><td></td></tr><tr><td> CK18 anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab668 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo biotinilato </td><td> Vector laboratori </td><td> BA9200 </td><td> Distribuiti attraverso Fisher </td></tr><tr><td> Anti-topo-alexa-568 </td><td> Invitrogen </td><td> A10037 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P-36930 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91400-12 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici fine primavera </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11002-12 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 pinza sottile </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gut cromico sutura </td><td> Pescatore </td><td> NC9326254 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta Pasteur in vetro </td><td> Pescatore </td><td> 22-042-815 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Pescatore </td><td> A406P 4 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine </td><td> pescatore </td><td> NC9386574 </td><td></td></tr><tr><td> Ferita clip </td><td> Pescatore </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Ferita di base </td><td> Pescatore </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr></tbody></table>

mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in c57bl/6j mice

L&#39;influenza delle cellule stromali, inclusi i fibroblasti sulla progressione del tumore mammario è stato ben documentato attraverso l&#39;utilizzo di modelli murini, in particolare attraverso il trapianto di cellule stromali e le cellule epiteliali della ghiandola mammaria di topo. Modelli trapianto attuali che prevedono l&#39;utilizzo di topi immunocompromessi a causa della diversa provenienza genetica delle cellule stromali e cellule epiteliali. Matrici extracellulari sono spesso utilizzati per incorporare i due tipi di cellule diverse per coerenza interazioni cellula-cellula, ma implicano l&#39;uso di Matrigel o collagene coda di ratto, che sono substrati immunogenico. La mancanza di funzionalità delle cellule T di topi immunocompromessi impedisce una valutazione accurata delle cellule stromali sulla progressione del tumore della mammella in vivo, con importanti implicazioni sullo sviluppo di farmaci e l&#39;efficacia. Inoltre, i topi immunocompromessi sono costosi, difficili da allevare e richiedono condizioni di particolare attenzione. Per superare questi ostacoli, abbiamo sviluppato un approccio alla ortotopicamente trapianto di cellule stromali e le cellule epiteliali in topi dallo sfondo stesso genetico di indurre la formazione costante del tumore. Questo sistema prevede la raccolta normale, carcinoma fibroblasti associati, PyVmT cellule di carcinoma mammario e del collagene da donatore topi C57BL/6J. Le cellule sono poi integrati nel collagene e trapiantati nelle ghiandole inguinali mammaria di topo femmina C57BL/6J. Il trapianto di cellule PyVmT solo formare tumori palpabile 30-40 giorni dopo il trapianto. Analisi degli endpoint a 60 giorni indicano che la co-trapianto con fibroblasti favorisce la crescita del tumore mammario rispetto alle cellule trapiantate PyVmT solo. Mentre le cellule e la matrice di topi C57BL/6J sono stati utilizzati in questi studi, l&#39;isolamento delle cellule e la matrice e l&#39;approccio trapianto può essere applicato nei confronti topi provenienti da diversi background genetico dimostrando versatilità. In sintesi, questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni molecolari tra cellule stromali e le cellule epiteliali, e supera i limiti critici in modelli di topi immunocompromessi.

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.

Trapianto mammaria di cellule stromali e cellule di carcinoma in topi C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

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17.5K Views.  University of Kansas Medical Center. In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

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Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Umano arteria mammaria interna (IMA) Trapianti e Stenting: un modello umano per studiare lo sviluppo della ristenosi in-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Eterotopico cervicale trapianto cardiaco nei topi

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...