Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (US Army Medical Research Toplama Aktivitesi) # LAL için W81XVVH-10-1-0781 ve VE ödül ve (2) Susan G. Komen Vakfı hibe IR122224446 Lal ve VE etmek. Patoloji destek ve doku grossing nazik Inova Fairfax Patoloji Anabilim Dr. Hasan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, Dr. Charles Bechert&#39;in tarafından sağlandı. Hasta rızası ve örnek ihale ustalıkla Inova Fairfax Hastanesi&#39;nde klinik araştırma koordinatörleri Holly Gallimore Heather Huryk ve Emil Kamar tarafından yönlendiriliyordu.

İnsan meme dokusu Savunma Bölümü, George Mason University, ve Inova Sağlık Sistemi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından kabul protokollerini takip, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, bir araştırma çalışmasına dahil hastalardan toplanmıştır. 1. Büyüme Faktörleri ve Antibiyotikler Besin Zengin Orta hazırlayın <ol><li> Insülin stok çözeltileri, epidermal büyüme faktörü (EGF), streptomisin sülfat ve gentamisinsülfat hazırlayın. <ol><li> 10 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar steril filtre edildi su içinde insülin sulandırın. Steril 10 ml tek kullanımlık şırınga Tip 1 reaktif dereceli su aspire 10 ml. Şırıngaya 0.22 mikron polietersülfon filtre takın. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine steril filtrelenmiş su koyun. </li><li> Insülin 100 mg&#39;lık bir şişeye, steril filtre edilmiş su, 10 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde insülin flakon tutun. Insülin stok Solu 450 ul dağıtmak-20 ° C&#39;de etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri ve deposuna yon. İnsülin stok solüsyonu şişenin üzerindeki son kullanma tarihine kadar stabildir. </li><li> Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bir stok çözelti hazırlayın: 500 ug, EGF (stok 1 mg / ml) 500 ul steril su ekle. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde EGF şişesini tutun. <ol><li> EGF çalışan bir stok solüsyonu hazırlayın: 900 ul besin ortamında (çalışma stok / ul 0.1 ug olacaktır) için stok EGF çözüm 100 ul ekleyin. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. -80 ° C de, EGF çalışma stoğu etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi ve mağaza 50 ul koyun. Not: EGF stok çözeltisi (1 ug / ul) -80 ° C&#39;de 1 yıl stabildir; stok çözeltisi (0.1 ug / ul) çalışma -80 ° C &#39;de, 2 ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Bir analitik terazi üzerinde streptomisin sülfat, 40 mg tartılır. Streptomisin sülfat int yerleştirinoa steril 15 ml konik tüp. Besleyici ortam 4 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti, hafif pembe olmalıdır. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Streptomisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li><li> Bir analitik terazi üzerinde gentamisin-sülfat ve 20 mg tartılır. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine gentamisin sülfat yerleştirin. Besleyici ortam 2 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti sarı olmalı. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Gentamisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li></ol></li><li> (20 (. 100 ug / ml nihai konsantrasyon), (. 10 ug / ml nihai kons), (. 10 ng / ml nihai kons) streptomisin sülfat insülin, insan rekombinant EGF ile takviye edilmiş bir besleyici ortam içinde iki adet 200 ml&#39;lik toplu hazırlayın ve gentamisinsülfat ug / ml final kons.). <ol><li> 0.2 um polietersülfon filtre şişesi ile donatılmış bir vakum filtre şişesi ve 250 ml&#39;lik bir alıcı şişeye 200 mi besin ortamı ilave edin. Ekleme 20 ve181. l çalışma stoğu, EGF, 200 ul stok insülin, 2 ml stok streptomisin sülfat ve besleyici ortam içinde 200 ml 400 ul stok gentamisin sülfat. Bir vakum filtre balon takın. Orta Filtre. Filtreyi atın ve &quot;zengin besin ortamı&quot; olarak şişesi etiket. 14 güne kadar, 4 ° C&#39;de depolayın. </li></ol></li></ol> 2. Doku Toplama ve Çok Satılan Uygulamalar <ol><li> Ameliyathanede, meme dokusu sağlandıktan sonra steril tekniği korumak. Steril bir tepsiye meme dokusunu yerleştirin ve steril plastik wrap ile tepsiyi örtün. <ol><li> Kurumunuz tarafından gerekli şekilde Radyoloji / Patoloji için kapalı tepsiye doku taşıyın. Tepsiyi açmayın. Ulaşım süreleri kurumlar içinde değişebilir. Doku kadar 45 dakika sonrası eksizyonu RT&#39;de bu kapalı tepsiye canlı kalabilir. Ancak, besin açısından zengin ortama doku istemi işleme sonraki organoid kültürü için en uygun koşulları sağlar. </li></ol></li><li> Brüt doku diseksiyonu meme dokusu içinde DCIS&#39;lı alanları tanımlamak için: doku kısırlık korumak için doku diseksiyonu sırasında steril eldiven, bıçak, neşter, doku işaretleme boyaları, ve sirke kullanın. <ol><li> % 70 etanol veya% 1 çamaşır suyu ile çalışma alanını temizleyin. Steril eldiven açın ve çalışma yüzeyine eldiven sarıcı yerleştirin. Eldiven sarıcı yüzü yukarı steril içini yerleştirin. Steril eldiven giyin. <ol><li> % 70 etanol ile örnek kabın yüzeyini temizleyin. Doku örneği kaptan plastik kaplamayı çıkarın ve eldiven sargı üzerinde numune yerleştirin. </li></ol></li><li> Doku işaretleme boyası içine iki pamuk uçlu bezlerden batırın. Doku yüzeyi boyunca bezlerden yuvarlayarak doku yüzeyine boya uygulanır. NOT: Her patoloji bölüm standart bir boya renk / doku yönlendirme protokolü vardır. Doku hastada konumu ile ilgili olarak doku yönlendirmek için boya ile etiketlenir. Boya lekelendi ya dadoku üzerine boyanmış. Doku üzerinde boya dökmeyin. Boya Dökme boya böylece cerrahi sınırların yönünü kafa karıştırıcı doku boşluklarına / çalıştırmak damla neden olabilir. Doku yönelim cerrah ve bir anatomik yerler ile patolog) doku örneği tanımlamak, ve b) tümör ile ilgili olarak cerrahi sınırların yerini belirlemek sağlar. </li><li> Steril gazlı bez üzerine damıtılmış beyaz sirke (% 5 asetik asit) dökün. Sirke batırılmış gazlı bez ile boyanmış doku kurulayın. Gazlı bez atın. Sirke boyalar işaretleme dokuyu düzeltmek için kullanılır. </li><li> Yaklaşık 5 mm kalınlığında dikey dilimler halinde meme dokusunu kesti. Doku (Şekil 2) aracılığıyla tüm yol kesmeyin. / Gözlemlemek kalsifikasyon alanları için doku palpe. Kendi karakteristik firması tarafından DCIS belirlemek, kırmızımsı çevrili görünüm soluk, (nedeniyle kalsiyum spikülleri için) cesur hissediyorum lastik sınırları. NOT: Bazı durumlarda, komedondur (sivilce gibi) alanlar olabilirBüyük çaplı DCIS lezyonlarında nekrotik malzemeyi temsil eden beyaz noktalar olarak görülmektedir. </li><li> Meme dokusunu çevreleyen küçük bir miktar da dahil olmak üzere, DCIS / kalsifiye meme dokusunu kesip. Aşama 1 &#39;de hazırlanan besleyici zengin ortam 20-30 ml ihtiva eden steril bir 50 ml tüp içine meme dokusu yerleştirin. <ol><li> Yavaşça tüpü birkaç kez ters yüz edilerek doku ve orta karıştırın. Orta atın ve taze orta ekleyin. Izole edilmiş bir kap içine doku ve ortam ihtiva eden tüp yerleştirilir ve doku kültürü laboratuara doku taşımak. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Doku Kültürü <ol><li> Biyolojik güvenlik kabininde çalışan doku ve steril bir Petri kabı içine besleyici ortam küçük bir miktar dökün. Steril bir neşter kesip ve fibröz doku atın kullanma. Adet (organoids) içine meme dokusunu yaklaşık 3 mm 2 (Şekil 1C-D) kesti. Doku kesmek için çalışın, böylece her organOSB çevreleyen stroma sahip en azından bir ayırd edilebilir kanal segmenti ihtiva eder. </li><li> Doku kültür şişesi kapağını açın. Steril cımbız veya forseps kullanılarak, şişeye organoids yerleştirin. Kapağı kapatın. Petri atın. </li><li> Doku kültür şişesine 11 mi serumsuz besin yönünden zengin ortam (aşama 1 &#39;de hazırlandı) ekleyin. Şişeyi kapatın ve organoids ve orta eşit kap yüzeyinden (Şekil 1E-F) arasında dağıtılır böylece balon girdap. </li><li> 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. Bu süre boyunca bir balon içinde hareket ettirmeyin. </li><li> Gün 2 sonrası inkübasyon, potansiyel bakteri / mantar kontaminasyonu kontrol etmek için inkübatör şişeyi çıkarın. Şişenin ani, keskin hareketler, ya da türbülans kaçının. Ters bir mikroskop sahnede şişesi yerleştirin. <ol><li> Bakteri, maya ve / veya mantar için orta dikkate alınmalıdır. Herhangi bir kirlenme tespit edilirse, bir eklenti için inkübatör şişeyi geriitional gün. Kirlenme tespit edilirse, uygun bir kap içinde bir balon içinde ve içindekileri atmak. </li></ol></li><li> 3. günde enkübasyonunda, taze ortam ile koşullandırılmış bir ortam değiştirin. <ol><li> 20-30 dakika süre ile 37 ° C &#39;de, bir steril tüp içine ortamı 11 ml yerleştirin. Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. Organoids bozmadan çıkarın ve steril bir serolojik pipet kullanarak şişeye içinde orta atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. </li><li> Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol> Kurulmuş organoid / Epitel Hücre Kolonileri 4. Bakım <ol><li> Her 2 haftada bir taze ortamı hazırlayın ve doku kültürü şişesinde haftada 3 kez ortamı değiştirin. <ol><li> 37 ° C&#39;de steril bir kap içinde ortam 11 ml yerleştirin20-30 dakika süreyle ° C. Inkübatör şişeyi çıkarın. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kaldırmak ve organoids rahatsız etmemek için dikkatli olmak şişesi klimalı ortam atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li><li> 10 sonra, - 14 günlük kültür, yapışkan olmayan bir kültür şişesi içinde doku parçaları alın. <ol><li> Ksenograft transplantasyon için periyodik olarak hasat hücreleri ve / veya yeni kültür şişelerine yayılması için şişeden organoids, ya da fenotipik ve / veya moleküler analiz için. </li><li> Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. % 70 etanol ile balonun püskürtün. % 70 etanol ile püskürtülür olmuştur temiz bir kağıt havlu ile balona aşırı etanol silin. </li><li> Organoid yayılımı: &lt;ol&gt; <li> Şişenin kapağını açın ve biyolojik güvenlik kabini kapak yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Mikroskopik görüntüleme altında, organoid (ler) hasat edilmesi bulun. Pick-up için bir organoid steril cımbız veya forseps kullanın. </li><li> Yeni bir kültür şişesi içinde organoid yaymak için, yeni bir şişede organoid yerleştirin. 11 ml taze, sıcak orta ekleyin. 3.6.3 - adımda 3.3 de tarif edildiği gibi, bir nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Doku kültüründe, hücre kültür ortamı haftada üç kez şişe yerleştirin. </li></ol></li><li> Hücrelerin hasat: <ol><li> Direkt mikroskobik vixualization altında, hafifçe kazıyın ve aspire hücreler ve mammospheres steril tek kullanımlık pipet uçları ile 1000 ul pipet kullanarak. Hücreleri ve çevresindeki ortam aspire. Steril mikrosantrifüj tüpü içine hücre / orta koyun. </li></ol></li><li> 5 saniye boyunca 12.100 xg&#39;de mini-santrifüj kısaca hücreleri Spin. Çıkarın ve orta atın. &lt;ol&gt; <li> DNA analizi için hemen -80 ° C &#39;de, uzun süreli saklama, ortam (10 ul), küçük bir hacim içinde, kuru buz üzerinde hücre pelletini dondurma. </li><li> Proteomik analizi, kütle spektrometrisi veya batı benekleme / ters fazlı protein mikrodizilerinin 2x SDS Tris-glisin tamponu 8 M üre, 10 ml içinde hücreler lize edildi. Alternatif olarak, immünohistokimyasal analizi için hücre smear yapmak için bir Sitosantrifüj hücreleri dönerler. </li></ol></li><li> Bir şişeye hücreleri hasat ettikten sonra, kaldırmak ve kalan orta atın. Sıcak, taze besin zengin ortamdan 11 ml ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif kültür sistemi temel ve translasyonel araştırma çalışmaları için yaşayan pre-invaziv neoplastik meme hücreleri üretmek için yeni bir model oluşturmaktadır. Geçmişte, pre-malignan göğüs kanserindeki ilerlemeler, tipik olarak üç farklı yöntem kullanılarak incelenmiştir. İlk yöntem histopatolojik ve microdissected dondurulmuş veya sabit insan örneklerinin 12-14 genetik analizi. İkinci yöntem, insan pre-invaziv meme lezyonlarının 15 benzer olduğu düşün...

Meme kanalları ve alveollere (in situ duktal karsinom) sınırları içinde epitel hücrelerinin çoğalması invaziv duktal ve lobüler meme kanserine bağlı zorunlu bir habercisi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyon dinamiği tam olarak anlaşılamamıştır. Önceden istilacı meme karsinomu hücreleri veya herhangi bir ön-invaziv tümör tarafından kullanılan hayatta kalma mekanizmalarını, açıklık getirecek öldürme, ya da, ön-invazif neoplazmaların 1 önlenmesi için tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir. Ancak, işlevsel okuyan insan pre-invaziv lezyonlar için düşük maliyetli basit yöntemler eksik edilmiştir. Dönüştürülmüş hücre çizgileri in vitro tek tabakalı kültürü oluşturulmuş bir laboratuar yöntemi olup, bu ölümsüz kılınmış hücre kuşaklarının fenotip ve genotip olsa da, birincil insan tümör hücreleri 2 moleküler durumunu özetlemek için başarısız olur. Bunun da ötesinde, Tümörjenik MCF-10A hücre hattı, burada recapitulates 3-D meme bezi mimarisi, yeterince fonksiyonel fenotip ve bireysel bir hastanın pre-invaziv meme lezyonu 3,4 moleküler özelliklerini yansıtmamaktadır. Işgalinin yeteneğine kök benzeri neoplastik hücrelerin in situ (DCIS) hücre popülasyonunda duktal karsinom içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, (Şekil 1) 5 toplanması ve cerrahi sırasında steril insan meme dokusu kültürü için bir yöntem geliştirdi. Bizim ex vivo meme organoid kültür sistemi izole ve taze insan meme duktal karsinoma dokusunun 6-8 mammosphere oluşturan hücrelerin çoğaltılmasına yönelik, enzimatik doku bozulması, bazal membran ekstresi matris veya fibroblast tükenmesine dayanmaz. Yeni sistem, hücre akış / göç 5 esasına dayanır. Fark meme kanalı, ve çevresindeki stromal serumsuz Besleyici ortam (sadece e ait minimum bir hacmi içinde batıkKültür ortamının etkisine maruz kalan kanal kesme yüzeyi ile, gaz alış-verişini en üst düzeye çıkarmak, ama şişenin (Şekil 1E-F) belli bir yön olarak) kanal parçalarını kapsayacak şekilde nough. Bu kültür sistemi hücreleri otolog stroma ve kültür şişesi üzerine kanalın dışına ve / &#39;a taşımasına olanak tanır. Sadece Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), insülin ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir besin ortamı, organoid çıkan karma hücre popülasyonlarının büyümesini desteklemektedir. Doku kültürü şişesi Steril nemlendirilmiş bir ortamı muhafaza ederken, organoids ve / veya hücreler tüm şişe veya komşu organoids bozmadan hasat edilmesine olanak tanıyan çıkartılabilir, tekrar kapatılabilen bir kapak yer alır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

In situ (DCIS) Meme duktal karsinom, tanımı gereği, kollajenöz bazal membran ihlal etmeden, meme kanalının sınırları içinde neoplastik epitel hücrelerinin proliferasyonudur. DCIS invaziv meme kanserleri olmayan bir zorunlu habercisi iken, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyonları tam olarak bilinmemektedir. Işgalinin yeteneğine progenitör hücrelerin DCIS hücre popülasyonu içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, doku enzimatik bozulma olmadan, ameliyat sırasında steril insan meme dokusu toplanması ve kültürü için bir yöntem geliştirdi. Duktal segmentleri içeren steril meme dokusu rutin patolojik incelemede aşağıdaki cerrahi olarak çıkarıldı meme dokusu hasat edilir. DCIS ihtiva eden doku, doku kültürü laboratuara besin yönünden zengin, antibiyotik içeren, serumsuz ortama yerleştirilebilir, ve nakledilir. Meme dokusu daha dissecte olduğunud kalsifiye alanları izole etmek. Birden fazla meme dokusu parçaları (organoids) nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde çıkarılabilir bir kapak ve kültürlenmiş olan bir şişe içinde, serum barındırmayan ortam içinde en az bir hacim içinde yerleştirilir. 14 gün - epitel ve fibroblast hücre popülasyonları 10 sonra organoid ortaya. Kendiliğinden oluşan ve epitel hücre tek tabaka etrafında Mammospheres. Özgül hücre popülasyonları arasında, komşu hücreleri bozmadan şişeden doğrudan hasat edilebilir. Bizim enzimatik olmayan doku kültürü sistemi, güvenilir taze insan DCIS lezyonlarında gelen sitogenetik anormal, invaziv ata hücreleri ortaya koymaktadır.

Yerinde dokusunda steril meme duktal karsinom tedarik ve kültürleme için iş akışı Meme dokusu kısırlık tipik bir hastane patoloji iş akışı içinde küçük değişiklikler (Şekil 1) üzerinden hücre kültürü laboratuvara ameliyathane muhafaza ediliyor. Doku doku sterilite korurken radyolojik değerlendirmesi izin veren bir plastik film kapağı ile steril bir kaba taşınır. Bir göğüs lumpektomi veya mastektomi numunenin brüt mendil steril eldive...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Görüntüleme.  George Mason University.  Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids> 6 ay için geçerli kalır. 

Video: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Biyoloji

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...