SL, DFG (Lisansüstü Araştırma Okulu 845) bir burs ile desteklenmiştir. Bu çalışma, DFG (SFB 530/C1 967 İÇİN) hibe ve HOMFOR tarafından desteklenmiştir.

1. Stok çözelti hazırlanması <ol><li> Hazırlayın kalsiyum ücretsiz tampon (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES-KOH 10 mM glukoz, (pH 7.35)). </li><li> Çözünür Fura-2 1 mM stok solüsyonu elde etmek için DMSO&#39;daki AM. Bir girdap kullanarak çözüm homojen açık sarı olana kadar karıştırın. Fincan ışıktan koruyun. Sulandırınız Fura-2 stok solüsyonu 1 ml Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta (DMEM) HeLa hücrelerinde yükleme için 4 mcM bir final konsantrasyon% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren içine. </li><li> Distile su (pH 7.0) 12.5 mM puromycin stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C&#39;de saklayın alikot 500 mcM puromycin nihai konsantrasyonu kalsiyum ücretsiz tampon 12,5 mM puromycin stok solüsyonu sulandırınız. </li><li> 1 mM Stok çözelti elde etmek için DMSO&#39;daki thapsigargin eritin. </li><li> 1 mg ophiobolin çözünür 20 ul kloroform ve daha sonra 25 ul DMSO ile karıştırın. Mikrosantrifüj tüp kloroform buharlaşıncaya kadar açık kalır. Böylece son ophiobolin konsantrasyonu 100 mM. -20 ° C&#39;de saklayın alikot Önce, nihai konsantrasyonu 100 mcM kalsiyum ücretsiz tampon stok çözümler sulandırmak kullanmak. Böylece, canlı hücre görüntüleme için son DMSO konsantrasyonu% 0.1 aşmamaktadır. </li><li> -20 ° C&#39;de 10 mM ve mağaza alikotları bir konsantrasyon DMSO&#39;daki trifluoperazin çözülür Kalsiyum ücretsiz tampon kullanmadan önce 10 mcM bir final konsantrasyon stok solüsyonları sulandırınız. Ophiobolin A gibi canlı hücre görüntüleme Böylece son DMSO konsantrasyonu% 0.1 &#39;den değildir. </li><li> 20 mcM stok solüsyonu hazırlamak için RNaz ücretsiz su siRNA&#39;lar (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA ve kontrol siRNA) çözülür. Bir vorteks ile karıştırın ve göz çözünürleştirme gözlemlemek. Mağaza 50 ul alikotları -20 ° C&#39;de </li></ol> 2. HeLa hücreleri gen susturma ER Ca 2 + efflux belirli bir protein katkısı incelemek üzere, söz konusu genin iki farklı siRNA&#39;lar (Şekil 1) ile verimli bir şekilde susturulur. Buna ek olarak, susturma etkisi ilgili vahşi tip genin ifade üstesinden gelinmesi gerekir. Genelde biz sırasıyla faiz gen kodlama ve kodlama olmayan (UTR) bölgesinde, yöneltilen siRNA&#39;lar kullanın. UTR yönettiği siRNA istihdam tamamlama için uygun bir yol sağlar. <ol><li> Tohum 5.2 x 25 mm kapak kayma (poli-L-lisin (1 mg / ml) 200 ul 1 saat önceden tedavi) ile 6 cm kültürü çanak, 10 5 HeLa hücrelerinde (ATCC yok. CCL-2 ) Dulbecco&#39;nun modifiye kartal (DMEM) orta,% 5 CO 2 (son hacim 3.9 ml) ile nemlendirilmiş bir ortamda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 37% 1 penisilin / streptomisin ve inkübe ° C içeren. </li><li> SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA, ya da üreticinin talimatlarına (20 nM siRNA final konsantrasyon) göre HiPerFect Reaktif kullanarak bir negatif kontrol siRNA hücreleri Transfect . Kısaca, gerçek transfeksiyon prosedürü önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze siRNA&#39;lar hazırlayın: OptiMEM 80 ul çözünmüş her siRNA 4 ul (20 mcM) 20 ul HiPerFect transfeksiyon reaktif ekleyin. Bu karışımı hafifçe vortekslenmiş ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. SiRNA karışımlar (104 ul) numaralı seribaşı 5.2 x 10 5 HeLa hücreleri (3.9 ml) damla damla ekleyin. </li><li> 24 saat sonra, orta (3,9 ml) ve aynı siRNA karışımı (104 ul) ile ikinci kez hücreleri transfect. </li><li> Western Blot analizi ile susturma değerlendirin. % 80 üzerinde olmalıdır. Hücre kültürü çanak hücreleri yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) ve DMEM onlara hasat. Kontes Otomatik Hücre Sayıcı istihdam hücreleri saymak. Proteaz inhibitörü (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mikrogram / ​​kokteyl ile desteklenmiş (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl 2,% 0,5 NP40) hücrelerin hücre lizis tamponu Lyse ml Leupeptin, 3 mg / ml Antipain, 3 mg / ml Chymastatin) SDS-örnek tamponu (ile karıştırın ve 60 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 5 β-mercaptoethanol,% 0.01 &#39;mavi bromphenol ) 10.000 hücre / ml son bir konsantrasyon elde etmek için. Isı örnekleri 56 ° C de 15 dakika ve daha sonra, parça DNA bazı cam boncuklar ve 20 dakika için vorteks ekleyin. Laemmli-tipi SDS-PAGE (genellikle ayıran jel polyacrylamid% 15) tarafından her bir numune ayrı ayrı 20 ul. (&quot;Islak-leke&quot;) transfer tamponunda 3 saat veya gece boyunca (100 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl) 400 mA sabit electroblotting PVDF membran ayrılmış proteinler aktarın. Daha sonra, sonra% 5 (w / v) oda sıcaklığında 30 dakika PBS, düşük yağlı kuru süt ve blok tavşan Sec61α C-terminus yöneltilen birincil antikor leke ortaya çıkarmak ve bir anti-β-aktin- fareden antikor. PBS-TritonX-100 (% 0.05) leke yıkayın ve tsırasıyla, 5 dakika süreyle PBS içinde WICE. Primer antikor görselleştirin ECL Plex keçi anti-tavşan IgG-Cy5 veya ECL Plex keçi anti-fare IgG-Cy3-konjuge ve Resim Quant TL yazılımı 7.0 ile birlikte Typhoon-Trio görüntüleme sistemi. SEC61A1 gen durumda, maksimum susturulması etkisi genellikle 96 saat sonra ilk transfeksiyon görülür. Bir temsilci deneyi Şekil. 2. </li></ol> 3. HeLa hücreleri, tamamlama SEC61A1 sessizliğini fenotip kurtarmak için, SEC61A1 cDNA bir pCDNA3 iç ribozomal giriş sitesinin çoklu klonlama sitesi (MCS) (IRES) GFP-vektör sitomegalovirüs (CMV) organizatörü, MCS, içerdiği yerleştirildi IRES, artı, yeşil fluoresan protein (GFP) kodlama dizisinde. <ol><li> Ilk siRNA transfeksiyon sonra 48 saat, döviz ikinci kez orta (3,9 ml) ve üretici protokolü (Fugene HD vektör son oranı olan 4 mg göre Fugene HD kullanarak boş vektör veya plazmid SEC61A1 ifade ya da hücrelere dönüşümü 16 ul Fugene HD vektör). Kısaca, dönüşüm işlemi önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze plazmid hazırlamak: OptiMEM 80 ul çözülür her plazmid 4 mg 16 ul Fugene HD dönüşüm reaktif ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında yavaşça girdap bu karışımı ve kuluçkaya yatmaktadır. 5.2 numaralı seribaşı damla damla plazmid karışımı (0.1 ml) x 10 5 HeLa hücreleri (3.9 ml) ekleyin. </li><li> Plazmid ifade, kalsiyum görüntüleme ve hasat öncesi floresan mikroskopi tabi kültür kaplarına 48 saat sonra. Gerekirse daha iyi floresan sinyalleri için PBS tarafından DMEM yerine. Soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop floresan görüntüleri kaydedin. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılır ve% 80 üzerinde olmalıdır hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesi ile tespit edilebilir. Tipik bir sonuç Şekil gösterilir. 3. </li></ol> 4. Canlı hücre kalsiyum görüntüleme <ol><li> Ölçümü, önce 3,5 cm ayrı bir kültür çanak transfekte HeLa hücreleri ile kaplı kapak kayma aktarın. Fura-2, 25 ° C karanlık 11,12 45 dakika için 1 ml DMEM AM 4 mcM hücreleri yükleyin . </li><li> Fix iMic metal odası, 25 mm kapak kayma ve hücreleri iki kez yıkayın ve kalsiyum ücretsiz tampon (her seferinde 300 ul) kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Polikrom V ile 340 nm ve 380 nm dönüşümlü heyecan verici bir iMic mikroskop veri toplama ve 510 nm (:; yayıcı, 605/70 nm ışın dağıtıcı, 565 nm Filtre seti) yayılan floresan ölçüm başlayın. Her 3 s. 20-50 hücre / çerçeve içeren örnek resimleri Tutanak Fura-F340 ve F380, sırasıyla 340 ve 380 nm arka plan çıkarılır floresan karşılık oranları F340/F380, 2 sinyal. </li><li> 1 dakika sonra, kalsiyum ücretsiz tampon ya da aynı tamponu ile puromycin ile hücre tedavisi (500 mcM). Alternatif olarak, küçük bir molekül inhibitörü (10 mcM trifluoperazin veya 100 mcM ophibolin A) ile veya kalsiyum ücretsiz tampon ile hücre tedavisi. </li><li> 2 ya da 10 dakika süreyle oranlı metrik ölçümleri gerçekleştirilmektedir sonra, thapsigargin eklemek (1 mcM) ve ölçümler devam etmektedir. </li><li> Sonunda, cytoslic [Ca 2 +] oranı ölçümleri kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi ile tahmin edilmektedir. 2 Excel 2007 ve Menşe 6.1 veri analiz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şimdiye kadar, SEC61A1 gen susturulması kalsiyum etkileyip etkilemediğini soru (Ca 2 +) ER (Şekil 1) kaçak ele aldı. SEC61A1 gen 96 saat için HeLa hücrelerinde iki farklı siRNA&#39;lar tarafından susturuldu. Hücre büyümesi ve canlılığı pek etkilenmez susturma, yarı-permeabilize hücrelerinin ER içine protein taşıma neredeyse tamamen inhibe olmuştur. Ayrıca, SEC61A1 susturuldu hücreleri ER Ca 2 + kaçağı açısından ciddi etkilendi. SEC61A1 gen ekspresyonu ile gen susturma etkisi tersine dönmüştür. Böylece, tüm çekirdekli hücreleri ER membran bulunan Sec61 kompleksleri Ca 2 + homeostazı çok önemli bir rol oynaması bekleniyor olabilir Ca 2 + kaçak kanal oluşturur. Ancak, ER membran Sec61 kompleksleri oluşan kontrolsüz iyon geçirgenliğini, su dolu geniş gözenekler varlığı, ciddi Ca 2 + ER lümenine sitoplazmada, hücre içi için önemli bir mekanizma içine düzenlenmiş bir sürümü ile müdahale . sinyalizasyon. Biz memeli Sec61α sitozolik N-terminalindeki bir kalmodulin (CAM) bağlayıcı motifi tespit bağlı CaM ama Ca 2 +-nanomolar yakınlık ve sırası özgüllüğü ücretsiz apocalmodulin değil. Hücresel düzeyde, iki farklı CaM antagonistleri Ca uyarılmış <sup&gt; 2 + değil Sec61 kanalları (Şekil 4 ve 5) yokluğunda varlığında ER bırakın. İkincisi Sec61 kanallar Sec61α IQ motifi mutasyonlar içerdiği olduğu görülmemiştir. Böylece, Ca 2 +-CaM Ca 2 sınırlayıcı + sızıntı ER (Şekil 6) yer almaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Akış şeması. Ayrıntılar için metne bakınız. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 verimliliği susturmak için veri analizi. Susturma (yükleme) Sec61α ve β-aktin yöneltilen antikorlar kullanılarak Western-blot analizi ile değerlendirildi. Primer antikor ECL Plex sekonder antikorlar ve floresan görüntüleme kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 transfeksiyon verimliliği için Veri analizi. Görüntüler soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kaydedildi. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılan hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesiyle tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> HeLa hücrelerinin canlı hücre kalsiyum görüntüleme veya SEC61A1 siRNA ve CaM-antagonist ophiobolin A. HeLa hücrelerinde varlığı ya da yokluğu varlığı Şekil 4 Ekran görüntüleri SEC61A1 (B) veya yöneltilen siRNA ile tedavi edildi negatif kontrol siRNA (A) 96 saat olarak belirtilmiştir. Bu hücreler, kalsiyum göstergesi Fura-02:00 ile yüklenen ve Ca 2 inkübe + buffer sonra 0.5 mM EGTA, tampon ya da ophiobolin (Ophio A) içeren ücretsiz tampon eklenir ve inkübasyon devam etti. 10 dakika sonra, Ca 2 + serbestleşmesi, dış Ca 2 yokluğunda thapsigargin (TG) uygulanarak başlandı + ve inkübasyon devam edildi. Belirtilen zamanlarda sürekli kalsiyum görüntüleme ekran görüntüleri alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5, canlı hücre kalsiyum görüntüleme deneyleri için Veri analizi . (A) Şekil tasvir gibi bir dizi deneyler Kinetik ve kantitatif analiz. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi 2 oranı ölçümlerinden tahmin edilmiştir. Thapsigargin etkisi bar diyagram olarak gösterilmiştir. (BD) Hücreler 48 saat süreyle kontrol siRNA veya belirtilen SEC61A1-siRNA ile tedavi edilen ve daha sonra kontrol vektörü (C), ya da plazmid SEC61A1 ifade (C), ya da belirtildiği gibi plazmid mutant SEC61A1 ifade (D) ya ile dönüştürülmüş. Olarak Şekil 4 ve 5a sonra 48 saat, kalsiyum görüntüleme deneyleri yapılmıştır. Sitozolik Ca 2 değişiklik istatistiksel analizi +, A gösterildiği sunulan gibi deneylerde thapsigargin eklenmesinden sonra konsantrasyon . P değerleri &lt;0.001 anlamlı olarak eşleştirilmemiş t testi ile belirlendi ve üç yıldız işaretleri (***), NS, anlamlı değil gösterilir. Incelendi hücrelerin numaraları gösterilir. Ortalama değerler verilmiştir, hata çubukları standart hata (SEM) temsil eder. Biz bu örnekleri ref adapte olduğunu unutmayın. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6 Bu veriler Sec61 kompleksi doğmakta olan zincirler serbest bırakılması gerçekten ER ve Sec61 kompleks sitozolik ağız çevresinde bir kalsiyum nanodomain oluşumu kalsiyum salınımını yol açtığını göstermektedir. Bu kalsiyum kalmodulin bağlı ve kalsiyum kalmodulin Sec61 kompleksi kapanır. &quot;

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li><li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+form+ER+Ca2++leak+channels,+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer's+disease-linked+mutations.">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li><li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation.">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li><li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra kalsiyum sinyalizasyonu önemli bir rol oynar. Burada, bize, doğrudan bir potansiyel Ca 2 + kaçak kanal rolü adresi ve varsayılan düzenleyici mekanizmalar 13 karakterize sağlayan deneysel bir sistemi tarif var . Bu deneysel sistem bu pasif Ca 2 + efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif Ca 2 + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek. Biz sadece canlı hücreler analiz edilmelidir notu ve bu genel canlılığı% 80 üzerinde olmalıdır. Bu nedenle, hücre canlılığı rutin üreticinin protokole göre, Nükleer-ID mavi / yeşil hücre canlılığı reaktifi istihdam değerlendirilir. Ayrıca, değişikliklerin sitozolik Ca 2 + konsantrasyonu istatistiksel analiz zorunludur. Bu nedenle, deneyler en az 20 hücre, her durum için tek bir deneyde analiz edilmesi gereken hücre dört farklı gruplar ve iki lamelleri yapılmalıdır. Biz kapak fişleri tohumlama sonra aynı zamanda çeşitli deneyler yapılmalıdır olduğuna dikkat edin.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nükleer-ID Mavi / Yeşil hücre canlılığı reaktifi </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ENZ-53.004 </td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazin </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Kontes ® Otomatik Hücre Sayıcı </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio görüntüleme sistemi </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> DS-5MC kamera ile TE2000-S mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> polikrom V ile iMic mikroskop </td><td> Fotonik Kadar </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra kalsiyum 1 sinyalizasyon önemli bir rol oynar . ER membran heterotrimeric Sec61 kompleksi ER lümenine yeni sentezlenmiş polipeptitler için sulu bir yolunu sağlar. Son çalışmalar çeşitli laboratuvarlarda bu heterotrimeric kompleksi de geçici Ca 2 + kaçak kanalları 2-8 oluşabilir önerdi. Bu kavram için en önemli gözlem, doğmakta olan polipeptidlerin bu sürüm puromycin Ca 2 + ER geçici serbest bırakmak için neden ribozom ve Sec61 karmaşık oldu . Ayrıca, ER luminal protein BIP Sec61 karmaşık 9,10 düzeyinde iyon geçirgenliğini önlemede katkısı olduğunu in vitro olarak gözlenmiştir vardı. Biz, bize doğrudan potansiyel Ca 2 + kaçak kanal olarak Sec61 kompleksinin rolü ele almak ve onun varsayılan düzenleyici mekanizmaların 11-13 karakterize sağlar deneysel bir sistem kurduk . Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca 2 + görüntüleme 13 birleştirir. Hücreler, kodlama ve çevrilmemiş bölge (UTR), sırasıyla, SEC61A1 gen ya da negatif kontrol siRNA yöneltilen siRNA&#39;lar ile tedavi edilir . Tamamlama analizde, hücreler wild tip SEC61A1 gen siRNA dayanıklı ifade sağlayan bir IRES-GFP vektör ile ortak transfekte vardır. Ardından hücreler değişiklikleri eşzamanlı olarak sitozolik Ca 2 + konsantrasyonunun bir floresan mikroskop aracılığıyla hücrelerinin sayısı izlemek için oranlı metrik Ca 2 + göstergesi Fura-2 ile yüklenir. Puromycin, küçük molekül inhibitörleri ve thapsigargin gibi çeşitli ajanların etkisi, Ca 2 + kaçak değerlendirilmesi sitozolik Ca 2 +, aynı zamanda sürekli ölçüm sağlar. Bu deneysel sistem bu pasif Ca 2 + efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif Ca 2 + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

18.0K Görüntüleme.  Saarland University. Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Video: Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Biyoloji

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.