Protokolümüz diğer moleküler analiz yöntemleri ile uyumludur ve ilaçların in-tact doku dilimlerinin canlılığını nasıl etkilediğinin ve orta iş bölümü taramasının performansını nasıl etkilediğinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, tüm doku diliminin canlılığını çok az işlem öncesi veya sonrası ile gerçek zamanlı olarak ölçebilmemizdir. Bu teknik, doğrudan hasta tümör doku örneklerinden elde edilen ilaç adayları veya doku dilimlerini test ederek klinik öncesi ilaç gelişimini ve onkolojiyi hızlandırır.
Gerçek zamanlı doku canlılığı değerlendirme yöntemimiz oldukça yönlüdür ve kanser biyolojisi, nöroloji ve gelişimbiyolojisi çalışmalarına uygulanabilir. In-tact canlı doku dilimleri hazırlanması prosedürün başarısı için anahtardır. Orta bileşimdeki Vibratom ayarları doku tipine ve sıkılığına göre ayarlanmalıdır.
Tümör doku dilimi edinimi gününde, aliquot 250 mikrolitre doku dilimi kültür orta iyi başına 24 iyi plaka ve her kuyu içine bir doku kültürü eklemek yerleştirin. Sonra kullanıma kadar 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit ile nemlendirilmiş bir kuvöz plaka yerleştirin. Tümör dokusu parçaları elde etmek için, 10 santimetre lik bir kültür plakası buz soğuk HBSS tümör dokusu batırın ve yarısında doku kesmek için bir neşter kullanın.
Tümör dokusunun silindir elde etmek ve düz bir yüzey oluşturmak için her silindirin bir ucunu kırpmak için altı milimetrelik biyopsi yumruk kullanın. Doku parçalarını taze, buz gibi HBSS'ye yerleştirin ve vibratomu açın. Tüm ekipmanları %yetmiş etanol ile dezenfekte edin ve Vibratome buz banyosunun ortasına akrilik cam kapakla kaplı Vibratome tampon tepsisini yerleştirin.
Banyoya buz ekleyin, tampon tepsiyi soğuk HBSS ile doldurun. Bıçak tutucuya bir jilet yükleyin ve biyopsi delikli tümör örneğini dikkatle seçmek için dişli forceps kullanın. Numune plakaüzerine tıbbi sınıf siyanoakrilat tutkal bir damla ekleyin.
Herhangi bir aşırı tampon kaldırmak ve dik bir kararlı pozisyonda damla doku silindiri monte etmek için tüy bırakmayan kağıt havlu bir parça üzerine doku Dab. Hava kuruduktan 2-3 dakika sonra, plakayı tampon tepsiye yerleştirin ve doku tampona tamamen batırılana kadar tepsiye ek HBSS ekleyin. Daha sonra buz tepsisi ve tampon tepsi montaj Vibratome üzerine yerleştirerek ve kolu kilitleyerek Vibratome monte.
Vibratom kesme kalınlığını 250 mikrometreye, genliği üç milimetreye, dilimleme hızını saniyede 0,01 ila 0,25 milimetreye ve bıçak açısını 15 ila 21 dereceye ayarlayın. Bıçağın başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın ve sahnenin yüksekliğini ayarlayın. Dokular düzgün bir şekilde kesilene kadar birkaç döngü için dilimleri kesmek için cihazı sürekli modda çalıştırın.
Dilimleri ve hbss küçük bir miktar daha önce hazırlanmış 24 iyi plaka her kuyuda tek bir hücre kültürü ekler içine aktarmak için iki ayaklı geniş bir uç transferi kullanın ve kuyulardan herhangi bir fazla arabellek kaldırmak için iki ayaklı ince bir ipucu transferi kullanın. Numunenin sonuna ulaşıldığında, yeni bir doku parçası yerleştirin ve yeterli numune alınıncaya kadar ek dilimler alın. Sonra 24 ila 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka doku dilimleri kültür.
Doku dilimlerinin canlılığını ölçmek için, üreticinin talimatlarına göre taze doku dilimi kültür ortamında bir ila bin seyreltmede hem luciferase hem de secde içeren bir parlaklık bazlı canlılık ölçüm reaktifi hazırlayın ve 24 kuyu plakasının her kuyusundaki orta yı karışımla değiştirin. Her doku dilimi üzerine enzim substrat karışımı 50 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit gecede nazik ajitasyon ile nemli bir kuvöz içinde bir orbital shaker üzerine plaka yerleştirin. Ertesi sabah, uygun ayarları kullanarak bir mikroplaka okuyucu üzerinde her kuyuda parlaklık sinyali ölçün.
Doku dilimlerinin temel canlılığını belirledikten sonra, 10x stok çözeltisi elde etmek ve her 10x ilaç çözeltisini her doku diliminin altındaki kültür ortamına eklemek için doku dilimi kültür ortamına ilgi çeken ilaçları çözün. Her kuyunun altından her bir doku dilimi üzerine ilaç takviyeli orta 50 mikrolitre aktarın ve bir gecede orbital shaker dilimleri dönmek. Ertesi sabah, kültür plakasını titremeden alt kültür kuvöze aktarın ve mikroplaka okuyucudaki her doku örneğindeki ışıltılı yoğunluğu uygun deneysel zaman noktalarında ölçün.
Tedavi edilen tümör dokularının her zaman noktasındaki canlılığı belirtildiği gibi denklem kullanılarak hesaplanabilir. Fare meme kanseri tümör örneğinden hazırlanan doku dilimlerinin canlılığı, ara sıra orta değişimlerle en az 21 gün süreyle muhafaza edilebilir. Dört gün boyunca multikinaz inhibitörü ile tedavi dimetil sülfoksit ile tedavi tümör dokuları kontrol göre 100 kat lüminesans sinyal yoğunluğunu azaltır.
Aynı inhibitörün yarısı konsantrasyonu ile tedavi ilk gün gibi erken olarak lüminesans azalır ve sonraki her ölçülen zaman noktası için düşük kalan, dördüncü gün en düşük seviyeye ulaşır. Buna karşılık, kontrollü tümör doku grubunun Parlak yoğunluğu altı günlük kültür boyunca istikrarlı kalır. Buna ek olarak, dört gün boyunca inhibitörü seri dozlarda fare meme kanseri tümör dilimlerinin tedavisi ilacın yarım maksimal etkili konsantrasyonda dilim canlılık doza bağlı değişiklikleri göstermektedir.
Standart bir kemoterapötik ilaç olan doksorubisin ile tedavi edilen hasta türetilmiş ksenogreftler de uygulanabilirlikte doza bağlı değişiklikler sergiler. Ayrıca, tek bir toplu hasta kaynaklı ksenogreftten hazırlanan doku dilimleri üzerinde trilycate olarak on yedi preklinik ve klinik onaylı ilaçların test edilmesi, doğal tümör mikroortamında tümör dilimleriüzerinde orta üretim ilaç taraması yapIlebildiği kavramının kanıtıdır. Tümör doku örnekleri hazırlanırken, doku zarar önlemek için doku dilimleri ile temas en aza indirmek için dikkat edin.
Yöntemimiz dokulardan mekansal ve tek hücreli bilgi elde etmek için IHC, akış sitometrisi veya tek hücre dizilimi gibi diğer yaklaşımlarla biraraya gelebilir. Tekniğimiz zaman içinde fizyolojik koşullar altında çeşitli dozlarda ilgi birden fazla ilaçların etkilerinin test sağlar. Bilinmeyen patojen durumu olan tümörlerden doku dilimleri hazırlarken, tüm işlemleri biyogüvenlik kabininde uyguladığınızdan emin olun.
