Bu çalışmalar Alternatif Araştırma ve Geliştirme Vakfı (107.588), Ulusal Sağlık Enstitüsü (1U54CA136465-04S1) ve Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Programı (201B-0141) hibe, kısmen finanse edildi. Biz Dr teşekkür ederim. Cömert bağış için Andrew Wilber ve R. Scott McIvor onların <pkt2 lubig=""> transponson ve pKa / hUbiC-SB11 transposaz plazmidler. Biz minnetle John Tamaresis, Ph.D. kabul istatistiksel yöntemler tavsiye için, Timothy Brown flow sitometri gerçekleştirmek için, göçler tahliller tavsiye için Georgette Henrich, Nancy Bellagamba için THR örneklerinin koleksiyonu kolaylaştırılması. </pkt2>

Femur başları Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli THR ameliyatı geçiren hastaların toplanmıştır. Tüm dokular Stanford Üniversitesi Araştırma Uyum Ofisi düzenlemelerine uygun olarak de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır. 1. Bir Meme Kanseri Hücre Hattı (ler) seçilmesi <ol><li> Elde edilir ya da bir lusiferaz-GFP raportör yapısı ile, istenen göğüs kanseri hücre çizgisi (ler) transfekte. Aşağıdaki deneyler, uyku güzellik transpozon plazmid pKT2 / LuBiG ile transfeksiyon ile MDA-MB-231 ve MCF-7 göğüs kanseri hücre çizgileri ateşböceği lusiferaz dengeli bir şekilde ifadesi için tasarlanmış (Fluc) ve gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) kullanılarak gerçekleştirilmiştir transposaz plazmit pK / hUbiC-SB11 45,46. Not: Transfekte edilmiş hücre çizgileri MDA-MB-231-Fluc-EGFP ve MCF-7-Fluc EGFP olarak adlandırılır. </li></ol> 2. Ayırma Doku FFemoral Heads ragments <ol><li> THR ameliyatları sonrası, fizyolojik tuzlu su ile dolu bir steril kap içinde atılır femur başı toplar. Laboratuvara numune aktarın ve cerrahi 1-3 saat içinde işleme. Not: işlemede bir gecikme varsa, 4 ° C&#39;de örneği yerleştirin. </li><li> Deneyin her türü için aşağıda belirtilen şekilde steril eldiven, cerrahi rongeur, forseps, beher% 70 izopropanol ile aletleri, ve doku kültürü gemiler durulama: laminer akış doku kültürü kaputu emici mat aşağıdaki öğeleri yerleştirerek bir çalışma alanı hazırlayın . </li><li> Bir steril cerrahi eldiven giyen, bir yandan yuvarlak femur başını tutun femur maruz üst şaft istenen boyutta (~ 2-5 mm) trabeküler kemik parçaları ayıklamak için, diğer elinde rongeur kullanmak için. Kültür kabı içine kemik parçaları transfer (örneğin, 6-, 12, ya da doku kültürü plakası, veya geçiş bölmesi 24-çukurlu), proliferasyon türüne bağlı olarak, sütunonization veya göç deneyi, adım 3, 4 veya 5&#39;te tarif edildiği gibi. NOT: Her özel proliferasyon, kolonizasyon veya göç deneyi için ilk adımları tamamlandıktan sonra yukarıda tarif edildiği gibi kemik dokusu parçaları hasat edilmesi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, parçalar, boyut aralığında değişecektir. Fragmanları önce ya da standart amacıyla deneyler sonra tartılır edilebilir. </li></ol> Kemik Fragments bitişiğinde 3. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri BLI kullanma Meme Hücre Proliferasyonunu Tedbir <ol><li> Önceki deneyden 2 x 10 5 meme kanseri hücre / 50 ul ihtiva eden bir süspansiyon hazırlamak ve kültürde kemik parçaları hareketsiz tutmak için kemik mumu fişleri hazırlayın. 3 parçaya P200 mikropipet ucu kesin ve kemik mumu küçük (~ 35 mg) adet kesmek için bir &quot;çerez kesici&quot; bir şekilde büyük parçanın dar ucunu kullanın. Petri kabı içine kemik balmumu fişlerini çıkarmak için küçük parçanın geniş ucunu kullanındepolama için. </li><li> Her kuyunun 00:00 pozisyonunda kemik balmumu bir parça koyun ve yavaşça bir steril eldivenli işaret parmağı ile bastırın. </li><li> Pipet, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğun merkezinde, DMEM,% 10 FBS + Pen-strep 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 50 ul. (Alternatif olarak, arzu edildiği takdirde dağınık bir biçimde tohum hücreleri.) Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> Her deney kuyu için kemik mumu 1 parça üzerine 1 kemik parçasını yerleştirin ve sabitlemek için ronjur ile hafif basınç uygulayın. Alt üç kuyu sadece kontroller olarak kemik mumu ihtiva ederken, belirli bir THR örnekten şekilde 3 kemik parçaları ilk üç kuyular yerleştirilir üç nüsha olarak deneyleri. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, yumuşak ve yavaş meme hücreleri veya kemik parçaları yerinden ayrılmasını önlemek üzere, her bir yan DMEM% 10 FBS, 5 ml sağlar. 37 plaka koyun76, 20-24 saat süre ile C doku kültürü kuluçka makinesine kondu. </li><li> Biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek için (BLI) inkübatör plaka çıkarın ve her bir oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için) lusiferin substratı ilave edin. Görüntü aşağıdaki parametreleri kullanarak bir IVIS Görüntüleme Platformu&#39;nda hemen plaka: 1 f-stop, küçük binning, 1 sn pozlama süresi, seviye D sinyal her yoğunluğunu sıra ortalama parlaklık (fotonlar / saniye / kare santimetre / Tedbir steradyan). </li><li> Tüm deney ve kontrol kuyuları için ortalama parlaklık ölçmek için İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Bir Excel sayfası İhracat ortalama parlaklık değerleri istatistik gerçekleştirmek ve grafikler oluşturmak için. </li></ol> Kemik Fragments üstüne Doğrudan Tohumlu 4. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri Kolonizasyon ve Hücre sayısı Eğitim için <ol><li> 24-çukurlu doku kültürü plakasının boş kuyu doğrudan kemik parçaları yerleştirmek (1 fragmanı / çukur) için forseps kullanır. </li><li> Ölmekdoğrudan her bir kemik parçasından en 1 x 03-06 Ekim meme kanseri hücreleri içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık ette. Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Yavaşça parçası tamamen ortam içine, her bir sıra bu yan içine 1-2 mi DMEM,% 10 FBS ekleyin. 20-24 saat süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her bir çukura 1 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir taze 24-yuvalı plaka her bir kemik dokusu fragmanı aktarmak için forseps kullanır. BLI gerçekleştirmek için, adımları 3,6-3,7 yukarıdaki izleyin. Buna ek olarak, parçalar, bir floresans mikroskobu kullanılarak izlenebilir ya da aşama 6&#39;da tarif edildiği gibi, meme kanseri hücresi sayısı ve özelliklerinin analizi için iliği popülasyonu elde etmek için yıkanır olabilir. </li><li> BL, pipet floresan bifosfonat etiketleme çözümü 5 ul (ön aşağıdaki floresan mikroskobu ile kalitatif değerlendirme için sağlam parçaları hazırlamak içinKemik parçalarının mineralize spikülleri etiketlemek için, her bir oyuğa) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre düşüktü. Bir 24 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka inkübe edin. </li><li> Floresan bifosfonat etiketleme çözeltisi içinde kültür 24 saat sonra, görüntü GFP (485 nm) ve bisfosfonat etiketin (680 nm) için yapılandırılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak fenol kırmızısı içermeyen ortam ve görünümü içeren bir doku kültür plakalarına fragmanları aktarmak için forseps kullanır. </li></ol> 5. Kemik Doku Fragments ve kültürlü Kemik Parçası süpematantlan için Meme Kanseri Hücreleri Göç Ölçme <ol><li> Kemik doku kültürü süpernatant doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 süpernatantlar oluşturmak için kullanılır. Her deney için, göç kemik süpernatanlan vs kontrol ortamını yalnızca içeren üç kuyu içeren üç kuyu boyunca karşılaştırılır. <ol><li> Kemik tis oluşturunoyuk başına 2.2 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir 12 gözlü bir levhanın gözleri içine kemik parçalarının yerleştirilmesi ile süpernatantlar dava. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültürü. 24 saat sonra ortam çekin ve 2.2 ml taze DMEM,% 10 FBS ile değiştirin. DMEM-10% FBS aynı şekilde içeren sağlıgı kontrol kuyuları. NOT: düşük operasyon sonucu meydana gelen doku travmasının yanıt olarak salgılanan faktörler kaldırmak için 24 saat sonra değiştirildi. Kemik dokusu üzerinde yüzer durumda kısımlar oluşturulacak için sadece meme kanseri hücre göçü FBS katkıları için kontrol edilmesi için dahil edilir FBS içeren ortam içeren ortam, kuyu FBS ihtiva eden. </li><li> 48 saat sonra, bir alıcı plakanın oyukları içinde her bir süpernatan / kontrol ortamı ve pipet 0.9 ml toplar. ekler sonra bu kuyulara alınacaktır. Uçlar, tohumlama sırasında doku kültürü kuluçka makinesi içinde alıcı plaka inkübe edin. Not: Kalan supernatant (~ buharlaştırmadan sonra 1 mi) secretome fiili analizi için toplanabilirrs eğer 44 istenilen. </li><li> Transwell tohum için, standart bir boş 24 oyuklu doku kültürü plakası içine yerleştirin. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, her bir ek üst, iç zar yüzeyi üzerine DMEM% 10 FBS içinde, 1 x 10 5 meme kanseri hücreleri ihtiva eden Pipet 350 ul hücre süspansiyonu. Eki teşvik etmek için 45 dakika süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde tohumlanır ekler ihtiva eden 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> Hücreler ekler taşıyabilir sonra, imalatçının talimatlarına göre alıcı plaka ekler aktarmak için forseps kullanır. Açı eklemek zarında ve iyi yüzer madde alıcı arasındaki kabarcık oluşumunu önlemek için de alıcı içine yerleştirerek her ekleme. 37 ° C&#39;lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 20 saat ekler ile alıcı plaka inkübe edin. NOT: insert membran ve iyi supernatan alıcı arasındaki kabarcıklar için alıcı plakasının alt tarafını kontrol edint. Kabarcıklar görülebilir iseniz, belirli ekler kaldırmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olana kadar iyice alıcı içine tekrar yerleştirin. </li><li> 20 saat kullanım forseps sonra alıcı plaka ekler kaldırmak için. Adımda prosedürler kullanılarak 3.6-3.7 görüntü içine göç ve alıcı plaka kuyuların dibine bağlı olan hücreleri BLI gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> Kemik doku parçaları doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 ayrı uçlar yerleştirilir ve 3 cam tanesi, kontroller olarak, 3 ayrı uçlar yerleştirilir. <ol><li> Her kuyuya 0.9 ml DMEM-10% FBS pipetleme alıcı plaka hazırlayın. Ekler hazırlanırken doku kültürü kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Ekler tohum, bir kapağı olan plastik bir tüp mikrofuge&#39;ye kutusunun yüzeyinde onları ters çevirin. 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri d içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık Pipetirectly (ters ekler üzerinde yukarı baktığından) Her ekleme zarının dış, alt yüzeye. Kapaklı mikrofuge&#39;ye tüp kutusu açık kırık Kapak ve hücre eki teşvik etmek 45 dakika için 37 ° C doku inkübatör aktarın. </li><li> Doku kültürü kaputu mikrofuge&#39;ye tüp kutusunu aktarın ve sağ tarafı yukarı numaralı seribaşı ekler açmak ve alıcı plaka kuyu içine aktarmak için forseps kullanabilir. Her ekleme kabına Pipet 0.450 ml DMEM-% 10 FBS. Forseps kullanarak, her hazırlanmış ekleme fincan içine bir kemik dokusu fragmanı (~ 3 mm) aktarın. İsteğe bağlı olarak, ek bir kuyu cam boncuklar negatif kontrol olarak kullanılır. 20 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun. </li><li> Migrasyonun ölçülmesi için, oyuk başına 1 mi DMEM,% 10 FBS ihtiva eden bir standart 24 oyuklu doku kültürü plakası hazırlanır. Inkübatör alıcı plakasını çıkarın ve standart plaka ayrı kuyu içine her birinden eklemek kemik parçaları ve boncuk aktarmak için forseps kullanabilir. Lüsiferin eklealt-tabaka her oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için) ve adım 3.6-3.7 prosedürleri kullanarak BLI gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ek öncesi ve sonrası deneysel Analizleri <ol><li> Kızarmış iliği analizi. <ol><li> 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden içine bir kemik parçası aktarın. Kuvvetli bir şekilde konik bir tüp içinde kemik iliği hücreleri, bir süspansiyon elde etmek için, 10 ml PBS ile bir parçasını temizlemek için bir 25 G iğne ile 10 ml&#39;lik bir şırınga kullanın. Santrifüj hücre süspansiyonu 300 xg&#39;de 3 dakika, 21 ° C, süpernatan aspire ve PBS içinde pelet hücreleri ya da akış sitometrisi için istenen diğer bir çözüm yeniden süspanse edin. Not: Tekrar süspansiyona, miktarlar santrifüj ve uygulamadan sonra hücre peleti boyutuna bağlı olarak değişir. </li><li> Canlılık analizi için PBS ~ 75-300 ul hacim ticari olarak temin edilebilen fluorescenc kullanılarak uygun olan ve bu süspansiyonlar analiz edilebilire göre canlılığı testleri, imalatçının talimatlarına uygun olarak, geleneksel bir hemasitometre pipetlenir ve bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak sayılmıştır. </li><li> Akış sitometrik analizi için ya da GFP-pozitif göğüs kanseri hücrelerinin saptanması göre ayrılması,% 2 FBS, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde hücre topağı tekrar süspansiyon ve 10 konsantrasyon 1 x 10 6 hücre / ml mM HEPES, öyle ki. </li></ol></li><li> H &amp; E Boyama ve İmmünhistokimya. <ol><li> Hematoksilin ve eosin (H &amp; E) boyama ve / veya immünohistokimya için fragmanları işlemek için, bir dizi 2 kalemle etiketlenmiş plastik kasetlerinde fragmanları yerleştirin ve 24 saat süre ile,% 10 tamponlu formalin ile dolu bir kap içinde daldırın. </li><li> Parafin gömme için proses dokular, kesit ve her fragmanında mineralli spikülleri hesabını bir Dekalsifikasyon aşamasını içerir rutin protokoller kullanılarak boyanan. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra ark., Daha önce yüksek kaliteli dokuları ortaya ve metastatik süreci 47 çalışma, insan kemik örneklerinin kullanımını doğrularken, otopsi sırasında hasat metastatik prostat kanseri hastalarından alınan postmortem toplama ve kemik örneklerinin analizi tarif var. Burada, toplama, işleme ve meme hücre göçü, kolonizasyon ve çoğalmasını incelemek için kısa vadeli bir ko-kültür sisteminde THR cerrahi sonrası atılır femur başları elde edilen insan kemik doku parçala...

tümör mikro yaygın meme kanseri ilerlemesi ve metastatik sırasında kanser hücresi davranış kritik belirleyicisi olarak kabul edilmektedir 1-3 yayıldı. Burada sunulan yöntemin amacı, insan kemik dokusundan, göğüs kanseri metastazı 4-6 en sık site mikro-içinde, meme kanseri hücrelerinin çalışma kolaylaştırmaktır. Kemik metastatik ilerlemesi 10,11 sorumlu hücreler ve salgılanan faktörler barındıran her ikisi de mineralize ve iliği bölümlerinin 7-9 oluşur. Yaygın in vivo fare modellerinde kullanılan rağmen metastatik sürecinin 12-15 sistemik çalışmalarını kolaylaştırmak, iskelet içinde hücre etkileşimleri gözlem ve doğrudan pertürbasyon için kolayca erişilebilir değildir. Eğitim ve fare kemik dokuları ve fare kemik iliği hücreleri kültür Model sistemleri daha iyi erişim sağlamak ve meme kanseri hücre m altında yatan birçok karışma ilgili anlayışlar ve mekanizmalar vermiştirMurin iskelet 16-22 etastasis. Ancak, çalışmalar kemik dokusu 23,24 için osteotropism ve türe özgü desenleri olabileceğini düşündürmektedir. Bu modeller, kemik muhtemel belirleyiciler hepsi doğal türe özgü kemik dokusu özelliklerindeki farklılıklardan, bağışıklık-eksikli fareler 11 değiştirilmiş kemik iliği popülasyonlardan elde edilen farklar, ve / veya deneylerinde kullanılan fareler nispeten genç yaş, yansıtabilir mikroçevresinin. In vitro olarak, tipik haliyle, kemik iliği türevli osteoblast veya tek katmanlar olarak kültür stromal hücreler olarak ya da genetik mühendisliği 3 boyutlu model sistemlerinde 25-35 içinde belirli kemik hücre tipleri üzerinde odaklanmıştır insan kemik eş kültürlerinde meme kanseri hücreleri incelemek için yaklaşımlar. 2-boyutlu hücre kültürü modelleri, in vitro dayanak oluşan kanser araştırmaları için yaklaşımlar var olsa da, uzun hücre davranışı temelde m değiştirilmiş olduğu kabul edilmiştirkültür sistemleri 18,36,37 onolayer. Bu matris ve kolajen gibi doğal malzemelerden oluşan iskele tabanlı modelleri dahil olmak üzere 3-boyutlu bir oturma dokuların karmaşıklığı taklit eden, işlenmiş mikroçevrelerde gelişmesine yol açmıştır ya da sentetik polimerler, doku gibi mikroçevrelerde oluşturmak için özel hücre tipleri ile tohumlandı 36-41. Engineered yaklaşımlar da kontrol ve mikroçevresinin 18,19,41-43 hormonal ortam çalışma biyoreaktör platformlarının kullanımı dahil ettik. Biomimetik modelleri ve biyoreaktörler kontrollü bir ortamda kompleks doku çevresinde birçok unsuru sağlar ve başarılı kemik 18,19,35,42,43 meme kanseri metastazı çalışma önceden uygulanmış olsa da, işlenmiş model sistemler, genel olarak yapılmasına olanak vermemektedir doğal kemik ortamında mevcut hücre tipleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin tam spektrum. Yakın zamana kadar, göğüs kanseriHücreler, insan kemik dokularının yerli, bozulmamış, 3-boyutlu mikroçevresinin içinde çalışılmamıştır. Biz son zamanlarda (THR) ameliyatı 44 örneklerinde total kalça protezi izole insan kemik doku parçaları kullanarak bir ko-kültür modelinin gelişmesini bildirdi. Bu örnekler hem kısa vadeli kültüründe mikro-metastazı altında yatan mekanizmaları incelemek için gerekli mineralizasyon ve kemik iliği bölmeleri liman. Önceki çalışmada, kemik parçaları 44 ile (MDA-MB-231-Fluc) ko-kültür lusiferaz sentezleyen meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını izlemek için biyoışıldama görüntüleme (BLI) kullanılarak kanıtını prensip oluşturmuştur. Burada insan kemik dokusu eksplantlarındaki yerli mikroçevresinin kapsamında meme kanseri hücre çoğalmasını, kolonizasyonu ve göç çalışmak için deneysel protokolleri ayrıntılı bulundular. İlk olarak meme ölçmek için kemik parçaları bitişik eş-kültürleme göğüs kanseri hücreleri için bir protokol mevcutBLI kullanarak hücre çoğalması. Bu bölümde, meme hücresi süspansiyonları, kemik mumu parçaları ile hareketsiz hale kemik parçaları, bitişik 6 oyuklu plakalar içinde hücre noktalar olarak tohumlanır. Kontrol kuyuları, kemik mumu, ama hiçbir kemik fragmanı içerirler. Hücre noktalar eklemek sonra, orta eklenmiş ve plaka BLI ile ölçülür biyolüminesens sinyal yoğunluğu (hücre sayısı ile ilişkili) sonra 24 saat için kültüre edilir. Bir sonraki adımda, kolonizasyonun ve çoğalmanın çalışma kemik parçalarının doğrudan ekilmiş ko-kültür göğüs kanseri hücreleri için yöntemler sunar. İşte meme hücre süspansiyonları kolonizasyonu ve hücre sayısını izlemek için zamanla BL ve floresan mikroskobu ile kültüründe izlenir kemik doku parçaları, doğrudan pipetlenir. Bu yöntemde, kemik iliği bölme akış sitometrisi ile kolonize göğüs kanseri hücrelerinin analizi için her zaman noktasında kemik parçaları temizlendi, ya da ilik canlılığı deneyleri edilebilir. Buna ek olarak, elimizdeki deMeme kanseri hücre göçü ölçmek için kâtip, iki farklı yaklaşım. İlk yöntemde adım kemik dokusu kültür yüzer doğru göç ölçülmesi için özetlenmiştir. Transwell iç üst yüzeyleri bir 8 um gözenek büyüklüğüne sahip membranlar eklemek üzerine (Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi), bu protokolde, göğüs kanseri hücreleri tohumlanır. Ekler daha sonra kemik dokusu süpernatan ya da kontrol ortamı içeren oyuklara sahip bir alıcı plaka içerisine yerleştirilmiştir. 20 saatlik bir bekletme sürecinden boyunca, meme kanseri hücrelerinin az sayıda aşağı bunlar BLI tespiti için eklemek alt doku kültür kuyu içine sokma zarları içinden yer değiştirmektedir. İkinci geçiş yöntemde meme kanseri hücreleri Transwell uç zarların alt dış yüzeyleri üzerine ekilir. Kemik dokusu parçaları uç bardak içine yerleştirilir ve göğüs kanseri hücreleri (Şekil 1 B &#39;de gösterildiği gibi), kemik parçaları kolonize zarlanndan taşınmalarısonra BLI kullanarak görüntülü.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Kemik meme kanseri metastazı en sık sitedir. Yaygın mikroçevresinin etkiler kanser hücresi davranışı kabul edilmesine rağmen, çok az insan kemik dokusunun doğal mikroçevresinin içinde meme kanseri hücre özellikleri ve davranışları hakkında bilinmektedir. Biz, izlemek ölçmek ve mikro-içinde insan meme kanseri hücrelerini modüle yaklaşımlar geliştirdik Total kalça protezi ameliyatları takip atılır femur başları izole kültür, insan kemik doku parçaları. Meme kanseri hücrelerini lusiferaz için tasarlanmış ve yeşil floresan protein (EGFP) ifade gelişmiş kullanarak, tekrarlanabilir sonra meme hücreleri floresan mikroskopi kullanılarak kemik parçaları içinde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak göç ve çoğalması desenleri (BLI), parça hücre etkileşimleri ölçmek ve değerlendirmek mümkün Akış sitometrri ile kolonizasyon. Bu modelin temel avantajları şunlardır: 1) bir yerli, mimari sağlam doku microeilgili insan hücre tiplerini içerir ve hızlı nicel ve nitel izleme ve meme ve kemik hücre özellikleri, davranışları ve etkileşimleri pertürbasyon kolaylaştırır mikroçevresinin, 2) doğrudan erişim bütünlüklü. Birincil sınırlama, şu anda, kısa vadeli kültürüne çalışmanın pencere sınırlandırmaktadır doku parçalarının, sonlu canlılık olduğunu. Model sisteminin uygulamaları metastatik niş içinde meme kanseri ve diğer kemik arayan maligniteler temel biyoloji okuyan ve etkili bir kemik dokularında meme kanseri hücrelerini hedef tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bulunmaktadır.

Femoral Heads Doku Fragments Yalıtımlı Femur başları erkek ve Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli total kalça protezi ameliyatı geçiren kadın hastalarda (yaş 44-90 yıl) eşit sayıda toplanmıştır. Her atılır femur başı mineralli spikülleri ve kemik iliği oluşan trabeküler kemik dokusu barındıran üst femur, küçük bir bölümünü içerir. Bu doku küçük parçalar elde etmek için cerrahi bir rongeur kullanılarak mil <str...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine.  Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Tıp

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...