Dr. CJP Grimmelikhuijzen Kopenhag Üniversitesi (Danimarka) ve Michael Williamson aequorin plazmid sağlamak için takdir edilmektedir. Bizim işbirlikçi ARS-USDA (Teksas, ABD), Dr. Ronald J. Nachman, peptid sentezi ve Novostar plaka okuyucu sağlamak için kabul edilmektedir.

1. Kararlı hücre hatları kurulması <ol><li> Ilgi GPCR Clone ve memeli bir sistemi en iyi şekilde ribozomal bağlanma (Kozak, 1986) için başlangıç ​​kodon etrafında 5 &#39;Kozak konsensüs dizisi (GCCA / GCCATGG) içeren bir ifade vektör takın. Burada, sivrisinek kinin reseptör (. Pietrantonio ve ark, 2005. Holmes ve ark, 2003), kene kinin reseptörüne plazmid pcDNA3.1/Bm-KR ve plazmid pcDNA3.1/Aedae-KR kullanın. Bakteri ve memeli hücrelerinin seçimi için neomisin (G418) direnç seçimi için vektör ampisilin direnç kodlar - pcDNA3.1 (). </li><li> CHO-K1 boş hücreleri (plazmid olmadan) (ATCC, Manassas, VA, USA) veya 37 T-25 balonuna diğer istenen hücre hattı (BD Falcon) ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör (Holmes ve ark büyütün , 2003). Aksi belirtilmediği sürece Tüm bu koşullar altında daha fazla inkubasyon yapılmalıdır. Büyüme ortamında boş hücreleri (% 10 fetal sığır serumu ile F12K orta) koruyun 1X Antibiyotik antimikotik (Invitrogen, CA). </li><li> Hücreleri bölmek için, 37 ° C&#39;ye kadar tüm çözümler ısınmak T-25 balonuna eski orta çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın ve sonra PBS kaldırmak. Hücreleri trypsinize için, 2 dakika için 2 ml PBS-tripsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml% 7.5 sodyum bikarbonat, 4 ml 10X tripsin-EDTA) ekleyin. 3 ml besiyeri ekleyin ve hücrelerin karışımı, orta ve aşağı yukarı aspirat. Konik bir tüp ~ 200-300 g (1.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüj içine hücreleri ile orta aktarın. Süpernatant atın ve 5 ml orta hücreleri yeniden askıya. Taze orta ile 01:05 ya da 01:10 &#39;lik bir konsantrasyon yeniden süspanse hücreleri seyreltilir ve yeni bir T-25 cam şişe içinde 5 ml transferi. </li><li> Antibiyotik olmadan, hücreler (2-3 gün etrafında) sağlıklı büyüyen tohum CHO-K1 hücreler, T-25 doku kültürü şişeleri ve büyüme orta gecede büyümek sonra yaklaşık% 30 konfluent (yaklaşık 18 saat) kadar. Confluency derecesi ters floresan mikroskobu altında gözlemleyerek hücreleri tespit edilebilir. </li><li> Her bir örnek için aşağıdaki karışımlar hazırlayın: <ol><li> 100 ul Opti-MEM I Serum Orta (Invitrogen) İndirimli: 1-2 mg DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR kullanımı 4μl örnek) birleştirin. </li><li> DNA Lipofectin bir 1:1 oranında, 6 ul Lipofectin Reaktif (InvitrogenTM) 100 ul F12K serum ortamın içine karıştırın. 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> Yavaşça bir damla bilge moda (toplam hacmi = 200 mcL) 1.5.1 1.5.2 ile gelen çözümleri karıştırın. 10-15 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Hücreler eski büyüme ortamı çıkarın ve 5 ml F12K serum serbest orta hücreleri yıkayın ve ardından F12K serum serbest orta kaldırmak. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, 1.8 ml taze F12K ortamın içine yavaşça bir damla bilge moda transfeksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra, PBS ile 1.5 adım hücreler yıkanır ve hücrelerin bu yeni transfeksiyon çözüm eklemek. 18 saat inkübe edin. </li><li> F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik olmadan gece inkübe orta değiştirin. Başka bir 18 saat için antibiyotik olmadan F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu (bölme hücreler için lütfen adım 1.3 &#39;e bakınız) ile iki adet T-25 şişeler içine hücreleri bölün. </li><li> Seçici besiyeri (F12K orta artı 800μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu, Invitrogen) ile orta değiştirin. 3-4 hafta için seçici besiyeri kullanarak hücrelerin Kültür. Zamanla bu hücreler için stably kendi genomik DNA plazmid dahil seçecektir. Bakım, orta (F12K orta artı 400μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu) kullanarak hücreleri koruyarak devam edin. Hücre hatları, beklenmedik bir kirlenme durumunda kayıpları önlemek için donma medya 1:1 oranında (% 20 DMSO ile seçici orta) ile periyodik olarak dondurun. </li><li> Klonal hücre hatları seçme: İlk adım olarak, trypsinize ve bakım ortamı ile 1.8 adım adım 1.3 olarak hücreleri santrifüj. 5 ml bakım ortamında yeniden askıya alma hücreleri, hücrenin 0.5 ml askıya almak ve 10x seyreltme yapmak için 4.5 ml taze bakım orta eklemek. Tek hücre seçmek için her bir kuyunun 100 ul ekleyerek 10x seyreltme, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın. </li><li> 100 ul başına bir hücre (10x seri dilüsyonları toplam sayısı 19, normalde son seyreltme 10 -19 10 -11 aralığında olacak) bir final süspansiyon için bu hücrelerin 10x seri dilüsyonları yapmaya devam . Hemen her seyreltme seyreltme 100 ul, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın. 18 saat inkübasyondan sonra, bir ters ışık veya sadece tek bir hücre içeren ya da açıkça tek bir hücre ayrılmış iki hücre içeren görünen floresan mikroskop ve işareti kuyu altında 96 kuyucuğu gözlemliyoruz. Her üç günde bir, her gün ve değişim ortamında gözlemleyerek tutun. </li><li> Kuyu% 80 confluent (yaklaşık bir hafta), 200 ul PBS ile işaretlenmiş kuyuları 100 ul PBS-tripsin-EDTA çözeltisi ile yıkayın ve onları trypsinize. Hücrelerin her biri de 1 ml bakım ortamı ile 6-plaka iyi bir içine işaretli transfer. Sonra 3 gün boyunca bu hücrelerin büyümesine bireysel T25 balona hücreleri aktarmak. Agonist peptidler (bölüm 2 bakınız) ile kalsiyum biyoparlaklık assay kullanarak bu hücrelerin test edin. </li><li> Kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde yüksek tepki ile adım 1.11 1 hücre hattı seçin ve ikinci kez tek bir hücre seçimi aşağıdaki adımları 1,9-1,11 gerçekleştirmek. Periyodik olarak hücre hatları dondurmak. </li><li> Adım 1.12 &#39;de açıklanan ikincil seçim, en yüksek kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde tepki ile 2-3 hücre hatları seçin ve daha fazla kalsiyum biyoparlaklık plaka deneyleri için kültür onları korumak. Geçit numaraları takip edin. Zaman zaman, her zaman daha pasajlar ile hücre hatları sürekli performans bırakırsam onlara geri dönmek ve böylece erken geçişleri hücre hatları dondurma. </li></ol> 2. Kalsiyum biyoparlaklık plaka tahlil <ol><li> Bir ifade vektör ilgi muhabiri gen Arter. Burada aequorin plazmid mtAEQ/pcDNA1 (bir hediye Dr. CJP Grimmelikhuijzen ve Michael Williamson, Kopenhag Üniversitesi, Danimarka) kullanılmıştır. E. plazmid Dönüşümü coli hücreleri MC1061/PS (Invitrogen) ve QIAprep dönmeye miniprep kiti (Qiagen Inc.) kullanarak onları arındırmak. Son adım olarak EDTA, su olmadan Tris tamponu ile plazmid Zehir. </li><li> Grow bakım ortamında istenilen reseptör ifade adım 1.13 hücre hatları. Hücrelerin% 90 konfluent, trypsinize santrifüj ve ardından adım 1.3 gibi 5 ml bakım ortamda hücrelerin yeniden askıya. Sulandırınız hücreleri (bakım ortamı ile ilgili 10x) ve mikroskobunda (Bright-Line hemasitometre) ile karşı hücre hücre sayısını. Hücre sayısı yaklaşık 2 x 10 5 hücre / ml ayarlayın (9 meydanlarından birinde ortalama 20 hücre hemasitometre gösterdi). Altı plaka her kuyuya medya Tohum 2 ml seyreltilmiş hücreleri. 24 saat (hücreleri inkübasyondan sonra yaklaşık% 60 confluency ulaşmak gerekir) inkübe edin. </li><li> 6 kuyu plaka medya OPTI-MEM orta değiştirin. 4 ul FuGENE 6 Transfeksiyon reaktifi (Roche Biyokimyasallar) ile her bir iyi, bir mikrofuge&#39;de tüp içinde 96 ul OPTI-MEM karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Her tüpe 1 mcg aequorin / pcDNA 1 plazmid DNA ekleyin ve sonra yavaşça 15-20 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin, 1 dakika için örnek sallamak. Plaka hafifçe sallayarak ise damla damla bir moda her kuyuya her karışımı ekleyin. Plakalar 6 saat inkübe ve antibiyotik olmadan% 10 fetal sığır serumu içeren orta F12K ortamı değiştirmek. </li><li> Altı plaka hücrelerin 24 saat süreyle inkübe sonra, trypsinize santrifüj ve 1.3 adım olarak hücreleri yeniden askıya. Hücre sayısı 400.000 hücre / ml adım 2.1 olarak sayın ve her kuyuya 96-de beyaz ince alt mikrotitre plaka (Costar 3610) 100 ul (toplam 40.000 cells/100 ul) transfer. Yaklaşık% 80 hücre confluency kadar başka bir 24 saat süreyle inkübe edin. Bu biyoparlaklık tayini için hücrelerin optimum konsantrasyonu. </li><li> Karanlıkta 5 mcM coelenterazine (Invitrogen) içeren bir kalsiyum ücretsiz DMEM medya (Invitrogen) 90μl/well hazırlayın (coelenterazine ışığa karşı hassastır). 2.4 &#39;ten plaka, eski medya kaldırmak ve her kuyuya bu 90μl eklemek. 37 karanlıkta 3 saat plakaları ° C&#39;de ve plaka hücrelerin test edilmesi için hazırız sonra% 5 CO 2. </li></ol> 3. Enstrüman işlem ve veri analizi <ol><li> Her biyoparlaklık plaka okuyucusu farklıdır. Biz bioluminensence modunda Novostar (BMG Labtechnologies) plaka okuyucu kullanarak tahlil gerçekleştirin. Farklı bir araç kullanıyorsanız, protokol ayak uydurması gerekmektedir. </li><li> Kullanmadan önce plaka okuyucu pompaları (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR) temizleyin. Plaka sahibi plaka koymadan önce oda ışığı kapatın. Plaka sahibinin kapalı sonra, ışıkları açmak. </li><li> Peptidler (1,5 ml Eppendorf tüp) kalsiyum serbest DMEM medya çözünür. &quot;Aspire Derinlik&quot; ve &quot;Pozisyon Belirlenmesi&quot; Kullanmadan önce peptid çözüm ayarlayın. Peptidler konsantrasyonları (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, ya da istenen başka bir peptid) değişen 10 ul (10x) hücreleri Challenge ve ışık emisyon hemen kaydetmeye başlarsınız. Biz, toplam süre 50 saniye, her iyi, her 2 saniyede bir ışık yayma (465 nm) kayıt alet var. </li><li> Gibi etkin bir analog (analog FFFSWGa Taneja-Bageshwar ve ark, 2009, kullanılmakta olan) ve vektör sadece transfekte hücreler gibi bir negatif kontrol olarak pozitif kontrol emin olun. Negatif kontrol (temsilcisi sonuçlarını görmek), temel eşik ayarlamak için veri analizi sırasında gerekli olacaktır.Alakasız bir inaktif peptid negatif kontrol olarak da eklenebilir. </li><li> Run tamamlandıktan sonra, cihaz pompa (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR), ardından sonraki peptid örnek yerde yıkayın. Verileri kaydetmek ve pompalar tekrar yıkayın. </li><li> Veri işleme: Her iyi bir Microsoft Excel veri sayfası ışık emisyon verileri aktarın. </li><li> Excel GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA) Prism yazılımının 4.0 veri yapıştırın. Çeşitli peptid konsantrasyonları X ekseni ve biyoparlaklık birimleri Y ekseni. Verileri normalleştirmek için bir günlük-yanıt eğrisi arsa. Her peptid konsantrasyon-yanıt eğrileri elde etmek için bir doğrusal olmayan regresyon eğrisi uyum analizi (değişken eğim ile sigmoidal doz-yanıt denklemi) seçin. Programı araziler sonunda değerler ve AT 50 verir. </li><li> Her deney veri analizi için üç kez tekrarlanması gerekir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: CHO-K1 hücrelerde ifade edildiğinde, sivrisinek Aedes aegypti kinin reseptör multiligand reseptör olarak davrandığını ve işlevsel 1 nM üç endogenours Aedes kininler, Aedae kininler 1-3 gibi düşük konsantrasyonlarda yanıt, tek başına kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak test . Aedae-K-elde potens sıralaması Aedae-K-3, 16.04 nM ilgili EC 50 değerleri dayalı Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, Şekil 1&#39;de görüldüğü istatistiksel olarak (Pietrantonio ve ark, 2005) (p &lt;0.05) anlamlı derecede farklı idi 2, 26.6 nM ve Aedae-K-1, 48.85 nM. Ayrıca kinin artıkları kinin peptid-reseptör etkileşimi için kritik olduğunu belirlemek için bu testte kullanılır. Böcek kinin peptidlerin, çekirdek olarak da bilinen biyolojik aktivite için gerekli asgari sıra temsil eden bir C-terminal Pentapeptid paylaşıyoruz. Tablo 1&#39;de, kinin peptid çekirdek analogları çekirdekli kinin Pentapeptid FFSWGa bir Alanin yedek serisi olarak sentezlenmiş ve kalsiyum biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2006) tarafından test edilmiş. Biz amino asitler Phe 1 ve Trp 4, her iki reseptörlerine böcek kininler faaliyet için gerekli olduğu bulundu. Tahlil de, gelişmiş biostability için tasarlanmış peptidler test etmek için kullanılabilir. Tablo 2 kene rekombinant kinin reseptörü ve Şekil 2 test izobütirik amino asit (Aib) içeren tasarlanmış kinin analogları bir kalsiyum CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları faaliyet karşılaştırma gösterir biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2009). Hexapeptid analog FFFSWGa reseptör aktivitesi için bir pozitif kontrol için eklenir. Analog FF [Aib] WGA, bu Hexapeptid kontrol analog daha aktif sonuçlandı. Iki aminoisobutyric asit değiştirmeleri, [Aib] FF [Aib] WGA, analog test (Tablo 2 ve Şekil 2) çift değiştirme analogları en güçlü oldu. Bu testte olmuştur ve Nahman ve Pietantonio (2010), Nachman ark uygulanabilir nasıl daha fazla örnek için. (2009), Taneja-Bageshwar ve ark. (2008a), ve Taneja-Bageshwar ve ark. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Aedes Tahmini kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 E10 hücreleri etkili konsantrasyonu (EC 50) kininler konsantrasyon-yanıt eğrileri y-ekseni, her biri için gözlenen maksimal yanıt bir yüzdesi olarak ifade biyoparlaklık üniteleri elde edildi peptid. Veri noktaları üç bağımsız deney sırasında elde edilen ortalama altı çoğaltır temsil eder. Barlar standart hata temsil eder. (A) Tahmini Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Tahmini Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Tahmini Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, p &lt;0.05. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Bir kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları Faaliyet karşılaştırılması. Y ekseni bir konsantrasyon gözlenen biyoparlaklık bir yüzdesi olarak ifade edilen her analog yüzde maksimum biyoparlaklık birimleri temsil eder her analog test edilen tüm konsantrasyonları arasında gözlenen maksimal yanıt karşı. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile yapıldı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Reseptör hücre hattı işaretleyin </td><td colspan="2"> Sivrisinek reseptör hücre hattı </td></tr&gt; <tr><td> Peptitler </td><td> EC 50 (nM) </td><td > 1 mM Maksimal biyoparlaklık yanıt </td><td> EC 50 (nM) </td><td> 1 mM Maksimal biyoparlaklık yanıt </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5.600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3.050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2.800 </td><td> 1.830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9.300 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tahmini potenslerine (EC 50) ve maksimal biyoparlaklık yanıt kene ve sivrisinek reseptör transfekte hücre hatları üzerinde test edilen tüm peptidlerin *. * EC 50 yarım maksimum yanıt elde etmek için gerekli konsantrasyonu tahmin ediyor. I: biyoparlaklık yanıt en az 300 adet (yalnızca vektör transfekte hücreler seviyesi) ise İnaktif. A: peptid FFSWGa ilgili kalıntı alanin almıştır konumu. ND: Analog test edilmiş, ancak ya çok aktif olmayan veya düşük molarities aktif değildi, böylece EC50 tespit edilemedi. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib 2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Kinin, amino izobütirik asit (Aib) içeren kene rekombinant kinin reseptör analogları (K ) test. AC: asetil; α Me: α metil-fenilalanin; β3F: β3-fenilalanin; a: amid.

<ol>
	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs.">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biostable+agonists+that+match+and/or+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs.">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond,+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus.">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+and+non-selective,+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 .</li><li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+and+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li><li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

Biz bu protokolü kullanarak, Arachnida (keneler, kene ve örümceklere), kene kinin reseptör keşfedilen ilk nöropeptid reseptör fonksiyonel karakterizasyonu yapabilecektir. Bu yöntem, üç temel uygulamalar vardır. İlk olarak, teknik ligand aktivite ölçümleri ile reseptör deorphanization için uygulanabilir. İkincisi, tahlil ligand-reseptör yapı-aktivite ilişkileri (SAR) çözebilirsiniz. Üçüncü olarak, ilaç keşfi yöntemleri kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, hemen hemen her GPCR agonistleri veya antagonistleri faaliyet çalışma kullanılabilir. Biz küçük kütüphanelerin tarama için bu protokolü adapte başlıyor. Kullanılan hücre hattı, her yerde G proteini G 16 ifade etmez . Biz bunu gerek yoktu, çünkü Gq protein ve hücre içi kalsiyum kaskad ile eklembacaklıların kinin reseptörleri, sinyal ve burada gösterildiği gibi memeli hücrelerinde bu sinyalizasyon özellikleri korumak.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, Amerika Birleşik Devletleri </td></tr><tr><td> F12K orta </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM İndirgenmiş Serum Orta </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep dönmeye miniprep kiti </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfeksiyon reaktif </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well beyaz ince alt microtitere plaka </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> kalsiyum ücretsiz DMEM medya </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Parlak Hattı hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td></td><td> Horsham </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism yazılımının 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 ve T-75 şişeler </td><td> BD Falcon </td><td> 353.014 ve 353.135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Arthropod hormon reseptörleri birçok temel fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen roman pestisitler için potansiyel hedefler. Bunların büyük çoğunluğu G-protein reseptörler (GPCRs) süperailesinin aittir. Biz kene ve sivrisinek eklembacaklı kinin reseptörleri karakterize odaklanmıştır. Eklembacaklılar kininler myotropic, idrar söktürücü ve nörotransmiter fonksiyon ile çok fonksiyonlu nöropeptitlerin. Burada, iki heterolog kinin böcek kininler yapı-aktivite ilişkileri sistematik analizi için bir yöntem reseptör ifade sistemleri açıklanmıştır. Biz, idrar söktürücü, myotropic ve / veya kene ve sivrisinek sindirim süreçleri bozmaya potansiyeline sahip biostable kinin analogları gelişimi ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Güney sığır kene, Boophilus Microplus (Canestrini) ve sivrisinek Aedes aegypti (Linnaeus), kinin reseptörleri stably memeli hücre hattı CHO-K1 ifade edildi. Bu reseptörlerin fonksiyonel analizleri, hücre içi biyoparlaklık peptid başvurusu üzerine bu rekombinant hücrelerin sitoplazmik kalsiyum seviyelerini belirlemek için önlemler kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak tamamlandı. Bu yöntem aequorin protein, Işıklı denizanası izole bir photoprotein yararlanır. Biz geçici stably kinin reseptörleri ifade hücre hatları plazmid aequorin (mtAEQ/pcDNA1) transfekte. Bu hücreler daha sonra hücre içi aequorin ile kompleksleri kofaktör coelenterazine ile tedavi edildi. Bu bağ, kalsiyum varlığında kalsiyum konsantrasyonu göstergesidir lüminesans seviyeleri yayan kırar. Kinin reseptör hücre içi kalsiyum salınımı yoluyla sinyalleri olarak, sinyal yoğunluğu peptid potens ile ilgili. Bu protokol, daha önce açıklanan birkaç değişiklik ile protokolleri bir sentezidir. GPCRs kararlı ifade, fonksiyonel plaka testlerinin (Staubly ve ark, 2002 ve Ahırlar ve ark, 1997 ile bir memeli hücre hattı için adım adım talimatlar .) Bu metodoloji kullanarak, sivrisinek ve kene kinin reseptörleri ifade istikrarlı hücre hatları kurmayı başardık, üç sivrisinek kininler potens karşılaştırmak, ligand-reseptör etkileşimi için kritik amino asit pozisyonları belirlemek ve bir peptit üretilen yarı-tarama gerçekleştirmek kütüphanesi. Böcek kininler endojen peptidazlar hızlı enzimatik bozulmaya karşı duyarlı olduğundan, ciddi haşere kontrolü ya da endokrinolojik çalışmalar için bir araç olarak kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle, biz de kendi gücü ve biostability geliştirmek için amino izobütirik asit (Aib) içeren kinin analogları test. Bu peptidaz dayanıklı analog biostable böcek kinin analogları gelişiminde önemli bir kurşun temsil eder ve nöropeptid tabanlı eklembacaklıların kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K Görüntüleme.  Texas A&M University (TAMU). Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Video: A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

yetiştirme<em&gt; Geyik kenesi,</em&gt; Siyah Ayaklı Tik Tak: Fare üzerinde Olgunlaşmamış Evreleri Besleme

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...