Biz minnetle Lynntech A.Ş., T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, ve B. Wallek teknik yardım ve birçok faydalı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, hibe CBET-0933688 altında ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF) tarafından desteklenmiştir.

1. Konvektif thermocycler Temel Tasarım <ol><li> Biz sıcaklıklarda bağımsız (Şekil 2) 7 kontrol edilir iki alüminyum levhalar arasında sıkışmış değiştirilebilir plastik reaksiyon odasında &quot;kartuşlar&quot; oluşan basit bir konvektif thermocycling cihazı inşa ettik. </li><li> Silindirik reaktör kuyu, delik çapı ve istenilen boy oranları (yükseklik / çap = h / d) elde etmek için kullanılan plastik levha kalınlığı farklı kombinasyonları ile polikarbonat blokları delik işleme dizileri gömülür . İki farklı reaktör geometrileri Burada sunulan sonuçlar dikkate alınır: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1.75 mm, 38.2 mcL hacim; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1.98 mm, 18,5 mcL hacmi. </li><li> Reaktörün alt yüzeyi microprocesser odaklı bir sıcaklık kontrolörü ile arabirim kartuş ısıtıcıları içeren bir alüminyum blok kullanılarak ısıtılır. </li><li> Reaktörün üst yüzeyinde sıcaklık sirkülasyon su banyosuna bağlı bir alüminyum blok kullanılarak düzenlenir. </li><li> Tüm montaj karşı alüminyum bloklar arasındaki ısı iletkenliği sınırlamak için naylon vidaları kullanarak birlikte kelepçelenir. </li></ol> 2. PCR Reaksiyon karışımı hazırlanması ve yükleme <ol><li> 100 mcL tipik bir reaksiyon karışımının 10x tampon çözelti, 25 mM 6 mcL 10 mcL içeren MgCl 2, dNTP 10 mcL (2 mM her), DI su, β-aktin prob mcL 10, 10 mcL β 41.2 mcL -aktin ileri astar, 10 mcL β-aktin ters astar, 2 mcL insan genomik DNA (10 ng / ml) ve KOD DNA polimeraz (2.5 adet / ml) 0.8 mcL. </li><li> Reaktifler yüklemeden önce, ince bir alüminyum bant sayfasını kullanarak PCR odasının alt yüzeyi mühür. </li><li> Yağmur X anti-Fog takip bovine serum albumin, 10 mg / mL sulu çözelti ile reaktör kuyu durulayın. </li><li> Pipet uzun jel yükleme pipet uçları kullanarak reaktör kuyu içine reaktifler ve FEP Teflon bant ile üst yüzeyi mühür. </li></ol> 3. Konvektif PCR Reaksiyon Koşu <ol><li> Istenilen alt ve üst yüzey sıcaklıkları reaksiyon, ön ısıtma alüminyum bloklar hem başlamadan önce. </li><li> Sandviç plastik reaktör alüminyum ısıtma blokları arasındaki PCR yüklü ve hızlı bir şekilde naylon cıvatalar ile birlikte montaj kelepçe. </li><li> Sonra reaksiyon istenilen zaman ilerledi, ısıtıcılar kapatın ve hızla soğutulur ve konvektif akışını durdurmak için soğuk bir metal blok üst cihazın alt (sıcak) yüzey yer. </li><li> Plastik reaktör çıkarın ve bir sonraki analiz için kuyulardan (uzun jel yükleme ipuçlarını kullanarak) ürünler pipetle. </li></ol> 4. Jel Elektroforez Analizi yapılması <ol><li> Çözüm açık hale gelinceye kadar karıştırarak sıcak bir plaka üzerinde 1x tampon 500 mL 10 g agaroz ısıtma, 2 ağırlıkça% agaroz jel hazırlayın. </li><li> Agaroz jel döküm tepsisine yerleştirin ve tarak eklemek. ~ 30 dakika için jel seti alalım. </li><li> Tarak çıkarın ve jel batık kadar 1x TAE tamponu ekleyin. </li><li> Floresan boyanan DNA örnekleri 2 mcL 100x SYBR Green I çözümü, 2 mcL DNA örneği, 2 mcL 6x Portakal Yükleniyor Boya ve 4 mcL TAE tampon içerir. </li><li> DNA örnekleri kuyuların içine ekleyin ve 1 saat 60 V 100 bp DNA merdiveni boyutlandırma işaretleyici ile ayrılması çalıştırmak. </li><li> Jel çıkarın ve bir sonuç elde etmek için UV ışık altında fotoğraf. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Konvektif thermocyclers optimal tasarım reaktifler PCR sürecinde görev alan kilit sıcaklıklarda yoluyla taşıma kapasitesine sahip bir dolaşım akışı oluşturmak doğru reaktör geometri seçilmesi gerekir. Burada kabul edilen silindirik reaktörlerde çeşitli olabilir geometrik parametreleri yüksekliği (h) ve çapı (d) veya eşdeğeri, en boy oranı (h / d). Biz, içinde bir dizi hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) kullanarak farklı boy oranları üzerinde PCR reaktörler konvektif 3-D akış alanları araştırdı ve beklenmedik bir şekilde karmaşık desenler ortaya çıkabilir bulundu. Daha da önemlisi, bizim analiz ölçüde reaksiyon 12 hızlandırmak bu karmaşık akış alanları bir alt kümesi ortaya çıkardı. Bu geometrik etkileri açıkça boy oranları yüksek ve düşük reaktörlerde akış alanları karşılaştırarak görülebilir. Yüksek en-boy oranı durumda (h / d = 9; uzun boylu, sıska bir silindir), sıvı elementler aslında döngüler kapalı yollar izleme yörüngeleri boyunca advected, ve uzun süreler için de aynı yolu takip etmek kilitli (Şekil 3a). Sonuç olarak, f arasındaki alışverişi için çok az fırsat varPCR (reaktör üst ve alt yüzeylerinde tavlama ve denatüre uç arasında gidip) ve (merkezine yakın lokalize amplifikasyon katkıda değilsiniz kalan yörüngeleri çok daha büyük bir topluluk için termal koşulları en iyi dizisi reaktiflerin maruz düşük yörüngeleri reaktör). Akışkan elemanı yörüngeleri artık kapalı yolları (Şekil 3b) izleyin anlamda daha kaotik olma, akış alanının küçük boy oranı (daha kısa, daha geniş bir silindir y / d = 3) çok farklıdır . Böylece, reaktifler daha karmaşık bir sıcaklık profili tabi olsa bile, sıvı elementler reaktif hacmi optimum ısı profilleri deneyimi için bir fırsat daha böylece çok daha geniş bir yörünge keşfetmek mümkün. Bu sonuçlar Sezgilere ise bireysel akış yörüngeleri h / d = 9 sıcaklık profilleri üreten PCR için daha olumlu görünebilir öneririz geleneksel PCR, / saat akış alanının kaotik yapısından istihdam benzer &quot;bakmak&quot; d = 3, sonuçta reaktifleri, çok uzun süre olumsuz yörüngeleri sıkışıp kalmamak için geliştirilmiş alışverişi teşvik ederek küresel ölçekte hakim. Bu hipotezi test ve reaktör geometri PCR için daha elverişli olduğunu belirlemek için, bir insan genomik DNA şablondan β-aktin gen ile ilişkili 295 bp hedef PCR çoğaltma gerçekleştirmek için her ikisi de kullanılır. Enteresandır ki, biz rutin saatte sadece 10 dakika içinde doğru hedef ürün amplifikasyon elde / d = 3 y / d saptanabilir ürünleri en az 20 dakika önce aynı reaksiyonu gözlendi (Şekil 4a) = 9 (Şekil 4b) . Reaksiyon özgüllüğü de saatte daha büyüktür / d = 3 saat birden fazla nonspesifik ürünler üretilir tek bir PCR ürünü elde edilir / d = 9 akış alanının tuzakları uzun bir süre için olumsuz termal yörüngeleri sıvı unsurları . <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Termal konveksiyon alt ve üst yüzeyleri silindirik bir oda farklı sabit sıcaklıklarda tutulur. Alt yüzeyinde sıcaklık üst kısmında daha yüksek ise, dikey bir yoğunluk gradiyenti dolaşım akış paterni üretme yeteneğine sahip olan kapalı bir sıvı içinde kurulmuştur. Geometrik parametreleri (yüksekliği h ve çapı d) doğru bir seçim ile, konvektif akış alanının üst ve alt yüzeyleri sırasıyla sıcaklık, (yerçekimi dikey olarak aşağı doğru hareket eder) tavlama ve denatüre yakınlarındaki manintained PCR thermocycling harekete geçirmek için harnessed olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 (a), konvektif bir akış anahtar bileşenleri PCR thermocyler . Bir reaktör kartuşu, silindirik odaları bir dizi içeren bir polikarbonat blok oluşur. Dolaşan su banyosu ve gömülü ısıtıcılar içeren bir alt plaka bağlanmak üzere tasarlanmış bir üst plaka blok arasında sıkışmış. (B) PCR cihazı reaksiyonu gerçekleştirmek monte sonra yüklenir ve reaktör kartuş içinde mühürlü. Tamamlandığında, procucts kolayca sonraki analiz için dışarı pipetlenir olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 sıcaklıkları 53 ve 96 silindir reaktörler içinde oluşturulan 3-D konvektif akış alanları Hesaplamalı simülasyonları ° C, sırasıyla üst ve alt yüzeylerinde empoze. Sonuçlar, boy oranları gösterilmektedir (a) h / d = 9 (38.2 mcL reaktör hacmi) ve (b) h / d = 3 (18.5 mcL reaktör hacmi). 3D akış alanının yoluyla seyahat eden bir sıvı elemanı tarafından takip edilen temsili yörünge gösterilen yolun-üst ve yan projeksiyonları ile birlikte sol, sağ tarafta bir sıvı eleman aşağıdaki sıcaklık zamana karşılık gelen arsa gösterilir. H / d = 9 termal profili geleneksel PCR yakın görünür, ancak h / d = 3 kaotik akış alanının PCR Sezgilere daha uygundur. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. DNA replikasyonu Şekil 3 (yüzeyler sırasıyla 53 ve 96 ° C&#39;de muhafaza edildi, üst ve alt) gösterilen reaktör geometrileri elde edilen sonuçlar. (A) PCR büyük ölçüde reaksiyon süresi sadece 10 dakika sonra (100 baz puan (bp) merdiveni, şerit 1-4: 4 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürün M) görünür güçlü ürünler olarak ortaya h / d = 3 hızlanır. (B </strong&gt;) (M h / d = 9 gerçekleştirilen aynı reaksiyon görülebilir ürünler gözlenmektedir önce en az 20 dakika gerektirir ve birden çok bantlar istenilen ürüne ek olarak non-spesifik hedef DNA açıkça belirten çoğaltma: 100 bp merdiven , şeritleri 1-2: 2 farklı silindirik odaları paralel reaksiyonlar ürünler).

<ol>
	<li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Techniques:+Reviews+and+Protocols.">Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2005).</li><li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+in+a+Rayleigh-B&#233;nard+convection+cell.">PCR in a Rayleigh-B&#233;nard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li><li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection.">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li><li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosiphon-based+PCR+reactor:+experiment+and+modeling.">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li><li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler.">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li><li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems.">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li><li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling.">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li><li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system.">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler.">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li><li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems:+A+convection-diffusion-reaction+model.">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li><li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR.">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li><li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring.">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , (2010).</li></ol>

Akış ve kimyasal reaksiyon arasındaki etkileşimi kaotik adveksiyon etkisi altında önemli ölçüde değiştirebilir. Ama bu karmaşık akış devletler, özellikle 3D efektleri önemli hale gerçekçi geometrileri, çalışma zorlu. Saat Rayleigh-Benard konveksiyon / d&gt; 1 sadece bu olayları araştırmak için uygun bir platform sağlar, PCR işlemi gerçekleştirmek için uygulama probed olmak akışı ve kimyasal tepkimeler arasındaki kaplin sağlar. Bu benzersiz yeteneği kaotik etkileri hareket (Sezgilere) DNA replikasyon oranı hızlandırmak için en iyi akışı seçmek için mümkün kılar.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Birçok moleküler biyoloji deneyleri, başlangıçta seyreltik bir hedef DNA saptanabilir bir konsantrasyon seviyesini yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir şekilde bağlıdır. Ancak geleneksel PCR thermocycling donanım tasarımı, ağırlıklı olarak, sıcaklık termoelektrik ısıtıcılar tarafından düzenlenir ciddi ulaşılabilir reaksiyon hızı 1 sınırlar büyük metal ısıtma blokları dayanmaktadır . Önemli ölçüde elektrik gücü, aynı zamanda taşınabilir bir formatta bu araçları dağıtmak için yeteneğini sınırlayan reaktif karışımı tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için gereklidir. Termal konveksiyon bu sınırlamaları aşmak için 2-9 potansiyeline sahiptir, gelecek vaat eden bir alternatif thermocycling bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır . Konvektif akımları Dünya&#39;nın atmosfer, okyanuslar, ve iç, dekoratif ve renkli lav lambaları arasında değişen ayarları çeşitli bir dizi gündelik bir olay. Akışkan hareket her iki durumda da aynı şekilde başlatılır: kaldırma kuvveti tahrikli bir istikrarsızlık, sınırlı bir sıvı hacmi mekansal bir sıcaklık gradyanı maruz kaldığında ortaya çıkar. Bu aynı olgunun PCR thermocycling gerçekleştirmek için çekici bir biçimde sunuyoruz. Uygun olarak tasarlanan bir reaktörde, geometri boyunca statik bir sıcaklık gradyanı uygulayarak, sürekli bir dolaşım akışı, denatüre tavlama ve reaksiyon (Şekil 1) uzantısı aşamaları ile ilgili sıcaklık bölgeleri boyunca tekrar tekrar PCR taşıyacak kurulabilir. Thermocycling nedenle cihazın tekrar tekrar ısıtmak ve soğutmak için tamamen ihtiyacını ortadan kaldırarak, sadece sabit sıcaklıklarda iki karşıt yüzey tutarak bir pseudo-izotermal şekilde harekete olabilir. Konvektif thermocyclers tasarımı karşı karşıya kaldığı temel güçlüklerden biri, tam reaktifler sırayla 10,11 zaman yeterli bir süre için doğru sıcaklık bölgeleri işgal sağlamak için reaktör içinde mekansal hız ve sıcaklık dağılımları kontrol etmek için ihtiyaç vardır . Burada tam 3-D hız ve sıcaklık dağılımları microscale konvektif thermocyclers 12 prob çabalarımız sonuçlarını açıklar. Beklenmedik bir şekilde, karmaşık akış yörüngeleri reaktifler optimum sıcaklık profillerinin tam kapsamlı örnek için geliştirilmiş bir fırsat sağladığı akış yolları arasında (1) sürekli döviz sinerjik bir kombinasyonu nedeniyle PCR için son derece elverişli bir alt kümesi keşfedilen ve ( 2) artan zamanlı PCR adım sınırlayıcı uzantısı sıcaklık bölgesi içindeki oranı geçirdi. Son derece hızlı DNA amplifikasyonu kez (10 dk altında) bu akışları oluşturmak için tasarlanmış reaktörlerde ulaşılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection at JoVE.com

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Biz, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile DNA replikasyonu gerçekleştirmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Termal konveksiyon sabit sıcaklıkta reaktör yüzeyler karşı koruyarak, denatüre, tavlama ve kullandırım koşullarının arasında sürekli mekik reaktifleri koşulmuştur. Bu doğal olarak basit tasarımı, hızlı PCR daha erişilebilir hale getirmek için vaat ediyor.

Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K Görüntüleme.  Texas A&M University. Biz, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile DNA replikasyonu gerçekleştirmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Termal konveksiyon sabit sıcaklıkta reaktör yüzeyler karşı koruyarak, denatüre, tavlama ve kullandırım koşullarının arasında sürekli mekik reaktifleri koşulmuştur. Bu doğal olarak basit tasarımı, hızlı PCR daha erişilebilir hale getirmek için vaat ediyor.

Video: Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Sigma&#39;nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Biyoloji

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...