Amerikan Kanser Derneği (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / Amerikan Beyin Tümörü Derneği ve Ben Nakano Han Aile Vakfı.

1. Ortam hazırlanması <ol><li> Toz (1.01614.1000-EMD,% 0.6 Arıtılmış Agar çözüm - DMEM/F-12 (1X), Sıvı 01:01 (Invitrogen 10.565-042) - medya% 10 FBS (Gibco 16.140-071) kullanılarak hazırlanmıştır. .) Deney boyunca steril koşullar tutuldu. </li><li> FBS medya 5ml hazırlanması için (16.140-071 - Gibco) - 50ml son hacim Sıvı 1:1 (Invitrogen 10.565-042), DMEM/F-12 (1X) 45mL eklendi. Hazırlanan medya, 37 ° C sıcaklık su banyosunda tutuldu. </li><li> Agar çözüm ısı mikrodalga yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. 0.3 gram toz agar mikrodalga kullanarak 50ml distile su dağıldı. Agar çözüm su banyosu içine tutarak 37 ° C sıcaklığa kadar soğumaya oldu. </li><li> Biz medya adım 1.2 ve 1.3 ve hazır stok çözelti eşit hacimde kullandı. Oranı% 0.6 agar (0.5mL) ve% 10 FBS-D-MEM/F-12 medya (0.5mL), 1:1, 6 kuyucuğu her kuyuda toplam hacim 1 ml. </li></ol> 2. Doku işleme <ol><li> Glioblastoma Multiforme (GBM) dokuları Patoloji Anabilim Dalı ameliyattan sonra hemen alındı. Doku Patoloji Anabilim Dalı GBM olarak sınıflandırıldı. </li><li> Doku dikkatlice forseps kullanarak patri plakalı aktarılır ve buz 5ml 1XPBS ile 3 kez yıkandı. </li><li> Disseke örneklerinden bir cerrahi bıçak (Feather-2976 # 10) ve forsepsle (balıkçı bilimsel) ile tümör bloklar (çapı yaklaşık 10 mm) oluşturmak için numuneler seri bölümleri kesilmiştir. </li><li> Blokları 6 plaka aktarılır. Her ortam de içeren oldu 1mL 1.4 adım söz. Doku doku canlı tutmak için hava yeterince maruz vardı. </li><li> Tümör bloklar sonra DMSO (% 5) veya TMZ (2.5 nM) enjekte edilir ve 37 ° 16 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş hava. DMSO 0.1ml (% 5) veya TMZ tutarlı tedavisi için farklı yerlerde tümör bloklar 3 kez enjekte edildi. 28G1 / 2 0.37X12.7mm İnsülin Şırınga 1mL (Rahatlık noktası 26.027) kullanarak ilaç enjekte edildi. </li><li> 16 saat sonra blok 3 kez 5 ml 1XPBS ile yıkandı. Bloklar yıkadıktan sonra 10 ml, 50 ml tüpler 24 saat için v / v% 10 formalin (Ricca kimya şirketi) (BASIX 5.539.802) ile tespit edildi ve 4μm bölümleri gömülü parafin için işlenmiş. </li><li> &quot;HAYIR ISI&quot; formalin sabit bölümünde heyecan plaka beher yerleştirilir ve 30 dakika her çözüm için aşağıdaki çözümleri yoluyla işlenmiş. % 30 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol, ksilen. </li><li> Doku kağıt havlu, lekelenen ve 30 dakika boyunca erimiş parafin (58 - 60 ° C, Fisher paraplast parafin) yerleştirildi. </li><li> Doku Surgipath Blue Ribbon parafin kullanarak kalıpları gömülü, gömülü doku oda sıcaklığına kadar soğutulur. </li><li> Parafin 4μm doku kesitlerinde alınan ve Fisher Plus, slaytlar yerleştirildi. </li></ol> 3. İmmünohistokimya Daha önce açıklandığı gibi İmmünohistokimya yapıldı. 1 <ol><li> Deparaffinization ve rehidrasyon rafa yerleştirin slaytlar ve aşağıdaki adımları uygulayın. 3x5 dakika (5 dakika boyunca 3 kez), 3x5 dakika süreyle% 100 etanol, 1x5 dakika boyunca% 95 etanol, 1x5 dakika boyunca% 70 etanol, ksilen, 3 dakika boyunca çalışan musluk suyu ile durulayın. </li><li> Bir cam behere distile su ile seyreltilmiş 1X sitrat tamponu (Thermo bilimsel-AP9003-500), ısıya bağlı epitopu alma daldırın slaytlar ile antigen retrieval. Sıcak bir tabak (emin bölümleri don &quot;t slayt düşmek olun) 15 dakika boyunca kaynatın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle soğuk çözüm. Slaytlar 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> Iç peroksit inhibisyonu, 15 dakika boyunca cam beher% 0,3 hidrojen peroksit (distile su Fisher Scientific-BP2633-500-seyreltilmiş), metanol slaytları (Fisher Scientific-A-452-4) bırakın. 3x5 dakika için 1X PBS içinde durulayın. </li><li> % 10 normal keçi serumu ile dokuların Kapak engelleme. Nemli bir kutuya aktarın ve slaytlar az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytlar, 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> 1X PBS ile sulandırılmış insan özel Kaspaz-3 (1:1,000, Ar-Ge sistemleri, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626): Primer antikor Bölüm ° C primer antikor ile aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 gece inkübe edildi. Ertesi gün 1X PBS 3x10 dakikalık slayt durulayın. </li><li> İkincil antikor reaksiyonu dokuların HRP etiketli ikincil antikor 2-3 damla (tahayyül sistemleri) ile kaplayın. Slaytlar nemli bir kutuya koyun ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 3x10 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> Algılama üreticinin protokolü takiben primer antikor tespiti için kromojen DAB kiti (Vektör laboratuarlar-SK-4100) geliştirin. </li><li> Sayaç boyama (hematoksilen ile slaytlar daldırın 10-15 s<html> saniye basılı tutun) emin don &quot;t taşması DAB sinyali olun. 3 dakika şebeke musluk suyu ile durulayın. </li><li> Dehidrasyon daldırın aşağıdaki sırayla slaytlar, Ksilen 3x5 dakika için 5 dakika, 5 dakika boyunca% 95 etanol, 3x5 dakika süreyle% 100 etanol,% 70 etanol. </li><li> Kapak permount montaj reaktifi (Fisher Scientific-SP-15-100) ile slaytlar kayma. </li><li> Görüntüler Olympus floresan mikroskobu (DP-72) .3.11) kullanarak alınmıştır. Tüm deneyler, özel etiketleme primer antikor olmadan negatif kontrol tarafından da teyit edildi. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Glioblastoma multiforme (GBM) cerrahi örneği toplandı. Temozolomide (TMZ) dahil olmak üzere önceden kemoterapi olmadan hastalarda ilk cerrahi uygulandı. Şekil-1a Gadolinyum geliştirme ile MRI T1 ağırlıklı görüntü, ameliyattan önce sağ frontal lob gelişmiş bir tümör saptandı. Ameliyat sonrası görüntü (Şekil-1b), cerrahi sonrası lezyonun subtotal çıkarılması doğruladı. Cerrahi dokuların klinik tanı amaçlı Patoloji Anabilim gönderildi ve kalan örnekleri onaylanan Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK), Ohio State Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından da protokol kapsamında doku ihale işlendi. Hematoksilen ve Eosin (H &amp; E) ile boyanarak nekroz varlığı pseudopallisading hücreleri, ve mikrovasküler proliferasyon (Şekil 1-c) gösterdi. Böylece, bu tümörlerin histopatolojik GBM olarak teşhis edildi. Notu, 48 saate kadar TMZ olmadan inkübasyon tümör eksplantlar GBM hücre mimarisini korumuştur. Aksine, 72 saat veya daha uzun kuluçka, bazı tümör hücreleri başlayan düşündüren örneklerinde yoğunlaşmış çekirdeklerin artan sayıda fark apoptozis tabi. Sonuç olarak, uzun inkübasyon sonrası tümör dokularında tümör hücrelerinin, tercihen nekrotik alanlar (veriler gösterilmemiştir) ve çevresinde gözlenmiştir kaybetti yamalı bölgeleri içeriyordu. Bu tümör eksplant örnekleri güvenilir ilaç etkinliğini test amaçlı kullanılabilir araştırmak amacıyla, TMZ tedavi etkisi test edilmiştir. Şekil-2 Bu çalışmada deneyler akışını temsil eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, TMZ intratümöral enjeksiyon, bu ilacın 2 sistemik yönetiminin daha malign glioma büyüme kontrolü daha güçlü etkiye sahip olduğunu belirtti. 16 saat inkübasyon sonrasında, bu eksplantlar parafin ve seri bölümleri boyama için hazırlanmıştır gömüldü. TMZ tedavi GBM dokuların İmmünohistokimya kontrol örnekleri ile karşılaştırılması Ki-67 pozitif tümör hücrelerinin önemli bir azalma göstermiştir. Buna karşılık, bir apoptozis marker, Kaspaz-3, ile immünohistokimya TMZ tedavi glioma numuneler ve kontrol numuneleri (Şekil-3) arasında anlamlı bir fark elde edemedim. TMZ ile tedavi etkisi daha fazla in vitro kültür veya flow sitometri ile birlikte bu eksplant tahlil birleştirerek karakterize edildi. Özellikle, kök hücre gibi tümör hücrelerinin (SCLTC) üzerindeki etkisini belirlemek için çalıştı. Bu nedenle, TMZ ile intratümöral tedaviyi takiben, küre oluşturan bu tümör eksplant tahlil ve flow sitometri yapıldı. TMZ muamele örnekleri tek tek tek hücrelerin içine ayrışmış ve bu tek hücre, serum serbest ortamda bFGF ve AGF ile desteklenen 96-kuyucuğu (1 mikrolitrelik hücre başına veya daha düşük) bir düşük yoğunluklu ekilirler. Kontrol grubunda ise 7 günlük inkübasyondan sonra, tümör eksplantlar tümör alanlarında oluşumu gözlenmiştir. Kürenin oluşumu SCLTC 3 4 bir özellik olduğu göz önüne alındığında, bir ilaç tedavisi ile tümör küre sayısında değişiklikler SCLTC üzerindeki etkisini gösterir. Benzer şekilde, bir hücre yüzey marker, CD133 ile ayrışmış tümör eksplant flow sitometri, SCLTC üzerindeki etkisini doğrulamak amacıyla yapılmıştır. GBM heterojen tümör hücrelerinde SCLTC seçici bir ilaç tedavisi ile ortadan kaldırılması ise, bir tedavi (veriler gösterilmemiştir) flow sitometri CD133 pozitif kesir azalma tespit tahmin olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Bir hasta GBM Şekil.1 Manyetik rezonans görüntüleri (MRG), operasyon öncesi Şekil-1a ve post-işlem Şekil-1b Temsilcisi rakamlar . Şekil-1c, taze GBM doku örneği H &amp; E boyama. Orijinal büyütme, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil. 2 blok kültür deney deneysel akışı Şekil-2a. Image taze cerrahi GBM patoloji bölümü alınan. Şekil-2b yardım cerrahi bıçak ile 10mm küçük parçalar halinde Diseksiyon tümör bloğu gösterir. Şekil-2c insülin şırınga kullanarak tümör blokları (TMZ) ilaç tedavi yöntemidir. e 3 &quot;/&gt; Şekil. 3 İmmünohistokimya aktif Kaspaz-3 ve Ki67 DMSO veya TMZ enjekte GBM doku blokları İmmünohistokimya. Hematoksilen nükleer boyanma için kullanılmıştır. Orijinal büyütme, 40X.

<ol>
	<li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li><li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats.">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li><li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors,+including+brain+tumor+stem+cells.">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li><li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma.">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis,+delineate+a+pattern+of+disease+progression,+and+resemble+stages+in+neurogenesis.">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation.">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li><li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines].">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li><li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions.">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li><li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells.">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li><li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab:+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice.">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li></ol>

Ilacın etkinliği ve klinik öncesi deneysel modeller hastalarda etkinliği arasında bir boşluk vardır. Daha spesifik olarak, beyin tümörü araştırma alanında, roman ve güvenilir yöntemler mevcut yöntemleri ile ilaç değerlendirme ve hastalarda etkinliği arasındaki mevcut boşluğu doldurarak yardımcı olacağını gereklidir. Bu çalışmada açıklanan tahlil, etkilenen hastaların deneysel veriler ve sonuç tutarsızlık doldurarak kolaylaştırmak için bir çözüm değilse, ek bir varlık. , In vitro hücre kültürleri Tercihen kültür koşulları ne olursa olsun belirli bir tümör hücre türleri genişletmek ve ek olarak sadece bir tümörün tamamını ICSI&#39;nin 5 temsil eden yapay hücre genişleme, genetik ve fenotipik dönüşüm gerçekleşir ve uzun vadeli hücre kültürleri ile kaçınılmaz . Malign glioma tedavi için en önemli engellerden biri, tek bir tümör içinde ve tümör örnekleri 6, 7 arasında iki tümör hücrelerinin, heterojen . Bu nedenle, selektif zenginleştirme, ne olursa olsun bir tür veya başka bir tümör hücreleri belirli bir nüfusun heterojen tümör hücreleri üzerinde herhangi bir kemoterapötik ajanların etkinliğini belirlemek için uygun bir araç olamaz. Beyin tümörlerinin bir ICSI&#39;nin türetilen 8 9 Herhangi bir hayvan modeli tümör hücrelerinin ICSI&#39;nin ilaç etkinliği üzerine ışık tutacak, ancak tümörün tamamını. Çeşitli sınırlamalar, diğer taraftan, hala bu tümör eksplant yöntemi olmaya devam etmektedir. Böyle bir sınırlama tedavi nispeten kısa bir süre. Malign tümör hücreleri değil, tüm tedaviler zamanla, kısa vadeli tümör hücre büyümesini ilk kontrolü uzun süreli hasta prognozu yansıtılacaktır olmayabilir eğer, çoğu direnç elde etmek için kabul olduğundan, yakın zamanda bir anti-rapor edildi anjiyogenik ajan, 10 bevacizumab. Böylece, uzun bir süre için dokuları korumak için bu eksplant tayini için protokol iyileştirilmesi, daha ileri araştırmalar gereklidir. Diğer bir soru, belirli bir tümör SCLTC üzerinde test edilen ilaç etkisi. SCLTC malign glioma, kuvvetli SCLTC garanti ortadan kaldırılması, yeni anti-kanser ilaçlar belirlenmesi için mevcut tedaviler oldukça dayanıklı olduğu göz önüne alındığında. Bu bağlamda, şu anda, neurosphere oluşturan assay (veriler gösterilmemiştir) gibi in vitro deneyler, sonraki bu eksplant tahlil birleştirmek için çalışırlar . Biz, bu kombine testleri aracılığıyla SCLTC bir ilaç adayı varsa, etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek almak için bekliyoruz. Son olarak, tümör örneklerinin küçük bloklar kullanılarak, geleneksel cerrahi örneklerinden tümör hücre hatları veya primer kültürlerinde olduğu gibi, tüm tümör hücre popülasyonlarının yansıtmıyor olabilir. Bu konular bir yana, vasküler niş de dahil olmak üzere tümör stroma, koruyarak, tümör hücreleri için çevresel faktörler karakterize yararlı olur. Bu nedenle, bu testte daha fizyolojik ilgili bir koşul altında herhangi bir tedavi stratejileri değerlendirmek için potansiyeli olabilir. Burada, GBM cerrahi örneklerin eksplantlar ilaç etkinlik testleri için bir test kurdu. Aslında, test edilen cerrahi numuneler, TMZ direkt enjeksiyon GBM örneklerin çoğalması azalttığı bulundu. Bu doku eksplant yöntemi teorik diğer katı kanser uygulanabilir ve umarım bize kanserler için klinik çalışmalarda bir başarısızlık kaçınarak yardımcı olacak bir hastanın tümör ilaç etkinliği belirlemek için varlık sağlar.

<table border="1"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum, Nitelikli, Isı-İnaktive </td><td> Gibco </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Sıvı 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar Saflaştırılmış, Granül </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> Boyama DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoksilen </td><td> Richalrd allan BİLİM </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> % 10 w / v formalin Kaspaz-3 </td><td> Ricca kimyasal şirketi </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Kaspaz-3 </td><td> Ar-Ge sistemleri </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Sistem anti-fare imgeleyin </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Imgeleyin sistem anti-tavşan </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vektör Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tablo 1: Malzeme. <table border="1"><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 6 plaka </td><td> Greiner-biyolojik bir </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Petri kabı </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serolojik pipet </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Filtre ipuçları </td><td> ABD bilimsel </td><td></td></tr><tr><td> 500 mikron polyester mesh Netwell insert </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD 10 ml şırınga </td><td> BD biyoloji </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Hipodermik iğne Alüminyum Hub. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj tüpleri </td><td> BASIX </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> İnce borular </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Cerrahi Bıçak paslanmaz çelik </td><td> Tüy </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> İnsülin Şırınga </td><td> Rahatlık noktası </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50ml düz üst vidalı kapaklı tüp </td><td> BASIX </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td> TriTech </td><td></td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Olympus </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Forsepsle </td><td> Fisher Bilim </td><td></td></tr></table> Tablo 2. Ekipman.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

Malign glioma için mevcut tedaviler, sadece palyatif bir etkiye sahip. Terapötik gelişmesi için, bir engel mevcut ilaç etkinliği testleri ve hasta üzerinde etkinliği tespit etkinlik tutarsızlık. Böylece, ilaç etkinliğini değerlendirmek için yeni ve güvenilir yöntemleri klinik öncesi faz garantilidir. Tümör doku, hücre hatları da dahil olmak üzere in vitro kültüründe hücre kültürü yapay bir ortam neden olduğu kanser hücrelerinin önemli fenotipik, genetik ve epigenetik değişiklikler, in situ orijinal tümörlerin biyolojisi yansıtmıyor olabilir. Xenograftlarında bağışık yetmezliği olan farelere modelleri de, yani bağışıklık sistemi eksikliği sınırlamaları vardır ve mikroçevresinin genetik ve epigenetik farklılıklar interspecies. Burada, tedavi etkilerini değerlendirmek için undissociated tümör blok olarak malign glioma cerrahi örnekler kullanarak yeni bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntemi doğrulamak için, ilk satır mevcut kemoterapötik ajan, temozolomide (TMZ), ile veri açıklanmıştır. Biz, deneyler için malign glioma taze kaldırıldı cerrahi örnek kullanılır. Kuluçka ve cerrahi örneklerin analizi ile takip TMZ veya diğer ilaç adayları, intratümöral enjeksiyon yapıldı. Burada, yeni anti-kanser tedavilerinin etkinliğini belirlemek için bir platform olarak biz, en azından bazı mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek ve mevcut deneysel arasındaki mevcut boşluğu doldurmak için mümkün olabilir, böylece tümör dokusu eksplant yöntemi kurmak için çalıştı veri ve gerçek bir hastanın tümör üzerindeki etkinliği. Bu yöntem, katı kanser tedavisi için yeni kemoterapötik ajanlar tespit hızlandırmak için potansiyeli olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens at JoVE.com

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Burada, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri, olarak adlandırılan &quot;tümör eksplant yöntemi&quot; ile ilaç etkinliğini test etmek için bir yöntem kurmuştur. Bu yöntemde, katı tümörlerin mikroçevresinin bozmadan ilaç etkinliğini değerlendirmek. Bu yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, ilk basamak kemoterapötik ajan, temozolomide tedavi glioma örnek temsili verileri açıklanmaktadır.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Görüntüleme.  The Ohio State University Medical Center. Burada, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri, olarak adlandırılan "tümör eksplant yöntemi" ile ilaç etkinliğini test etmek için bir yöntem kurmuştur. Bu yöntemde, katı tümörlerin mikroçevresinin bozmadan ilaç etkinliğini değerlendirmek. Bu yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, ilk basamak kemoterapötik ajan, temozolomide tedavi glioma örnek temsili verileri açıklanmaktadır.

Video: Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Tıp

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Ameliyat sonrası Immunosupressjon&#39;un ve Mekanizmaları keşfedin ve Roman Perioperatif İmmünoterapiler Değerlendirmesinde Cerrahi Stres Fare Tümör Modeli

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

Arteriovenöz Fistül Yetersizliğinin A Novel Fare Modeli: Detay Cerrahi Prosedür

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.