Name: non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres
Uploaded: 2014-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (US Army Medical Research Toplama Aktivitesi) # LAL için W81XVVH-10-1-0781 ve VE ödül ve (2) Susan G. Komen Vakfı hibe IR122224446 Lal ve VE etmek. Patoloji destek ve doku grossing nazik Inova Fairfax Patoloji Anabilim Dr. Hasan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, Dr. Charles Bechert&#39;in tarafından sağlandı. Hasta rızası ve örnek ihale ustalıkla Inova Fairfax Hastanesi&#39;nde klinik araştırma koordinatörleri Holly Gallimore Heather Huryk ve Emil Kamar tarafından yönlendiriliyordu.

İnsan meme dokusu Savunma Bölümü, George Mason University, ve Inova Sağlık Sistemi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından kabul protokollerini takip, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, bir araştırma çalışmasına dahil hastalardan toplanmıştır. 1. Büyüme Faktörleri ve Antibiyotikler Besin Zengin Orta hazırlayın <ol><li> Insülin stok çözeltileri, epidermal büyüme faktörü (EGF), streptomisin sülfat ve gentamisinsülfat hazırlayın. <ol><li> 10 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar steril filtre edildi su içinde insülin sulandırın. Steril 10 ml tek kullanımlık şırınga Tip 1 reaktif dereceli su aspire 10 ml. Şırıngaya 0.22 mikron polietersülfon filtre takın. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine steril filtrelenmiş su koyun. </li><li> Insülin 100 mg&#39;lık bir şişeye, steril filtre edilmiş su, 10 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde insülin flakon tutun. Insülin stok Solu 450 ul dağıtmak-20 ° C&#39;de etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri ve deposuna yon. İnsülin stok solüsyonu şişenin üzerindeki son kullanma tarihine kadar stabildir. </li><li> Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bir stok çözelti hazırlayın: 500 ug, EGF (stok 1 mg / ml) 500 ul steril su ekle. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde EGF şişesini tutun. <ol><li> EGF çalışan bir stok solüsyonu hazırlayın: 900 ul besin ortamında (çalışma stok / ul 0.1 ug olacaktır) için stok EGF çözüm 100 ul ekleyin. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. -80 ° C de, EGF çalışma stoğu etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi ve mağaza 50 ul koyun. Not: EGF stok çözeltisi (1 ug / ul) -80 ° C&#39;de 1 yıl stabildir; stok çözeltisi (0.1 ug / ul) çalışma -80 ° C &#39;de, 2 ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Bir analitik terazi üzerinde streptomisin sülfat, 40 mg tartılır. Streptomisin sülfat int yerleştirinoa steril 15 ml konik tüp. Besleyici ortam 4 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti, hafif pembe olmalıdır. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Streptomisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li><li> Bir analitik terazi üzerinde gentamisin-sülfat ve 20 mg tartılır. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine gentamisin sülfat yerleştirin. Besleyici ortam 2 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti sarı olmalı. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Gentamisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li></ol></li><li> (20 (. 100 ug / ml nihai konsantrasyon), (. 10 ug / ml nihai kons), (. 10 ng / ml nihai kons) streptomisin sülfat insülin, insan rekombinant EGF ile takviye edilmiş bir besleyici ortam içinde iki adet 200 ml&#39;lik toplu hazırlayın ve gentamisinsülfat ug / ml final kons.). <ol><li> 0.2 um polietersülfon filtre şişesi ile donatılmış bir vakum filtre şişesi ve 250 ml&#39;lik bir alıcı şişeye 200 mi besin ortamı ilave edin. Ekleme 20 ve181. l çalışma stoğu, EGF, 200 ul stok insülin, 2 ml stok streptomisin sülfat ve besleyici ortam içinde 200 ml 400 ul stok gentamisin sülfat. Bir vakum filtre balon takın. Orta Filtre. Filtreyi atın ve &quot;zengin besin ortamı&quot; olarak şişesi etiket. 14 güne kadar, 4 ° C&#39;de depolayın. </li></ol></li></ol> 2. Doku Toplama ve Çok Satılan Uygulamalar <ol><li> Ameliyathanede, meme dokusu sağlandıktan sonra steril tekniği korumak. Steril bir tepsiye meme dokusunu yerleştirin ve steril plastik wrap ile tepsiyi örtün. <ol><li> Kurumunuz tarafından gerekli şekilde Radyoloji / Patoloji için kapalı tepsiye doku taşıyın. Tepsiyi açmayın. Ulaşım süreleri kurumlar içinde değişebilir. Doku kadar 45 dakika sonrası eksizyonu RT&#39;de bu kapalı tepsiye canlı kalabilir. Ancak, besin açısından zengin ortama doku istemi işleme sonraki organoid kültürü için en uygun koşulları sağlar. </li></ol></li><li> Brüt doku diseksiyonu meme dokusu içinde DCIS&#39;lı alanları tanımlamak için: doku kısırlık korumak için doku diseksiyonu sırasında steril eldiven, bıçak, neşter, doku işaretleme boyaları, ve sirke kullanın. <ol><li> % 70 etanol veya% 1 çamaşır suyu ile çalışma alanını temizleyin. Steril eldiven açın ve çalışma yüzeyine eldiven sarıcı yerleştirin. Eldiven sarıcı yüzü yukarı steril içini yerleştirin. Steril eldiven giyin. <ol><li> % 70 etanol ile örnek kabın yüzeyini temizleyin. Doku örneği kaptan plastik kaplamayı çıkarın ve eldiven sargı üzerinde numune yerleştirin. </li></ol></li><li> Doku işaretleme boyası içine iki pamuk uçlu bezlerden batırın. Doku yüzeyi boyunca bezlerden yuvarlayarak doku yüzeyine boya uygulanır. NOT: Her patoloji bölüm standart bir boya renk / doku yönlendirme protokolü vardır. Doku hastada konumu ile ilgili olarak doku yönlendirmek için boya ile etiketlenir. Boya lekelendi ya dadoku üzerine boyanmış. Doku üzerinde boya dökmeyin. Boya Dökme boya böylece cerrahi sınırların yönünü kafa karıştırıcı doku boşluklarına / çalıştırmak damla neden olabilir. Doku yönelim cerrah ve bir anatomik yerler ile patolog) doku örneği tanımlamak, ve b) tümör ile ilgili olarak cerrahi sınırların yerini belirlemek sağlar. </li><li> Steril gazlı bez üzerine damıtılmış beyaz sirke (% 5 asetik asit) dökün. Sirke batırılmış gazlı bez ile boyanmış doku kurulayın. Gazlı bez atın. Sirke boyalar işaretleme dokuyu düzeltmek için kullanılır. </li><li> Yaklaşık 5 mm kalınlığında dikey dilimler halinde meme dokusunu kesti. Doku (Şekil 2) aracılığıyla tüm yol kesmeyin. / Gözlemlemek kalsifikasyon alanları için doku palpe. Kendi karakteristik firması tarafından DCIS belirlemek, kırmızımsı çevrili görünüm soluk, (nedeniyle kalsiyum spikülleri için) cesur hissediyorum lastik sınırları. NOT: Bazı durumlarda, komedondur (sivilce gibi) alanlar olabilirBüyük çaplı DCIS lezyonlarında nekrotik malzemeyi temsil eden beyaz noktalar olarak görülmektedir. </li><li> Meme dokusunu çevreleyen küçük bir miktar da dahil olmak üzere, DCIS / kalsifiye meme dokusunu kesip. Aşama 1 &#39;de hazırlanan besleyici zengin ortam 20-30 ml ihtiva eden steril bir 50 ml tüp içine meme dokusu yerleştirin. <ol><li> Yavaşça tüpü birkaç kez ters yüz edilerek doku ve orta karıştırın. Orta atın ve taze orta ekleyin. Izole edilmiş bir kap içine doku ve ortam ihtiva eden tüp yerleştirilir ve doku kültürü laboratuara doku taşımak. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Doku Kültürü <ol><li> Biyolojik güvenlik kabininde çalışan doku ve steril bir Petri kabı içine besleyici ortam küçük bir miktar dökün. Steril bir neşter kesip ve fibröz doku atın kullanma. Adet (organoids) içine meme dokusunu yaklaşık 3 mm 2 (Şekil 1C-D) kesti. Doku kesmek için çalışın, böylece her organOSB çevreleyen stroma sahip en azından bir ayırd edilebilir kanal segmenti ihtiva eder. </li><li> Doku kültür şişesi kapağını açın. Steril cımbız veya forseps kullanılarak, şişeye organoids yerleştirin. Kapağı kapatın. Petri atın. </li><li> Doku kültür şişesine 11 mi serumsuz besin yönünden zengin ortam (aşama 1 &#39;de hazırlandı) ekleyin. Şişeyi kapatın ve organoids ve orta eşit kap yüzeyinden (Şekil 1E-F) arasında dağıtılır böylece balon girdap. </li><li> 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. Bu süre boyunca bir balon içinde hareket ettirmeyin. </li><li> Gün 2 sonrası inkübasyon, potansiyel bakteri / mantar kontaminasyonu kontrol etmek için inkübatör şişeyi çıkarın. Şişenin ani, keskin hareketler, ya da türbülans kaçının. Ters bir mikroskop sahnede şişesi yerleştirin. <ol><li> Bakteri, maya ve / veya mantar için orta dikkate alınmalıdır. Herhangi bir kirlenme tespit edilirse, bir eklenti için inkübatör şişeyi geriitional gün. Kirlenme tespit edilirse, uygun bir kap içinde bir balon içinde ve içindekileri atmak. </li></ol></li><li> 3. günde enkübasyonunda, taze ortam ile koşullandırılmış bir ortam değiştirin. <ol><li> 20-30 dakika süre ile 37 ° C &#39;de, bir steril tüp içine ortamı 11 ml yerleştirin. Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. Organoids bozmadan çıkarın ve steril bir serolojik pipet kullanarak şişeye içinde orta atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. </li><li> Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol> Kurulmuş organoid / Epitel Hücre Kolonileri 4. Bakım <ol><li> Her 2 haftada bir taze ortamı hazırlayın ve doku kültürü şişesinde haftada 3 kez ortamı değiştirin. <ol><li> 37 ° C&#39;de steril bir kap içinde ortam 11 ml yerleştirin20-30 dakika süreyle ° C. Inkübatör şişeyi çıkarın. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kaldırmak ve organoids rahatsız etmemek için dikkatli olmak şişesi klimalı ortam atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li><li> 10 sonra, - 14 günlük kültür, yapışkan olmayan bir kültür şişesi içinde doku parçaları alın. <ol><li> Ksenograft transplantasyon için periyodik olarak hasat hücreleri ve / veya yeni kültür şişelerine yayılması için şişeden organoids, ya da fenotipik ve / veya moleküler analiz için. </li><li> Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. % 70 etanol ile balonun püskürtün. % 70 etanol ile püskürtülür olmuştur temiz bir kağıt havlu ile balona aşırı etanol silin. </li><li> Organoid yayılımı: &lt;ol&gt; <li> Şişenin kapağını açın ve biyolojik güvenlik kabini kapak yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Mikroskopik görüntüleme altında, organoid (ler) hasat edilmesi bulun. Pick-up için bir organoid steril cımbız veya forseps kullanın. </li><li> Yeni bir kültür şişesi içinde organoid yaymak için, yeni bir şişede organoid yerleştirin. 11 ml taze, sıcak orta ekleyin. 3.6.3 - adımda 3.3 de tarif edildiği gibi, bir nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Doku kültüründe, hücre kültür ortamı haftada üç kez şişe yerleştirin. </li></ol></li><li> Hücrelerin hasat: <ol><li> Direkt mikroskobik vixualization altında, hafifçe kazıyın ve aspire hücreler ve mammospheres steril tek kullanımlık pipet uçları ile 1000 ul pipet kullanarak. Hücreleri ve çevresindeki ortam aspire. Steril mikrosantrifüj tüpü içine hücre / orta koyun. </li></ol></li><li> 5 saniye boyunca 12.100 xg&#39;de mini-santrifüj kısaca hücreleri Spin. Çıkarın ve orta atın. &lt;ol&gt; <li> DNA analizi için hemen -80 ° C &#39;de, uzun süreli saklama, ortam (10 ul), küçük bir hacim içinde, kuru buz üzerinde hücre pelletini dondurma. </li><li> Proteomik analizi, kütle spektrometrisi veya batı benekleme / ters fazlı protein mikrodizilerinin 2x SDS Tris-glisin tamponu 8 M üre, 10 ml içinde hücreler lize edildi. Alternatif olarak, immünohistokimyasal analizi için hücre smear yapmak için bir Sitosantrifüj hücreleri dönerler. </li></ol></li><li> Bir şişeye hücreleri hasat ettikten sonra, kaldırmak ve kalan orta atın. Sıcak, taze besin zengin ortamdan 11 ml ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif kültür sistemi temel ve translasyonel araştırma çalışmaları için yaşayan pre-invaziv neoplastik meme hücreleri üretmek için yeni bir model oluşturmaktadır. Geçmişte, pre-malignan göğüs kanserindeki ilerlemeler, tipik olarak üç farklı yöntem kullanılarak incelenmiştir. İlk yöntem histopatolojik ve microdissected dondurulmuş veya sabit insan örneklerinin 12-14 genetik analizi. İkinci yöntem, insan pre-invaziv meme lezyonlarının 15 benzer olduğu düşünülen hiperplastik alveol nodüller (HAN lezyonlar) ihtiva fare modelleri kullanır. Üçüncü model, morfoloji 3,4 gibi son derece farklılaşmış DCIS var MCf7 alt hatları (MCF10A) gibi meme kanseri hücre hatları kurulmuştur kullanır. Bu üç model meme kanseri ilerlemesine moleküler ipuçları vermiş olsa da, bu yöntemlerin hiçbiri malign potansiyeli veya hastanın bireysel lezyon (lar) moleküler fenotip değerlendirmek yeteneğine sahiptir. Histopathologic analizi ön-invazif lezyonlarında hücrelerin fonksiyonel fenotipi hakkında bilgi sağlamaz. Meme kanseri ilerlemesinde fare modeli yerinde 16-18 &#39;de histomorphology ve insan atipik duktal hiperplazi, yerinde lobular karsinom çeşitliliği ve duktal karsinom yansıtmayabilir. Ayrıca, stromal mikro-ortam ve hücre-dışı matrisi çevreleyen, bir fare öncü lezyonların depozisyon insan muadili 16 belirgin bir şekilde farklıdır. Spontane fare öncü lezyonların, invazyon ve metastaz için ilerleme çok düşük seviyede sergileyebilir. Bağışıklık sistemi baskılanmış konaklar 3,4 naklediliyor eğer Üçüncü yöntem, kültürlü hücre hatları, sadece fonksiyonel fenotipik bilgi sağlayabilir. Buna ek olarak, bir uzun bir pasajlanmışlardır hücre çizgisinin genetik anormallikler insanlarda 2 spontan meme kanseri ilerlemesi temsil olmayabilir. Son olarak, iyi kurulmuş olduğu her hastanın neoplazmıişgali ve metastaz 13,14,17 için büyüme oranını, farklılaştırılmış devlet ve ilerlemesini sürücü genetik ve epigenetik anormalliklerin eşsiz bir kombinasyonu vardır. İnsan pre-invaziv lezyonlar hücre kompozisyon ve histomorphology multifokal ve heterojen vardır. Ayrıca, biyolojik malign potansiyel bir hastanın pre-invaziv lezyon için bilinmemektedir. Bizim birincil doku kültürü yöntemi insan pre-invaziv meme kanseri önceki modellerin eksiklikleri gideren ve aşağıdaki avantajları sağlamaktadır: 1) organoid kültür sistemi kendiliğinden yetişen ve üretecek mammospheres oluşturmak doğal doku mikroçevresinin içinde neoplastik hücre popülasyonlarının büyümesini destekler fare ksenogreft modellerinde invaziv tümörler. Hücreler, tek bir hastanın genotipi ve fenotipi ve böylece kişiye tedavi veya tek tek prognoz için bilgi sağlar. 2) Organoid kültür sistemi Bakımains yerli hücre alt-popülasyonları bulunduğunu ve primer meme dokusu içinde orjinal olarak mevcut olmayan bir habis epitel hücreleri, stromal hücreler ve bağışıklık hücrelerini yetiştirmek için bir araç sağlar, ve organoid içinde kültürü yapılmıştır. Kültür sisteminde ortamının düşük hacimli bir suni bir üç boyutlu yapı iskeleleri için gerek kalmadan yapılar gibi spontan mammosphere oluşumu ve farklı kanal ve alveollere teşvik oksijen değişimini destekler. 3) Birincil hücre kültürü, enzimatik çözünme ya da egzojen genetik modifikasyonla elde modifikasyonlar ve seçim içermez. Bundan başka, besleyici ortam, düşük maliyetli ve hazırlanması basit. 4) moleküler ve genetik analiz tüm kültür bozmadan zaman içinde farklı noktalarda kültürden spesifik hücre popülasyonları ve / veya organoids üzerinde yapılabilir. 5) Organoid kültür sistemi yerel hücre popülasyonlarının büyümesi, ayırt morfolojisi ve hücre-hücre etkileşimleri izin veren canönce ve kültür ortamı içine terapötik maddeler ilave edildikten sonra incelenecektir. Birincil doku kültürü bazı avantajları olmasına rağmen, herhangi bir sınırlama olmaksızın değildir. Organoid Kültür herhangi birine hücre tipinin büyümesi olmaksızın, karma hücre kültürlerinin gelişimini destekler. Fakat, hücre tipleri ile ilgili spesifik oran in vivo olarak bulunan tam hücresel oranlarını özetlemek olmayabilir ve böylece kontrol edilebilir ve edilemez. Başarılı organoid ekimi birçok toplum hastanenin patoloji laboratuvarlarında rutin işlemler değildir, her ikisi de steril doku toplanması ve işlenmesini gerektirir. Klinik araştırmacılar arasında iyi bir iletişim, cerrahi personel, ve patoloji personel hasta bakımı süreklilik içerisinde örnek sterilitenin sağlanması için gereklidir. Organoid kültür Diğer bir kısıtlama, hücre fenotipinde ve gen ekspresyonu 16,19 üzerinde alt döküm sertlik etkisidir. Kültür içinde kök hücrelerin farklılaşmasıSerum ihtiva eden ortamda ilavesiyle indüklenebilir ya da kültürde uzun zamana bağlı olabilir. Bir kök benzeri fenotip, bu enzimatik olmayan serum içermeyen Organoid kültür sisteminde 5 birkaç ay sonra muhafaza edilmiştir. Hücreler, daha küçük, daha yoğun hale gelir ve mammospheres formu başarısız - Bununla birlikte, zaman içinde bir noktada, hücreler morfolojik olarak görülebilen ayırt edebilir. Böyle transfections gibi zamanla hücre fenotipi değişiklikler, moleküler deneyleri, potansiyel sorunları önlemek veya tahlilleri yıkmak için, oldukça eski kültürlerin (6 aydan fazla) daha genç kültürleri ile yapılmalıdır. Başarılı organoid kültürüne tuşları kültürü şişesi ortamı uygun bir birim kullanarak ve organoids zaman doku kültürü şişesi uymak için izin vermiş olursunuz. Şişe sınırları oksijen geçirgenlikleri aşırı ölçüde ortam, mammosphere oluşumunu inhibe etmek. Ilk 3 - organoids TIS bağlanması için, doku kültürü 7 gün kritikkültür şişesi dava. Bir organoid gün 14 ile bağlı değil ise, genel olarak, büyük olasılıkla hiçbir canlı DCIS duktal kesimleri içermez ve yapışık hale olmaz. 14. günde yapışık olmayan Organoids kültürden çıkarılabilir olmalıdır. Uygun bir meme DCIS kanallarının olmaması% 10 formalin içinde organoid sabitlenmesi ve doku boyama ve mikroskopik değerlendirme için, parafin blokları halinde doku işleyerek sonra kültür doğrulanabilir. Bizim enzimatik olmayan, serum içermeyen kültür sistemi bulguları invaziv potansiyeli genetik olarak anormal neoplastik ön-madde hücreleri, önceden invazif insan meme lezyonu 5,9,20 içinde var olduğu hipotezini desteklemektedir. Bu bulgu Sgroi ve ark., Insan meme ön-invaziv lezyonlar ve Damonte ark genetik analiz gerçekleştirdi. Meme intraepitelyal neoplazi akıbet okudu (MINO) meme kanseri ilerlemesi 12,14 sıçan modelinin önceki çalışmaları ile tutmak olduğunu 21. Alınan togeTher diğerlerinin sonuçlar ile, bireysel hasta önceden invaziv lezyonlar dahil olmak kültürü modeli, bir hastanın invasif göğüs kanserinin agresif fenotipi, büyük ölçüde ön-invazif aşamasında önceden belirlenmiş olabilir kavramını desteklemektedir.

Meme kanalları ve alveollere (in situ duktal karsinom) sınırları içinde epitel hücrelerinin çoğalması invaziv duktal ve lobüler meme kanserine bağlı zorunlu bir habercisi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyon dinamiği tam olarak anlaşılamamıştır. Önceden istilacı meme karsinomu hücreleri veya herhangi bir ön-invaziv tümör tarafından kullanılan hayatta kalma mekanizmalarını, açıklık getirecek öldürme, ya da, ön-invazif neoplazmaların 1 önlenmesi için tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir. Ancak, işlevsel okuyan insan pre-invaziv lezyonlar için düşük maliyetli basit yöntemler eksik edilmiştir. Dönüştürülmüş hücre çizgileri in vitro tek tabakalı kültürü oluşturulmuş bir laboratuar yöntemi olup, bu ölümsüz kılınmış hücre kuşaklarının fenotip ve genotip olsa da, birincil insan tümör hücreleri 2 moleküler durumunu özetlemek için başarısız olur. Bunun da ötesinde, Tümörjenik MCF-10A hücre hattı, burada recapitulates 3-D meme bezi mimarisi, yeterince fonksiyonel fenotip ve bireysel bir hastanın pre-invaziv meme lezyonu 3,4 moleküler özelliklerini yansıtmamaktadır. Işgalinin yeteneğine kök benzeri neoplastik hücrelerin in situ (DCIS) hücre popülasyonunda duktal karsinom içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, (Şekil 1) 5 toplanması ve cerrahi sırasında steril insan meme dokusu kültürü için bir yöntem geliştirdi. Bizim ex vivo meme organoid kültür sistemi izole ve taze insan meme duktal karsinoma dokusunun 6-8 mammosphere oluşturan hücrelerin çoğaltılmasına yönelik, enzimatik doku bozulması, bazal membran ekstresi matris veya fibroblast tükenmesine dayanmaz. Yeni sistem, hücre akış / göç 5 esasına dayanır. Fark meme kanalı, ve çevresindeki stromal serumsuz Besleyici ortam (sadece e ait minimum bir hacmi içinde batıkKültür ortamının etkisine maruz kalan kanal kesme yüzeyi ile, gaz alış-verişini en üst düzeye çıkarmak, ama şişenin (Şekil 1E-F) belli bir yön olarak) kanal parçalarını kapsayacak şekilde nough. Bu kültür sistemi hücreleri otolog stroma ve kültür şişesi üzerine kanalın dışına ve / &#39;a taşımasına olanak tanır. Sadece Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), insülin ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir besin ortamı, organoid çıkan karma hücre popülasyonlarının büyümesini desteklemektedir. Doku kültürü şişesi Steril nemlendirilmiş bir ortamı muhafaza ederken, organoids ve / veya hücreler tüm şişe veya komşu organoids bozmadan hasat edilmesine olanak tanıyan çıkartılabilir, tekrar kapatılabilen bir kapak yer alır.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>A405-P</td><td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>18 M&amp;Omega;-cm water, sterile filtered</td><td></td><td></td><td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>10 cc plastic disposable syringe, sterile</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2520</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>with L-glutamine</td></tr><tr><td>Insulin, human recombinant</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td>100 &amp;micro;g/ml stock</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1567</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G19114</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Filtration flask and filter top, sterile</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>0.22 &amp;micro;m PES membrane</td></tr><tr><td>25 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4489</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>10 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4488</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td><td>CDI</td><td>MD2000</td><td>after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicators, sterile</td><td>Fisher</td><td>23-400-115</td><td>single use only</td></tr><tr><td>Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile</td><td>Fisher</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td><td>Samco</td><td>202-20S</td><td></td></tr><tr><td>Vinegar, white distilled</td><td>household use</td><td></td><td>5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td></tr><tr><td>#10 scalpels, sterile, disposable</td><td>Thermo Scientific</td><td>31-200-32</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, sterile</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>TPP 115 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask, with removable lid</td><td>MidSci</td><td>90652</td><td>screw cap with filter</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher</td><td>13-998-074</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C, humidified chamber</td></tr><tr><td>inverted light microscope</td><td>Olypmus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>8 M urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>2X SDS tris-glycine buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>optional, for preparing cell smears</td></tr></tbody></table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

In situ (DCIS) Meme duktal karsinom, tanımı gereği, kollajenöz bazal membran ihlal etmeden, meme kanalının sınırları içinde neoplastik epitel hücrelerinin proliferasyonudur. DCIS invaziv meme kanserleri olmayan bir zorunlu habercisi iken, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyonları tam olarak bilinmemektedir. Işgalinin yeteneğine progenitör hücrelerin DCIS hücre popülasyonu içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, doku enzimatik bozulma olmadan, ameliyat sırasında steril insan meme dokusu toplanması ve kültürü için bir yöntem geliştirdi. Duktal segmentleri içeren steril meme dokusu rutin patolojik incelemede aşağıdaki cerrahi olarak çıkarıldı meme dokusu hasat edilir. DCIS ihtiva eden doku, doku kültürü laboratuara besin yönünden zengin, antibiyotik içeren, serumsuz ortama yerleştirilebilir, ve nakledilir. Meme dokusu daha dissecte olduğunud kalsifiye alanları izole etmek. Birden fazla meme dokusu parçaları (organoids) nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde çıkarılabilir bir kapak ve kültürlenmiş olan bir şişe içinde, serum barındırmayan ortam içinde en az bir hacim içinde yerleştirilir. 14 gün - epitel ve fibroblast hücre popülasyonları 10 sonra organoid ortaya. Kendiliğinden oluşan ve epitel hücre tek tabaka etrafında Mammospheres. Özgül hücre popülasyonları arasında, komşu hücreleri bozmadan şişeden doğrudan hasat edilebilir. Bizim enzimatik olmayan doku kültürü sistemi, güvenilir taze insan DCIS lezyonlarında gelen sitogenetik anormal, invaziv ata hücreleri ortaya koymaktadır.

Yerinde dokusunda steril meme duktal karsinom tedarik ve kültürleme için iş akışı Meme dokusu kısırlık tipik bir hastane patoloji iş akışı içinde küçük değişiklikler (Şekil 1) üzerinden hücre kültürü laboratuvara ameliyathane muhafaza ediliyor. Doku doku sterilite korurken radyolojik değerlendirmesi izin veren bir plastik film kapağı ile steril bir kaba taşınır. Bir göğüs lumpektomi veya mastektomi numunenin brüt mendil steril eldiven, bıçakları, ve doku işaretleme boyaları ile gerçekleştirilir. In situ meme duktal karsinom brüt morfolojik görünümü kırmızımsı sarı / lastik bir doku ile çevrili cesur / sağlam doku, soluk, hafif kalkık alanları benzer. Duktal hiperplazi ve DCIS&#39;lı Alanları Kalsifikasyonlara bağlı &quot;gritty&quot; ve firma hissedebilirsiniz. Meme dokusunun Bu alanlar genellikle kahverengi veya çevredeki meme dokusu daha biraz farklı renk görünür. Bununla birlikte, ADH CıBir tek doku toplama ve lekeli doku kesitlerinde patolojik inceleme sonrasında ayırt edilebilir. Meme dokusu, insan rekombinant EGF (10 ng / ml), insülin (10 ug / ml), streptomisin sülfat (100 ug / mL) ve gentamisin sülfat ile takviye edilmiş serumsuz besleyici ortam içinde, doku ve / veya duktal organoids daldırılmasıyla kalabildiğini (20 ug / ml), 5. Çıkarılabilir / yeniden kapatılabilen kapaklı hücre kültürü şişeleri hücre / organoids (Şekil 1E-F) periyodik hasat izin verir. Bu model başarılı (n = 18) yerinde 20&#39;den fazla atipik duktal hiperplazi tanısı konmuş hastalarda (n = 2) ve duktal karsinom insan meme pre-invaziv lezyonlar yayılır. In vitro ve in vivo olarak spontan mammosphere oluşumu Mammospheres ve 3-D yapıları atipik duktal hiper tanısı farklı hastadan birden fazla bağımsız insan DCIS kanal doku parçalarının kendiliğinden ortaya çıktıin situ plasia veya duktal karsinom (Şekil 3 ve 4) 5,9. Göğüs dokusunun enzimatik kesilmesi öncesinde, bir karma hücre tipi kültüründe neden doku kültürü, yapılmadı. Ne serumu, bazal membran ekstresi, veya jel benzeri bir matris kendiliğinden mammosphere formasyonu (Şekil 4) için gerekli idi. Mammospheres invazif kanser aynı büyüme paterni ile, NOD / SCID fare modelinde (Şekil 5) 5 meme ksenograft tümörler üretmiştir. Bu sonuçlar insan meme içinde ön-mevcut potansiyel invaziv ile öncül hücreler kanalı DCIS ama görünüşe duktal niş tarafından kontrol altında tutulan ve organoid kültürde ortaya sürülmesi olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, invazif fenotipte 5,9,10 aleni tezahürü önce mevcut meme kök-benzeri hücreler yeni bir kategorisini oluşturmaktadır. Epitel türetilmiş mammospheres ve xenograf teyidits Mammospheres türetilen mammospheres ve ksenograftlar epitelyal kökenli sahip olarak, bağışıklık ile doğrulanmıştır. Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM) epitel hücreleri 11 ile ifade edilen bir zar glikoproteinidir. İnsan EpCAM (yeşil) ve bir nükleer boya (DAPI, mavi) karşı reaktif olan bir fare monoklonal antikor ile immünofloresan kültür mammospheres içinde (Şekil 6A), ve NOD / SCID ksenograft (Şekil 6B) ve merkez EpCAM pozitif hücrelerini göstermiştir. Sağlam bazal membran sınırlarının doğrulanması Bakım histopatolojik tanı standart altında bağımsız patolojik inceleme ile doğrulandığı gibi mammosphere, bu kültür sistemi neoplastik epitel hücreleri, frank işgali veya mikroinvazif yoksun olan pre-invaziv meme lezyonlarının elde edilmiştir şekillendirme. Aynı hastadan gelen çok sayıda Organoid yapılar için mammosphere oluşturulantümörijenik olduğu kanıtlanmıştır Ming kolonileri. Buna ek olarak, organoid kültürü için kullanılan dokunun histopatolojik inceleme sağlam bazal membran sınırları (Şekil 7B) 5 ile birleşen intraduktal lezyon saptandı. Bu nedenle, bu kültür sisteminde oluşturulan kendiliğinden mammospheres Preinvazif neoplastik alanlarda sadece türetilmiştir ve mikroinvazif 5 nadir alanlarında ürünü değildir olduğu sonucuna varılabilir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig1highres.jpg" width="500" /> Radyolojik görüntüleme ve brüt doku diseksiyonu sırasında doku steriliteyi korumaya 1. iş akışı Şekil. Ameliyathanede (A), meme dokusu (gösterilmemiştir lumpektomi numune) steril bir tepsiye yerleştirilir ve steril bir plastik sarım ile örtülür. Doku plastik tepsi doğrudan görüntülü olabilir. (B) Doku tanımlamak için gişe hasılatı elde eden<html> DCIS&#39;lı alanları. Tek kullanımlık sadece doku yönelim boyalar steril pamuk uçlu silgiçlerle doku yüzeyine boyanır. Ev damıtılmış beyaz sirke doku üzerine boşaltılır ve steril pamuklu bir tülden ile kurutulur. (Cı-Ge), meme dokusu antibiyotikler ile takviye edilmiş besin açısından zengin bir ortam içinde doku kültürü laboratuara nakledilir. Doku diseksiyonu, tümörün büyüklüğü alanları izole etmek steril eldiven ve bıçakları / neşter / makas kullanılarak yapılır. DCIS, doku kültürü için çok sayıda organoids halinde kesilir. (E ve F) meme organoids in vitro kültürü. İnsan DCIS, doku doku önceden enzimatik sindirimi olmadan çıkarılabilir kapaklı doku kültürü şişelerinde doğrudan yerleştirilir. Organoid etrafında bir hava-su ara-yüzünün muhafaza ederken, epidermal büyüme faktörü ve insülin ile takviye edilmiş serumsuz bir kültür ortamı içinde bir az miktarda hücre büyümesini desteklemektedir.6fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig2highres.jpg" width="500" /> Meme DCIS doku için brüt doku işleme Şekil 2. İllüstrasyon. Lumpektomi veya mastektomi doku örneğinin içinden tüm yol kesmeden dikey doku dilimleme ince kesitler halinde kesilir. Kesilmiş doku bir somun ekmek benzer beri bu Diseksiyon yöntemi genellikle &quot;ekmeği tekniği&quot; olarak adlandırılır. DCIS içeren şüphelenilen alan (lar) kesip ve 2 içine dilimlenmiş - tanı patoloji ve organoid kültürü için 3 mm dilim. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. bir karma hücre türü kültürüvivo hücre popülasyonlarında temsilcisine tutar. Meme oluşturulan karma hücre kültürü (A) Faz kontrastlı görüntü ekimi başarıyla DCIS, ankraj bağımsız büyüme ile epitel hücrelerinden oluşan yukarı büyüyen ve genişleyen mammospheres olarak tanımlanan yayılır In vitro organoid 11 hafta (4X büyütme). (B &amp; C) üzerinde lezyonlar DCIS ve EGF, insülin, streptomisin ve gentamisin (10X büyütme) ile desteklenmiş serum serbest ortamda, kanal gibi 3-D oluşumlar lobüle. (D) Örnek kültür (40X büyütme) 11 hafta sonra oluşan mammosphere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51926/51926fig3highres.jpg" target="_blank">için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig4highres.jpg" width="500" /> Spontan Şekil 4.Serum serbest organoid kültüründe mammospheres oluşumu. kültürün 33 gün (10X büyütme, 20X içerlek) Aşağıdaki örnek mammosphere oluşumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51926/51926fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. NOD / SCID fare ksenogreft modeli. Ksenogrefleri DCIS&#39;lı (sağ fare meme yağ pedi) ile veya invaziv DCIS&#39;lı (fare sol meme yağ yastığı) tanısı alan hastanın tanısı bir hastadan elde edilen epitel hücreleri enjekte edilerek üretildi. Saf DCIS&#39;lı ve invaziv DCIS&#39;lı hem türetilmiş Ksenogrefleri benzer bir büyüme paterni ve hızı saptandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51926/51926fig5highres.jpg" target="_blank">t büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>Onun rakam. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig6.jpg" /> Şekil 6. Mammospheres epitelyal menşeli olduğu teyid edilmiştir. DCIS içeren meme kanalı oluşturulur mammospheres ve fare ksenograftlarının epitel kaynağını teyit etmek için, FITC konjüge edilmiş bir anti-EpCAM ile bağışıklık (A). EpCAM-FITC pozitif hücreler (sözde yeşil renkli, 488 nm) sadece meme organoids çıkan karma hücre kültürlerinin mammospheres (DAPI (sözde renkli mavisi, 408 nm) bir nükleer boya) olarak görüldü. (B) &#39;formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş fare ksenograft doku bölümlerinde, EpCAM pozitif hücreleri sadece Ksenograft tümör kesitinin ortasına tespit edilmiştir. (20X büyütme) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51926/51926fig6highres.jpg" target="_blank">Bu Figu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>yeniden. <img alt="Şekil 7," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51926/51926fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Kollajen IV immünohistokimyası kanalları çevredeki sağlam bodrum membranlar ortaya koymaktadır. Normal meme kanalları (A) kollajen IV (diaminobenzidinin = kahverengi lekelenme) zenginleştirilmiş sağlam bazal membran ile çevrilidir. Organoid kültür takiben, meme dokusu da mammospheres DCIS&#39;lı alanları türetilen ve teyit sağlam bodrum zarlarını içeren değil invaziv kanser (kollajen IV immünhistokimya, panel A 4X büyütme, panel B 10X). Dan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51926/51926fig7highres.jpg" target="_blank">daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Görüntüleme.  George Mason University.  Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids> 6 ay için geçerli kalır. 

Video: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Tıp

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Kanser Araştırmaları

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. The role of mammary stem cells (MaSCs) is widely studied both in the physiological/developmental context and with regards to breast carcinogenesis. In this aspect, ex vivo studies focused on MaSC properties are highly sought after. Mammosphere cultures represent a surrogate of organ formation and have become a valuable tool for both basic and translational research. Here, we present a detailed protocol for the generation of murine primary mammosphere cultures and the quantitation of MaSC growth properties. The protocol includes mammary gland collection and digestion, isolation of primary mammary epithelial cells (MECs), establishment of primary mammosphere cultures, serial passaging, quantitation of mammosphere growth parameters and interpretation of the results. As an example, we present the effect of low-level constitutive Myc expression on normal MECs leading to increased self-renewal and proliferation.

Here, we describe the implementation and interpretation of the results of an in vitro mammosphere self-renewal quantitative assay.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Biyoloji

Meme Epitel Hücrelerini İnsan Dokusundan İzole Etme Protokolü

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

Yazar Spotlight: Granülomatöz Mastit Tedavisi için Doğu ve Batı Tıbbının Entegrasyonu

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...