Protokolümüz, beyin hasarı sonrası insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin terapötik etkinliğini test etmek için kapsamlı bir klinik öncesi iş akışı göstermektedir. Travmatik beyin hasarı Bu model sıkı mekanik kuvvet parametrelerini kontrol ederek ve bu nedenle iyi tanımlanmış bir yaralanma sağlayarak çok yönlülük ve tekrarlanabilirlik yüksek derecede sağlar. Bu işlemler diğer beyin bölgelerindeki yaralanma ve iyileşme süreçlerinin incelenmesinde kullanılabilir ve transplantasyon yöntemi birçok hücre tipinde kullanılabilir.
Kranial delme tekniği uygun basınç, hız, derinlik ve düzgün hareketler ana el becerisi gerektirir gibi zordur. Tüm olayları belgele ve kapsamlı bir şekilde pratik yapın. Tek taraflı kraniektomi yapmak için, anestezili faredeki parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın ve fareyi stereotaksik bir çerçevede sabitlayın.
Steril pamuk lu bez ve iyot bazlı solüsyon ile gözlere antibiyotik oftalmik merhem uygulayın. % 70 etanol ile iyot çıkarın ve bir fenestrated cerrahi perde ile hayvan kapağı. Kafa derisi üzerinde 1,5-2 santimetre lik bir orta hat kesisi yapın ve yarayı temizlemek ve bregma'da orta hattan sol fasyayı temizlemek için steril pamuklu bezler kullanın.
Kraniektomi bölgesini tanımlamak için bir darbeci probu kullanın ve x'i sıfıra, y'yi bregma'ya sıfır stereotaksik referans noktasına eşit olarak ayarlayın. Sondayı orta hattan iki milimetre sola göre yanal olarak ayarlayın. Varsayımsal darbe alanının etrafında beş milimetre çapında bir daire dönüm noktası için ince uçlu cerrahi olarak güvenli bir belirteç kullanın.
Darbeciyi kaldırın ve döndürün ve beş milimetrelik daireyi tamamlayın. Beş milimetrelik dairenin doğruluğunu doğrulamak için darbeciyi kısa bir süre pozisyona döndürün. Daha sonra darbeciyi kaldırın ve pozisyon dışına döndürün ve yüksek hızlı döner mikro motor kiti el aleti kullanın yuvarlak ucu 0.6 veya 0.8 milimetre çapak matkap ucu ile donatılmış bir yüksek hızlı döner mikro motor kiti el aleti kullanmak kafatasıaçık bir delik yapmak için 70-80%maksimum hızda.
Bu sınır içinde beş milimetrelik çevresel anahat boyunca sondaj yaparken kafatasına hafif basınç uygulayın ve ortaya çıkan kemik flebi kaldırmak için forseps kullanın. Dikiş hatları ile delme kemik kesilir ve ek basınç gerektirir gibi ek zorluk ortaya çıkabilir. Kan damarları yakın ilişki içinde olabilir ve bu nedenle kanama olayları muhtemeldir.
Hafif kontrollü kortikal darbe yaralanmasına neden olmak için, darbeci sondayı steril bir alkol hazırlık yastığıyla temizleyin ve darbeci sondayı maruz kalan korteksin üzerinde tekrar konuma getirin. Sondayı dura mater yüzeyine dokunana kadar indirin ve bu konumu z sıfıra eşit olarak işaretleyin. Pistonu geri çekin ve z'ye hareket edin eksi bir milimetreye eşit ve korteksi etkilemek için pistonu boşaltın.
Hemen piston yükseltmek ve pozisyon kol hareket ve tuzlu cömert bir hacim ile korteks sulamak ve kafa derisi kesi kapatmak için basit kesme dikiş ve 5-0 ipek sütür kullanın. Sonra scruff içine deri altı enjeksiyon ile Siklosporin A kilogram başına 10 miligram teslim ve tam iyileşme kadar izleme ile temiz bir önceden ısıtılmış post-operatif kafesiçinde fare yerleştirin. Kraniektomiden yaklaşık 24 saat sonra fareyi stereotaksik çerçeveye geri yerleştirin.
Fareyi feneste cerrahi perde ile kapatın. Bölgeyi temizlemek ve dikişleri gevşetmek için kesi bölgesini steril salin ile lavaj. Kesi bölgesini nazikçe sterilize etmek için %70 etanollü pamuk lu bez kullanın ve dikişleri çıkarmak için ince cımbız ve oftalmik makas kullanın.
Sonra bol steril salin ile cerrahi ve kraniektomi sitesi sulama. Bir hücre kültürü biyogüvenlik başlık olarak, yavaşça girdap veya homojen bir hücre süspansiyon sağlamak için hücrelerin tüp dokunun. Bir hamilton şırınga içine hücrelerin yaklaşık 7,5 mikrolitre piston ucundan yüklemek için bir mikropipet kullanın.
Şırıngayı 120 derecelik bir açıyla tutarak, piston ucunu aşağı bakacak şekilde takın, süspansiyon ve piston ucu arasında bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat eden pistonu takın. Conta tertibatını pipet iğnesine takın ve iğneyi şırıngaya takın. Hücre süspansiyonuna pipet iğnesi takmak için pistonu itin ve şırıngayı stereotaksik şırınga pompasına takın.
Şırınga pompası tertibatının düzgün çalıştığından emin olmak için pistonu ilerletin ve iğneyi enjeksiyon için koordinatlara taşıyın. İğne ucunu bregma'ya hizala ve x ve y-koordinatlarını sıfıra ayarlayın. İki milimetre lateral ve eksi bir milimetre posterior bregma ve dura mater yüzeyine iğne ucu dokunmak için kraniektomi üzerinde iğne ucu taşıyın.
İğneyi hafifçe kaldırın ve iğnenin temas ettiği yerde dura mater'de küçük bir kesi yapın. Stereotaksik koordinatı sıfıra eşit olarak ayarlayın ve iğneyi beyne sokmadan önce hücre süspansiyonunun yeterli şekilde aktığını doğrulamak için pistonu itin. İğneyi beyne z derinliğine tanıtım eksi 1,4 milimetreye eşit olarak derin korteksin gri madde/beyaz madde sınırına greft yerleştirin.
15 dakikalık bir süre içinde hücre süspansiyon aşılamak için şırınga pompası başlatın. Doku hidrasyon korumak için enjeksiyon sırasında steril salin ile cerrahi site sulama hücre süspansiyon çıkışı izlemek için uzun bir çalışma mesafesi mikroskop kullanın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, yavaş yavaş transplantasyon iğnesini geri çekin ve yeni dikişlerle kesi kapatmadan önce ameliyat bölgesini ek tuzlu suyla sulandırın.
O zaman gösterildiği gibi ameliyat sonrası bakım ver. Yapışkan bant kaldırma testi için, önce küçük bir jilet kullanarak sarı ve kırmızı elektrik bandı parçalarını pürüzsüz bir cam yüzeyüzerinde beş milimetrelik şeritler halinde üçer dilime kesin. Fareleri testten önce en az 30 dakika boyunca davranış test odasına getirin ve fareyi boynundan ve sırtından dizginlemek için fareyi vücudunun ve başının ön pençelerini uzak tutması için bir işleme bezi kullanın.
Her forepaw plantar yüzeyine bir yapışkan şerit yerleştirmek için cımbız kullanın ve pençeleri şeritler güvenli hassas ve tutarlı parmak basıncı kullanın. Farenin dört pençesi de plastik test kutusuna sahipken fareyi hızlıbir şekilde plastik bir silindire yerleştirin ve iki kronometre başlatın. Sonra sol pençe bildirimi, sol pençe kaldırma, sağ pençe bildirimi ve sağ pençe kaldırma için gecikmeler kaydetmek için iki kronometre kullanın.
Bu pilot deneyde, forelimb fonksiyonu sadece kraniektomi, kontrollü kortikal darbe yaralanması ve naif farelerde karşılaştırıldı. Ameliyat yapılan fareler, ameliyattan hemen sonra bir ila üç gün boyunca yapışkan uyaranları fark etmek için geçici olarak artmış gecikme ler ve ipsilateral ön pençeden yapışkan çıkarmada geçici postoperatif açıklar sergilediler. Ancak kontrollü kortikal darbe yesahip olan fareler, ameliyat sonrası 28.
İnsan nükleer antijeni için fare beyin bölümlerinin immünboyboyama insan hücre greftleri açıkça SHAM yaralanma ve kontrollü kortikal darbe beyinlerde konak dokulardan ayırt edilebilir ortaya koymaktadır. Kültürlü insan hücrelerini kullanırken ve kemirgenlerle veya immünsupresif ilaçlarla temas eden şırınga iğnelerini kullanırken standart laboratuvar güvenlik prosedürlerine uymanız gerekir. Beyin dokusu bölümleri nöroinflamatuar belirteçlerin ekspresyonu için analiz edilebilir, çünkü greftin konak dokusu nun yaralanma yanıtını nasıl etkilediğini ve tam tersi olduğunu bilmek değerlidir.
Biz yaralanma sonrası davranış sonuçlarında ince cinsiyet farklılıkları bulmak için şaşırdık. Şimdi seks beyin hasarına nöroimmün yanıt bir rol oynar olup olmadığını araştırıyoruz. Sabit eller, sabır ve uygulama iyi bir kraniektomi tekniği geliştirmek için çok önemlidir.
Uygun olmayan bir kraniektominin verdiği ikincil hasar, hücre nakli için hedeflemek istediğiniz bölgeyi tehlikeye atabilir.
