Este projecto foi financiado através de NIH / NCI número de concessão R00 CA127357 e da Universidade de Kansas Cancer Center Endowment.

1. Isolamento e extração de colágeno de doadores de camundongos C57BL/6J <ol><li> Sacrifício madura fêmeas normais C57BL/6J usando métodos aprovados IACUC. </li><li> Colher as caudas e mergulhar em etanol 70% por 45 minutos para esterilizar tecidos. Seque o rabo com papel de seda, embrulhe em papel alumínio. Armazenar os rabos em -20 ° C até ser necessário. </li><li> Coloque o rabo em um ambiente estéril, como uma capela de fluxo laminar. Com uma tesoura, divida a pele na raiz da cauda e se desfazer da cauda. Remover 0,5 a 1 cm de ambas as extremidades da cauda e dividir o restante da cauda em três ou quatro peças. Dissecar os tendões da cauda e separar os tendões em fibras individuais utilizando uma lâmina de bisturi ou navalha. </li><li> Colocar as fibras do tendão a um recipiente estéril e lavar com água destilada estéril. Transferência de tendões da cauda de camundongos 5-7 a um tubo de 50 ml contendo 35 ml estéril água desionizada contendo 50 unidades / ml de penicilina penicilina, estreptomicina 50 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina e 0,034 N em ácido acético diluído a partir de uma solução estoque de ácido acético glacial (17 N). Lugar no rocker a 4 ° C por uma semana para extrair o colágeno. </li><li> Spin down detritos em uma centrífuga de mesa em 3000 g por 15 minutos. Transfira o sobrenadante, cerca de 30 mls de dois tubos de policarbonato adaptado para o rotor Beckman Ti 50,2 e girar a 35.000 g (cerca de 17.000 rpm) por 1 hora. </li><li> O volume do sobrenadante terá de ser reduzido a obter uma concentração de 1-2 mg / ml. Transfira o sobrenadante para um 50 k ultracel unidade de filtragem Amicon e girar em uma centrífuga de bancada a 3000 rpm por 15 a 4 ° C. Transferir o filtrado para um tubo cônico estéril e salvar. Repetir a centrifugação até que o volume é reduzido para 5-6 ml. </li><li> Leia a concentração de proteína. Usamos um padrão Bradford ensaio (BioRad), usando BSA padrões (BioRad) e amostras não diluídas. Medir uma amostra do seu filtrado, como controle negativo. </li><li> Ainda verificar a pureza de extração por resolver uma amostra de colágeno purificado em gel de poliacrilamida 6% SDS, 10 pistas, 1,5 espessura gel mm. Prepare 20 mg de amostra em 30 mL de tampão de carregamento 1x SDS-PAGE contendo 63 mM Tris HCl 10% glicerol, 2% SDS azul de bromofenol 0,0025% em tubos de 1,5 ml eppendorf. Prepare uma quantidade equivalente de proteína de colágeno tipo rabo de rato eu, como um controle positivo. Além disso, preparar um conjunto de padrões de BSA a 2,5, 5, 10, 20 mg diluídos em PBS e tampão de carregamento 1X. Ferva as amostras a 95 ° C por 5 minutos. </li><li> Deixe esfriar e as amostras brevemente microcentrífuga (velocidade máxima por 10 segundos) para girar a condensação. </li><li> Carregar as amostras amostras, juntamente com um marcador de peso molecular. Por exemplo, coloque 5 mL de Kaleidoscope padrão de proteína Biorad. Electroforese em 150 volts por aproximadamente 1 hora ou até que a frente de corante atinge o fundo. </li><li> Remover o gel e mancha no coomassie tampão azul. Prepare este buffer através da mistura de 2 g de coomassie azul, 75 ml de ácido acético glacial, 500 ml de etanol em um volume total de 1000 ml contendo água desionizada. Também preparar a mesma quantidade de tampão destain usando a receita exceto sem coomassie reagente azul. Cobrir o gel com um volume suficiente para coomassie azul e coloque sobre um roqueiro. </li><li> Rocha suavemente durante 1 hora à temperatura ambiente e decantar a mancha. Substituir a solução destain quando se torna azul escuro. Deter o gel durante a noite ou até que as bandas individuais são resolvidas no gel. Localizar duas bandas de colágeno (peso molecular = 90 kda e 130 kda) e observe a força das bandas contra os padrões e controles. A imagem do gel usando um sistema de gel doc, se necessário. </li></ol> 2. Isolamento e cultura de células do doador carcinoma mamário e fibroblastos de camundongos normais e PyVmT C57BL/6J <ol><li> Idade sacrifício combinado feminino normal ou PyVmT camundongos transgênicos após 10 semanas de idade, quando os tumores são evidentes e palpáveis ​​na PyVmT camundongos transgênicos usando métodos aprovados IACUC. </li><li> Expor o mouse sobre as suas costas em uma superfície plana e imobilizar os membros usando fita adesiva. </li><li> Fazer uma incisão T de cabeça para baixo entre os mamilos da glândula mamária torácica e inguinal e puxe a retalho de pele para trás para expor as glândulas mamárias. Remover os tecidos mamários e mince em pedaços pequenos com uma tesoura cirúrgica. </li><li> Prepare 100 ml de um cocktail digestão enzimática contendo: 200 mg de tripsina, 500 mg de colagenase, 4 mg de DNAse, 100.000 unidades de hialuronidase em PBS estéril e antibióticos durante a noite no gelo e, em seguida, por 3 horas a 37 ° C. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) para cada amostra ea célula centrífuga sedimento em uma centrífuga de bancada a 1500 rpm por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 5-7 ml de PBS/10% FBS. Repita o giro e lavar mais duas vezes. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS contendo 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina em 10 pratos centímetros revestidos com colágeno tipo I. Para placas de revestimento com colágeno, diluir o colágeno 1 ml (usando o estoque 1,5 mg / ml) em 39 ml de 0,02 N de ácido acético diluído em água destilada estéril ou PBS. Pipetar 5 ml de solução de trabalho de colágeno em 10 placas cm. Incubar a temperatura ambiente por um mínimo de 10 minutos. Aspirar colágeno em excesso. Placas Parafilm não utilizados e armazenar a 4 ° C por uma semana. </li><li> Troque a mídia 2-3 vezes por semana. Digestão dos tecidos de sucesso será caracterizada pela presença de focos epiteliais rodeado por células fibroblásticas fusiformes. </li><li> Separar os fibroblastos e células epiteliais por tryspinization seletivo. Aspirar a mídia e lavar as células com PBS uma vez. Ml 1 pipeta de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA em células e incubar à temperatura ambiente. Fibroblastos são mais fracamente aderentes do que as células epiteliais. Verifique se há desprendimento de fibroblastos ao microscópio após 2 minutos, as células devem estar flutuando em suspensão ou arredondado, enquanto focos epiteliais ainda deve ser aderida à superfície. </li><li> Toque levemente o prato para soltar os fibroblastos e gentilmente pipeta 10 ml de meio contendo soro no prato para remover os fibroblastos. </li><li> Pipeta a mídia contendo fibroblastos em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar como descrito na etapa 5). Refaça essas células em colágeno revestido de 10 pratos cm e repita o processo seletivo até tripsinização fibroblastos e células epiteliais são completamente separados. </li><li> Verificar a pureza celular por imunofluorescência para os marcadores epiteliais como CK14 e CK18 e marcadores de fibroblastos como alfa actina de músculo liso (α-SMA). </li></ol> 3. Imunofluorescência de células cultivadas <ol><li> Lugar lamínulas de vidro em 6 pratos cm. Esterilizar em exposição aos raios UV de 5 a 10 minutos em uma capela de fluxo laminar. </li><li> Brasão da lamela com ml 1-2 de solução de trabalho de colágeno estoque para 10 minutos em temperatura ambiente (RT). Aspirar o excesso. </li><li> Trypsinize e placa de 200 mil células epiteliais ou fibroblastos por amostra. Adicionar 3-5 ml de mídia completo e incubar por 24 horas. </li><li> Aspirar a mídia, lavar as células com PBS e fixar em metanol gelado a -20 ° C por 7 minutos. </li><li> Lavar as células com PBS duas vezes para remover o etanol, e bloquear com 1-2 ml de PBS contendo 1% de SFB por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Utilizando uma pinça, remover as lamelas e coloque em um recipiente grande e rasa coberta com parafilme ou superfície hidrofóbica outros. </li><li> Diluir os anticorpos primários 1:100 em solução de bloqueio: anti-actina de músculo liso (α-SMA, anti-CK14 (marcador basal epitelial), anti-CK18 (marcador epitelial luminal). </li><li> Pipete 100 de anticorpos diretamente sobre as lamelas por 1 hora em temperatura ambiente. Incubar uma lamela separados das células em solução de bloqueio; esta amostra servirá de controle anticorpo secundário. </li><li> Aspirar anticorpos e pipeta de 1 ml de PBS diretamente sobre a lamínula de lavar. Aspirar e repetir 3-5 vezes. </li><li> Diluir os anticorpos secundários em solução de bloqueio: anti-mouse-alexa 488 a 1:100, mouse anti-biotinilado a 1: 500, anti-mouse-alexa-568. </li><li> Envolva o recipiente com as lamelas em papel alumínio. Pipetar 100 ul do anticorpo secundário apropriado diretamente sobre as lamelas: α-SMA com anti-mouse-alexa 568, CK 14 com coloração anti-rato biotinilado e CK18 com anti-mouse-alexa 488. Cubra o recipiente para proteger as amostras da luz visível. </li><li> Aspirar anticorpo e lavar com PBS como no passo 9). Deixar as amostras em PBS, com exceção de CK14 coloração. </li><li> Diluir estreptavidina conjugada com alexa 568 1:500 em PBS. Incubar as amostras coradas com CK14 strepatividin-alexa 568 por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Lavar em PBS como no passo 9) </li><li> Diluir DAPI 1: 500 em PBS. Aspirar o PBS das amostras e incubar com DAPI por 10 minutos RT no escuro. </li><li> Enxágüe amostras com PBS. Pipete 100 de Prolong anti-fade reagente em lâminas de vidro, vire a lamínula de forma que as células estão enfrentando a lâmina de vidro. Incline a lamela a um ângulo para delicadamente fazer contato com a mídia de montagem. </li><li> Imagem as amostras usando um microscópio de imunofluorescência. Manter as amostras no escuro para proteger o sinal de imunofluorescência, que vai durar aproximadamente duas semanas. </li></ol> 4. Preparação das células de colágeno incorporados ao processo de enxertia <ol><li> Para incorporar as células de colágeno, é necessário diminuir o pH do colágeno para obter através da mistura de polimerização do colágeno com uma solução de configuração. Preparar a solução de configuração através da mistura de 100 ml de Solução de Earl 10X de salina balanceada (EBSS) com 2,45 g de NaHCO3, 7,5 ml de NaOH 1 M e 42,5 ml de água destilada estéril. Além disso esterilizar usando uma garrafa de topo unidade micron 0,22 filtro ligado a uma garrafa estéril. </li> &lt;li&gt; Misture o colágeno (concentração de ações 1 mg / ml) com ajuste de solução em um 4 de partida: uma relação. Para um enxerto, misture 100 ml de colágeno com 25 mL de solução de configuração em um tubo eppendorf. Brevemente vórtice ou pipeta na amostra cima e para baixo para misturar a amostra completamente. </li><li> Adicionar colágeno ou solução definição em incrementos de 50-10 mL e misture bem até que o corante vermelho de fenol nas mudanças mistura para uma luz rosa para cor de laranja, refletindo um pH neutro. A cor amarela indica pH ácido, enquanto rosa escuro reflete pH básico. Mantenha a mistura sobre o gelo para evitar a polimerização. </li><li> Remove os fibroblastos e células epiteliais da placa por tripsinização. Primeiro, aspire a mídia e lavar com 5 ml de PBS. Pipetar 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA em HBSS por placa. Incubar em fibroblastos RT por 2-5 minutos. Incubar as células epiteliais a 37 º C por 2-6 minutos. Toque as placas de leve para retirar as células. Verifique se há desprendimento usando um microscope.Quench da tripsina por pipetagem 9 ml de meio completo no prato e transferência das células para um tubo estéril de 15 ml cônico. </li><li> Remover 50 ul e contagem de células por hemocitômetro. Observe o volume total de células em cada tubo (aproximadamente 10 ml). </li><li> Agregar as células a 1500 rpm por 5 min em temperatura ambiente. Aspirar o pellet celular e ressuspender as células a uma concentração de 100.000 mL cells/100. Por exemplo, ressuspender 500.000 células em um volume total de 500 mL de mídia completo. </li><li> Mix 250 mil células do estroma (250 mL) e 100.000 células tumorais (100 l) em um tubo separado. Microcentrífuga 10 seg rpm 1000, remova o sobrenadante por pipetagem. Adicionar 50 ul da solução de colágeno ajustada para as células. Pipeta cima e para baixo para dispersar as células uniformemente. Pipeta a 50 mL em uma chapa de seis centímetros estéreis de cultura de tecidos para formar uma gota circular. Incubar o enxerto, a 37 ° C por 10 minutos para polimerização. </li><li> Delicadamente adicionar 5 ml de meio completo no prato por prato a inclinação em um ângulo e, lentamente, pipetagem a mídia de um lado da placa. Incline a placa ao redor até que a mídia cobre o enxerto. </li><li> Incubar por 24 horas a 37 ° C. Transplante imediatamente. </li></ol> 5. Ortópticos transplante de células do colágeno incorporados em camundongos C57BL/6J <ol><li> Fabricar um bastão de vidro fino para a cirurgia de transplante. Aqueça uma pipeta Pasteur de vidro usando um bico de Bunsen. Utilizando uma pinça, esticar o fim da pipeta para fora para 2-3 mm de espessura. Deixe esfriar, e esterilizar em etanol 70%. </li><li> Esterilizar os instrumentos cirúrgicos seguir em autoclave e etanol 70%: multa tesoura cirúrgica, sem corte tesouras cirúrgicas, fórceps blunt, pinça fina, clips ferida, ferida de grampo </li><li> Anestesiar mouse usando com 2-3% isoflurano usando uma máquina de limpeza isoflurano. A média de vazão O 2 utilizadas é de 1 L / minuto através do cone do nariz. </li><li> Lay o mouse sobre as suas costas e imobilizar os membros com fita ou adesivo removível outros. Remover os pêlos com removedor químico de cabelo, como Nair. Esterilizar o abdômen com algodão swabbing alternativa entre o etanol 70% e betadine de forma meta-like. </li><li> Realizar-se uma parte da pele pela glândula mamária usando uma pinça sem corte com uma mão. Com a outra mão, usando blunt tesoura cirúrgica para fazer uma cabeça para baixo T-incisão entre as 9 e # 10 mamilos ou # 4 e # 5 mamilos das glândulas mamárias inguinais para expor as glândulas mamárias. </li><li> Faça uma incisão de bolso sob o nó de linfa ou artéria mamária com pequenas tesouras cirúrgicas primavera. </li><li> Remover o enxerto de colágeno da placa de cultura de tecido usando uma pinça. Retire o excesso de líquido do enxerto de colágeno suavemente dabbing em um estéril limpe e deslize o enxerto de colágeno completamente no bolso usando um bastão de vidro fino. </li><li> Sutura do retalho de pele usando suturas # 2 gut absorvíveis ou grampos ferida. </li><li> Vamos recuperar o rato na gaiola. </li><li> Monitorar os ratos duas vezes por semana no mínimo, palpação de tumores. Sacrifício dos camundongos, quando os tumores atingem um centímetro de diâmetro. Tecidos colheita para análise. </li></ol> 6. Resultados representativos: Isolamento e extração de colágeno de camundongos C57BL/6J Estes procedimentos foram adaptados a partir de 1. Extração de proteínas de colágeno da cauda do rato 07/05 rende aproximadamente 1-1,5 mg / ml em um volume de 6 ml final, ou 6-9 mg de proteína. Por coommassie mancha, bandas correspondentes a 90 e 130 kda kda são detectados nas pistas carregado com amostras extraídas da cauda do rato, indicando a presença de colágeno tipo I e pró-colágeno, respectivamente (Figura 1). Isolamento e cultura de células de carcinoma mamário e fibroblastos de camundongos normais e PyVmT C57BL/6J. Os procedimentos foram adaptados de 2. Células de carcinoma PyVmT e fibroblastos podem ser distinguidos por diferenças na morfologia celular e expressão de determinados mar epiteliais e mesenquimaiskers. Células de carcinoma PyVmT são identificados pela forma de paralelepípedos e co-expressam CK18, um marcador epitelial e luminal CK14, um marcador basal epitelial, mas não expressar α-SMA (Figura 2). Fibroblastos são células mamárias maiores, com um fenótipo fusiformes e expressam altos níveis de α-SMA, mas não expressam CK14 ou CK 18 (Figura 2). Estes dados indicam mais de 95% para a pureza de células fibroblastos e células epiteliais usando os procedimentos descritos. Ortópticos transplante de células do colágeno incorporados em camundongos C57BL/6J Estes procedimentos foram adaptados de 3, 4. Camundongos transplante destinatário são sacrificados quando os tumores em cada grupo experimental atingir 1,0 cm de diâmetro, ou cerca de 60 dias. Enquanto o transplante de células PyVmT sozinha resultados em tumores palpáveis, após 30-40 dias, chegando a uma massa de tumor significa 0,335 gramas em 60 dias, a co-transplante de células de carcinoma mamário PyVmT com resultados fibroblastos em um médio de massa tumoral de 0,630 gramas, indicando aumento do crescimento tumoral por fibroblastos (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Coomassie análise mancha de colágeno tipo I extração da cauda de rato. BSA (~ 66 kDa) é indicado por uma seta. Colágeno de cauda de ratos comercial (20 mg de proteína), e cauda de colágeno purificado rato (20 mg de proteína) são indicados por caixa (~ 130 kDa, ~ 90 kda proteínas). Std = standard peso molecular. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Imunofluorescência de células de doadores PyVmT carcinoma mamário e fibroblastos. Painéis a e b representam PyVmT células de carcinoma mamário histoquímica para os anticorpos para CK14 e CK18. Painel c representa fibroblastos corados com anticorpos para α-SMA. As imagens mostradas com DAPI sobreposição com ampliação de 20x. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Desenvolvimento de tumores mamários em ratos C57BL/6J na presença ou ausência de fibroblastos. Tumores mamários foram colhidas de camundongos transplantados com células de carcinoma PyVmT na presença ou ausência de fibroblastos mamárias e pesado. Média + erro padrão da média. N = 6 por grupo.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells.">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li></ol>

Experiências com animais: Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela comissão de IACUC da Universidade de Kansas Medical Center.

A contribuição funcional de fibroblastos na progressão tumoral tem sido demonstrado através de modelos de transplantes, em que os fibroblastos carcinoma associados co-transplantados com resultados benignos mamários células epiteliais no crescimento do tumor aumentou e invasão 5. Abordagens transplante convencional envolveram o uso de camundongos SCID ou nuas para co-transplante de células do estroma e do epitélio de diferentes origens genéticas do rato ou de espécies diferentes. Ratinhos imunocompr...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Camundongos C57BL/6N </td><td> Harlan </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> MMTV-PyVmT camundongos transgênicos </td><td> Jackson laboratórios </td><td> 002374 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Pescador </td><td> SH3039603PR </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> VWR </td><td> 10000113873 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Pescador </td><td> MT-30-001 </td><td></td></tr><tr><td> anfotericina </td><td> pescador </td><td> BP2645-20 </td><td></td></tr><tr><td> Filtração Amicon colunas ultracel 50k </td><td> Millipore </td><td> UFC905008 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos para rotor Beckman TI </td><td> Beckman </td><td> 355618 </td><td></td></tr><tr><td> Colágeno da cauda de rato </td><td> Pescador </td><td> CB 40.236 </td><td></td></tr><tr><td> EBSS 10x </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7510-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina 1X, 0,25% em HBSS cálcio w / o e Magnésio </td><td> Pescador </td><td> MT-25-050-CI </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Coomasie azul </td><td> Pescador </td><td> BP101 25 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T3924-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> Sigma AldrichC0130-50 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hyalronidase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3884 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Padrão de proteínas caleidoscópio </td><td> Biorad </td><td> 1610375 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Pescador </td><td> 12545-78 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro </td><td> VWR </td><td> 101400-042 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentina anticorpo S-20 </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-7558 </td><td></td></tr><tr><td> α-actina de músculo liso de anticorpos </td><td> Abcam </td><td> ab5694 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo CK14 </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> sc-53253 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo CK18 </td><td> Abcam </td><td> ab668 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato biotinilado </td><td> Vector laboratórios </td><td> BA9200 </td><td> Distribuídos através de Fisher </td></tr><tr><td> Anti-mouse-alexa-568 </td><td> Invitrogen </td><td> A10037 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P-36930 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura cirúrgica </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 91400-12 </td><td></td></tr><tr><td> Multa tesoura primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11002-12 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 pinça fina </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura crômico Gut </td><td> Pescador </td><td> NC9326254 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur de vidro </td><td> Pescador </td><td> 22-042-815 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pescador </td><td> A406P 4 </td><td></td></tr><tr><td> betadine </td><td> pescador </td><td> NC9386574 </td><td></td></tr><tr><td> Grampos de sutura </td><td> Pescador </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Grampo ferida </td><td> Pescador </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr></tbody></table>

mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in c57bl/6j mice

A influência das células do estroma, incluindo fibroblastos na progressão do tumor mamário tem sido bem documentada por meio do uso de modelos de mouse, em particular através de transplante de células do estroma e células epiteliais na glândula mamária de camundongos. Modelos atuais de transplante freqüentemente envolvem o uso de camundongos imunocomprometidos devido à diferentes origens genéticas das células do estroma e células epiteliais. Matrizes extracelulares são muitas vezes utilizados para incorporar os dois tipos de células diferentes para consistentes interações célula-célula, mas envolvem o uso de Matrigel ou colágeno da cauda de rato, que são substratos imunogênica. A falta de funcionais de células T de camundongos imunocomprometidos impede uma avaliação precisa das células estromais sobre a progressão do tumor mamário in vivo, com importantes implicações no desenvolvimento de medicamentos e eficácia. Além disso, os camundongos imunocomprometidos são caras, difíceis de produzir e requerem condições de cuidados especiais. Para superar estes obstáculos, temos desenvolvido uma abordagem para transplante de células do estroma ortotopicamente e células epiteliais em camundongos da mesma origem genética para induzir a formação de tumor consistente. Este sistema envolve a coleta normal, os fibroblastos carcinoma associados, PyVmT células de carcinoma de mama e de colágeno de camundongos C57BL/6J doador. As células são então incorporados em colágeno e transplantadas nas glândulas mamárias inguinais de camundongos fêmeas C57BL/6J. Transplante de células PyVmT sozinho formar tumores palpáveis ​​pós-transplante 30-40 dias. Análise Endpoint menos 60 dias indica que co-transplante com fibroblastos aumenta o crescimento do tumor mamário em comparação com as células transplantadas PyVmT sozinho. Enquanto as células e matriz de camundongos C57BL/6J foram utilizadas nesses estudos, o isolamento de células e matriz e abordagem transplante pode ser aplicado para ratos de diferentes origens genéticas demonstrando versatilidade. Em resumo, este sistema pode ser usado para investigar as interações moleculares entre as células do estroma e células epiteliais, e supera as limitações críticos em modelos de ratos imunocomprometidos.

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.6K visualizações.  University of Kansas Medical Center. Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Vídeo: Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Medicina

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Humanos da artéria mamária interna (IMA) Transplante e implante de stent: um modelo humano para estudar o desenvolvimento de reestenose intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Sistema de co-cultura com uma fatia organotípicas Cérebro e esferóide 3D de carcinomas de células

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...