Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, Uppsala Üniversitesi ve Fredrik ve Ingrid Thurings Vakfı tarafından finanse edildi. ZJ EXODIAB ve Svenska Sällskapet för Medicinsk Forskning bir doktora sonrası dostluk düzenledi. Frank Lee Biz tekniği yardım için teşekkür ederim.

1. Beyin dilimleri Hazırlanışı: 22 gün eski Wistar rat - Deneyler, doğum sonrası 16 hipokampal beyin dilimleri üzerine yapılır. <ol><li> Hayvanlar yerel etik kurallara uygun ve onaylı hayvan bakım protokolleri dekapitasyon tarafından kurban. </li><li> Bir spatula ile beyin hızla kaldırmak ve bir cerrahi bıçağı (# 24) ile orta hat boyunca kesmek. Whatman filtre kağıdı, kağıt bakan kesme her yarımkürede yerleştirin. </li><li> Örnek diskte superglue bir damla koyun ve yarımkürede kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde üst üste yerleştirin. Kesme odasında buz gibi bir yapay beyin omurilik sıvısı ile doludur vibratome numune diski yerleştirin (ACSF, lütfen aşağıda 3.1 &#39;e bakın). </li><li> 400 mcM dilim kalınlığı ayarlama ve kesme beyinde başlar. Hipokampus ulaşmadan önce beyin dokusunun yaklaşık 2 mm kesmek gerekir. </li><li> Hipokampal dilim ACSF ile dolu bir cam petri tabak içine konur. Hippocampi kolay görselleştirme izin plaka siyah bir arka plan (örneğin siyah kağıt) üzerine yerleştirilir. Çevreleyen dokudan keskin cerrahi bıçaklar kullanılarak hipokampus ayırın. Doku itmek ya da çekmek için dikkatli olun. </li><li> Dilimler, sonra oda sıcaklığında saklanan ° 1s C ve deneyler kadar yapılan 37.0 ACSF çözüm inkübe edilir. Bir saatlik inkübasyon sırasında doku hasarı kesme işlemi uygulanan kurtarır. </li></ol> 2. Pipetler yama için hazırlanması: <ol><li> Pipetler borosilikat cam kapilerleri yapılır. </li><li> Patch-pipetler, pipetler sonuçlanan, otomatik ya da manuel pipet Elcikler çekti 2 direnci - M tüm hücre kayıtları için 4 veya 8 - M 20 tek kanallı kayıtlar için uygun pipet çözüm ve ACSF banyo çözümü ile dolu (3.1, aşağıya bakınız). </li><li> Tek kanallı kayıtları için kullanılacak pipetler, platin tel üzerinde oturan bir erimiş cam ısı yüzeyi pürüzsüz hale getirir bir microforge ile parlatılır. Aynı borosilikat cam gibi yama-pipetler tel cam damlacık oluşturmak için kullanılır. Pipetler deneyimlerimiz bu şekilde Parlatma kaplamasız bir tel ısı veya otomatik çektirmenin bir parlatma adım cilalı pipetler ile karşılaştırıldığında, daha istikrarlı ve daha yüksek bir direnç mühürler formu pipetler oluşturur. Pipetler Final büyüklüğü M 8 ile 20 arasında değişmektedir. Tüm hücre kayıtları kullanılan Pipetler cilalı değildir. </li></ol> 3. Deneylerde kullanılan Çözümleri: Özel çözümler, tek kanallı ve tüm hücre kayıtları için kullanılır. <ol><li> ACSF mM içerir: 124 NaCl, NaHCO 3, 26 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 2.5 Na 2 HPO 4, 2.5 CaCl 2, 10 glukoz ve pH 7.2 - 7.4% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile kabarmış . ACSF bazen de örneğin laktat 11 gibi diğer besin maddeleri ile tamamlanmaktadır. </li><li> Tek kanallı kayıtlar: banyo solüsyonu ACSF veya mM ya: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2 ve 10 TES (N-tris [hidroksimetil] metil-2-aminoethanesulfonic asit) pH 7.25 ve diğer ilaçlar özel deneyler için gerekli olabilir mM hücre bağlı ve iç-dış yamalar için pipet çözüm: 140 Kolin Cl, 5 NaCl, 1 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 10 TES pH 7.25, 200 mcM saclofen (GABAB antagonist) ve 0 - 1 mcM GABA. Dış-mM yamaları: 140 NaCl veya Kolin Cl, 0.3 KCl, 2 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES pH 7,2 - 7,4. </li><li> Tüm hücre gerilim-klemp kayıtları: banyo çözüm: dilimleri (2-3 ml / dk) perfüze ACSF şimdi de kynurenic asit (3 mM) ve özel deneyler için gerekli olabilecek diğer ilaçlar içeren pipet çözüm içeren mM: 140 CSCL, CaCl 1, 2, 3 EGTA, 0.5 KCl, 1 MgCl 2, 2 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, 5 QX-314 bromür, CsOH ile 7.25 arasında 10 TES pH . </li></ol> 4. Patch-klemp deneyler için bir Giga Ohm (GΩ) mühür oluşturulması: Hipokampal beyin dilimleri (Şekil 1A), U-şeklinde bir platin tel üzerinde naylon konuları kayıt odasının alt kısmında yapılmaktadır. CA1 ve 3 örneğin doku organizasyonu ve dentat girus bölge hipokampal dilimleri veya belirli hücreler görselleştirmek için, bir mikroskop gerekiyor. Çoğu laboratuarları, böylece bir doku bölgeler veya belirli hücreleri tanımlamak için izin 60X 10X arasında değişen hedefleri ile dik bir mikroskop kullanıyoruz. Ancak, hatta bir diseksiyon mikroskobu yama dilimleri için kullanılan ve daha sonra görsel olarak belirli bir hücre yama değil, bir bölgeyi belirlemekte ama. Bu tür yama &quot;kör yama&quot; olarak adlandırılır. Benn sonunda her iki durumda bir yama belirli bir alanda tek bir hücre. Başarı oranı her iki yöntem için de benzer. Inhibitör hipokampus başlıca hücrelerin hücre gövdeleri, hipokampus bütün altalanları ve katmanlar arasında dağılmış oldukça yapılandırılmış lamina (örneğin CA3/CA1 stratum pyramidale ve hipokampal beyin dilim parlak grup olarak tanımlanır) organize olmasına rağmen hücre gövdeleri toplam nöronal nüfusu 12 yaklaşık% 10&#39;unu oluşturuyor internöronlar. Granül hücre veya piramidal nöron lamina yamalı olabilir, zaman zaman interneuron ya da glia, bu hücrelerin farklı elektriksel özellikleri (Hippocampus Kitabı 13) temel hücreleri ayırt edilebilirler. <ol><li> GΩ mühür oluşumu. Bu işlem sırasında cam pipet şekilde hücre membranı sıkıca bağlanmış ve farklı yama yapılandırmaları GABA-aktive hücre zarı kanallarının etkinliğini ölçebilirsiniz (4 ve 5, aşağıya bakınız) olur. Pipet tutucu pipet pipet hızlandırır kap koyun ve sıkın. Axoclamp amplifikatör 200B Ayarlar: V-kelepçe, Kazanç 2, Filtre 2 kHz, holding potansiyeli 0 mV ve PClamp yazılımı kullanılarak bilgisayar üzerinden deney yapıyorsun. </li><li> Pipet tutucu ve ağızlık ve tüp arasında vanasını kapatın bağlayan tüp takılı olan ağız parçası haline üfleyin. Bu sizin pipet pozitif basınç oluşturur. Pipet pozitif basınç iki işlevi vardır; ilk, bir akış pipet gelecektir ve bir kez pipet pipet ucu temiz tutmak yardımcı olacak banyo çözüm girer. İkincisi, hücre zarının bir yama-pipet ile, nazik vakum uygulayarak yüksek kalite, yüksek direnç sızdırmazlık oluşturan önemli bir parçasıdır. Mühür, genellikle sadece pipet basınç kontrol vanası açılarak oluşturulabilir. Bu nedenle, herhangi bir hava kaçağı olmadığından emin olun. Pipet tutucu alarak kolayca sızıntı olup olmadığını test edebilirsiniz, ağızlık içine su ve darbe ile dolu bir beher içine batırın. Herhangi bir kabarcıkları kaçmak görürseniz o bölümü yeterince sıkı değildir. </li><li> Banyo solüsyonu içine pipet indirin. Pipet direncini ölçmek bilgisayar ekranında 5 mV puls ve pipetin direnişi anlatan bir dizi tarafından oluşturulan bir kare darbe göreceksiniz. Daha az sayıda, daha büyük bir pipet açıklıkları, daha büyük pipetler temsil eder. 0 ofset pipet ayarlayın. </li><li> Hücre zarı Sızdırmazlık. Üzerinde bir mühür formu bölge veya yama için gidiyoruz hücre, tanımlayın. Beyin dilim içinde bir dentat girus granül veya mikroskopta 10X büyütme kullanarak parlak bantlar olarak hipokampus CA1 ve CA3 piramidal hücre gövdesi bölgelerde (bkz. Şekil 1A) tanımlamak veya kullanarak bireysel yüzey piramidal nöronlar tespit 60X büyütme. <ol><li> Mikroskop göz parçaları ile baktığınızda sizin bölge / hücre ve pipet görecek şekilde odak noktası haline pipet getir. </li><li> Sadece yukarıda ancak doku dokunmadan kadar kaba hareket manipülatör ayarları ve düşük pipet kullanarak bölge / hücrenin ortasında üzerinde pipet yerleştirin. </li><li> Çok hafifçe manipülatör üzerinde hareket ince ayarları kullanarak bölge / hücrenin ortasında üzerine pipet düşük ve aynı zamanda bilgisayar ekranında izlemek ve takip pipet direnç. Pipet direncini daha büyük olmasını (yüksek numara) görene kadar pipet aşağı hareket edin. </li><li> Şimdi, yavaşça pipet pozitif basınç valf açarak serbest bırakın. Bu nazik bir emiş ve genellikle giga-mühür (yüksek direnç mühür, GΩ) automatically.If formları miktarda, daha sonra, önceden uygulanan pozitif basınç ve Giga-Seal oluşturacak ağızlık emme geçerlidir . </li><li> Şimdi sözde Hücre-portlu patch-klemp yapılandırma (bkz. Şekil 1b) elde edilmiştir. Pipet ve pipet tutucu gelen transientler iptal etmek için hızlı ve yavaş kapasitans tazminat ayarlayın. Bilgisayar ekranında artık düz bir iz göreceksiniz. Yüksek GΩ sızdırmazlık değeri, daha iyi sinyal-gürültü oranı tek kanallı kayıtları olacaktır. </li></ol></li></ol> Bazen hipokampal dilim içinde yama için avantajlı olabilir. Bazı durumlarda hücrelerin sağlıklı bir yüzeyde daha korunur gibi zaman olabilir. Ayrıca, böyle bir doku içinde nöronlar, yama tonik şimdiki nesil ekstrasellüler GABA konsantrasyonlarının etkisi olarak, hücresel fonksiyonları üzerindeki ekstrasellüler çevre etkileri okuyor bir avantaj olabilir. Yama işlemi o biri dışında yukarıda açıklandığı gibi aynı po bırakmazsitive basınç pipet, pipet ucu kadar dilim içinde. 5. Tam hücreli yapılandırma ve kayıt tüm hücre akımları oluşturulması: <ol><li> Hücre bağlı yapılandırma, pipet potansiyeli -60 mV değiştirebilir veya hücrenin istirahat membran potansiyeli yakın. </li><li> Pipet, pipet sahibine bağlı ve aynı zamanda direniş ve hücre içine kırık sonra görünür kapasitans transientler değişiklik nota bilgisayar ekranında izlemek tüp yoluyla emme uygulayın. Bu sözde Tüm Hücre yapılandırma veya Tüm Hücre modu (Şekil 1B) olur. Hücre membran direnci, bir hücre tipi diğerine değişir ve membran kanalları ve kaç açık iletkenlik bağlıdır. Hücre zarının kapasitans hücre boyutu ile değişir. Emiş başlangıçta hafifçe olmalıdır ancak hücre daha yürürlüğe kırmak için zor ise uygulanabilir. Emme Bakliyat de kullanılabilir. </li><li> Bazen, pipet ve hücre arasında gelişen direnç bir tazminat gereklidir. Bu seri veya erişim direnci (Rs veya Ra) tazminat denir ve amplifikatör üzerindeki bir kontrol düğmesi ile yazılım ya da elle yoluyla yapılabilir. Deneylerde Ra için telafi yok ama ilk erişim direnci% 25 daha fazla göre değişir deneyler reddedilir. </li><li> Tam hücreli modunda kaydedilen GABA-aktive tonik akımları. </li></ol> Hipokampal CA1 piramidal nöronları tam hücreli yapılandırmada biz tutma potansiyeli seti - 60 mV ve 5 - 10 dakika pipet çözüm hücre iç dengeye izin bekleyin. Bu süre zarfında kayıt kararlı hale gelir. Deney sırasında, seri direnç değeri takip edebilirsiniz. Deneyler voltaj-klemp yapılan ve tüm hücre zarı kanallarının bir nüfus akımı ölçmek. Bir akımların fazik ve tonik doğası gereği GABA-aktive sinaptik ve extrasynaptic akımları ayırt edebilirler. Antagonist SR95531 tüm GABA A akımları engeller. Holding akım azalma, nöron mevcut GABA-aktive tonik düzeyini gösterir. Biz dilim bağlıdır ekstraselüler ortam GABA GABA-aktive tonik akım ilgilenen biz normal hücrelerin yüzeyinde yama değil, dilim içinde hücreleri yok Kullandığımız agonistleri ve antagonistleri, Kanal A, banyo çözümü uygulanır GABA modüle ve dilim içinde hücrelere ulaşır. - Deney odasında çözüm akış hızı 2 3 ml / dk. 6. Kayıt tek kanal akımları: Deneyler bağlı hücre, iç-dış-patch-klemp yapılandırma yapılır (aşağıya bakın) ve tek kanal molekülleri aracılığıyla kayıt akımları, tek kanal akımları. Axoclamp 200B, V-kelepçe, kazancı 500, filtre 2 veya 5 kHz Ayarlar. PClamp yazılımı ile pipet potansiyeli kontrolü, veri örnekleme hızı en az 100 μs ayarlamak ve akımlar kayıt. Sadece dilim kapsayacak şekilde, tek kanallı kayıtları gürültü en aza indirmek için banyo çözüm ses seviyesi düşük tutulmaktadır. <ol><li> Hücre Eklenmiş yapılandırma GABA-aktive kanalları. GΩ mühür, hücre ekli modunda zarının üzerinde yer almış ve pipet içine membran yama kanalları (bkz. Şekil 1B) kaydedebilirsiniz. GABA hücre zarı çapraz olarak, GABA yama kanalları etkinleştirmek için pipet çözüm konur. GABA-aktive Extrasynaptic kanalları birkaç dakika kadar bir gecikme ile etkinleştirin. PClamp içinde potansiyel pipet potansiyeli yani - yama potansiyeli = 40 mV, membran depolarize 40 mV olarak kaydedilir. Hücre bağlı modunda kayıt avantajı kanal kendi doğal ortamında ve normal hücre içi proteinler ve faktörler ile bağlantılı olduğunu. Dezavantajı yama karşısındaki mutlak istirahat membran potansiyeli ve potansiyel bilmiyorum kayıt ne potansiyeli tam olarak bilmiyorum, hem pipet potansiyeli ve hücre istirahat membran potansiyeli tarafından belirlenir. </li><li> Inside-Out yapılandırma GABA-aktive kanalları. Pipet hücre bağlı modunda hafifçe kaldırın ve mikromanipülatörler ince hareketleri kullanarak yan ve dilim uzak taşımak. Artık iç-dış yama ve Inside-Out modunda kaydedebilirsiniz. (Bkz. Şekil 1B) pipetlendi içine membran yama kayıt. Hücre bağlı modu olarakkanalları etkinleştirmek için pipet çözümü GABA var. Ancak, ilaçlar, benzodiazepinler, barbitüratlar, propofol vb gibi çift katlı lipid çapraz pipet içine geçmek mümkün olacak gibi banyo çözümü uygulanmış ve kanalları modüle edilebilir [14]. Yama potansiyeli = pipet potansiyeli ve hücre bağlı modu gibi üst üste hiç istirahat membran potansiyeli olmadığından, yama potansiyeli-pipet potansiyel örneğin eşit sonra -40 mV yama PClamp içinde tutma potansiyeli ayarlarsanız potansiyeli tam olarak 40 mV. Iç-dış yapılandırma avantajı kanal özelliklerini etkileyen bir iç membran yüzeyine ilaçlar ya da enzimler uygulamak ve incelemek için. Iç-dış yama yapma gücü, dışarıdan yama oluşur daha kanal kompleksi için, bu yırtık-off yama yapılandırma oluşumu potansiyel olarak daha nazik yapan kanal membran ortamı için geçerli değildir (aşağıya bakınız) . </li><li> Dış-Out yapılandırma GABA-aktive kanalları. Tam hücreli modu sizin mikromanipülatör ince hareketleri kullanılarak pipet yavaşça yukarı kaldırın ya da geri çekmek. Aynı zamanda bilgisayarınızdaki pencere yama özelliklerini görüntüler izleyebilirsiniz. Hücre uzak pipet çizmek kapasitans transientler yok göreceksiniz ve tekrar GΩ mühür olacaktır. Artık bir dış-yama oluşturdular ve Dış-Out modunda kaydedebilirsiniz. Şekilde hücre zarı, pipet ucu deliğinin üzerinde kapatılmış, membran içinde pipet iç ve orijinal dış membran (Şekil 1B), kayıt odasında karşı karşıya karşıyadır. Incelenmek üzere GABA ve diğer ilaçlar artık banyo çözümü çözülür. 40 mV PClamp tutma potansiyeli ayarlamak yama potansiyeli = sonra pipet potansiyeli tam hücreli modu örneğin gibi yama potansiyeli tam olarak 40 mV. Dış-çıkış modu avantajları membran potansiyelinin ne olduğunu ve membran orijinal dış yüzleri olarak kullanılacak ilaçların deneysel odası, banyo çözüm çözülür ve kolaylıkla uygulanan ve kanallar kapalı yıkanmış olabilir tam biliyoruz. Dezavantajları membran üzerinde mühür vardı ve bazı moleküller kaybolmuş olabilir veya yerel membran çevre bozuk olarak artık kanal, hücre içi ve hatta transmembran proteinler ve tam kanal işlevi için gerekli olabilir faktörler bağlı olabilir ki süreci. Ancak, birlikte, herhangi bir diğer yöntem ile bugün artık mümkün değildir, moleküler düzeyde kanal özelliklerini farklı yama yapılandırmaları diseksiyonu izin verir. </li></ol> 7. Sonuçları analiz: Tek kanallı ve tam hücreli akımları PClamp yazılım ile analiz edilir. Biz Synaptosoft (GA, ABD) veya AXOGraph (Sidney, Avustralya) sinaptik olayların analizleri için. 8. Temsilcisi sonuçları: Şekil 2A dentat girus granül nöron bir hücre bağlı yama 20 nM GABA konsantrasyonu ile aktive tek kanal akımları gösterir. Kanalın maksimum iletkenlik aktivasyon gecikme süresi 2 dakika ve 38 saniye ve maksimum iletkenlik pS 15 44 idi. Yama 40 mV depolarize oldu. Şekil 2B rat hipokampal nöronlar tonik ve fazik akımları BELİRLEME tam hücreli gerilim kelepçe mevcut kayıtların örneklerini göstermektedir. GABAA antagonisti SR95531 engeller extrasynaptic-(tonik) ve sinaptik oluşturulan (fazik) GABA-aktive akımları. (Ba) dentat girus nöron ve (BB) insülin CA1 piramidal nöron extrasynaptic kanalları (Ba, b) ve engelleme SR95531 tarafından indüklenen temel akım vardiya güncel tonik ifşa tedavi uygulanan GABAA antagonisti SR95531 (100 mcM) sinaptik akımların ortadan kalkması SR95531 blokları sinaptik kanalları (Bb). CA1 piramidal nöronlar bazal koşul altında nöronların fizyolojik insülin konsantrasyonları 4 GABA-aktive tonik akımlar geliştirmek maruz kaldığında, 6 tonik GABA-aktive akımlar var ama yok. <img src="/files/ftp_upload/2858/2858fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1A. Rat hipokampal beyin dilim, belirlenen bölgelerde CA1 ve CA3 piramidal hücre tabakaları ve dentat girus (DG) granül hücre katmanı B. Şematik yama klemp yapılandırmaları. <img src="/files/ftp_upload/2858/2858fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2A, 20 nM tarafından aktif bir sıçan hipokampal beyin dilim dentat girus granüllü hücre hücre bağlı bir yama GABA Tek kanal akımları. Holding potansiyeli depolarize 40 mV (pipet potansiyeli -40 mV). Yıldız (* 1. akım iz) tanımlayan akımlar daha hızlı zaman ölçeği (2 nerede gösterildiğinind mevcut iz) a. tutma potansiyeli -60 mV gerilim kelepçe modunda dentat girus granül hücre ve b. CA1 piramidal nöron sıçan hipokampal beyin dilim kaydedildi. B. Tüm hücre akımları alınmıştır. CA1 deneyler için, dilimler akımları kaydedildi önce oda sıcaklığında 2 saat için 1 nM insülin inkübe edildi.

<ol>
	<li>Pavlov, I., Savtchenko, L. P., Kullmann, D. M., Semyanov, A., Walker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outwardly+rectifying+tonically+active+GABAA+receptors+in+pyramidal+cells+modulate+neuronal+offset,+not+gain.">Outwardly rectifying tonically active GABAA receptors in pyramidal cells modulate neuronal offset, not gain.</a> J Neurosci. 29, 15341-15350 (2009).</li><li>Chao, H. T., Chen, H., Samaco, R. C., Xue, M., Chahrour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+in+GABA+signalling+mediates+autism-like+stereotypies+and+Rett+syndrome+phenotypes.">Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes.</a> Nature. 468, 263-269 (2010).</li><li>Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+excessive+GABA-mediated+tonic+inhibition+promotes+functional+recovery+after+stroke.">Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke.</a> Nature. 468, 305-309 (2010).</li><li>Jin, Z., Jin, Y., Mendu, K. M., Degerman, E., Groop, L., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+reduces+neuronal+excitability+by+turning+on+GABA(A)+channels+that+generate+tonic+current.">Insulin reduces neuronal excitability by turning on GABA(A) channels that generate tonic current.</a> Plos One. 6, e16188-e16188 (2011).</li><li>Nusser, Z., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+tonic+and+phasic+inhibitions+in+dentate+gyrus+granule+cells.">Selective modulation of tonic and phasic inhibitions in dentate gyrus granule cells.</a> J Neurophysiol. 87, 2624-2628 (2002).</li><li>Semyanov, A., Walker, M. C., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+uptake+regulates+cortical+excitability+via+cell+type-specific+tonic+inhibition.">GABA uptake regulates cortical excitability via cell type-specific tonic inhibition.</a> Nat Neurosci. 6, 484-490 (2003).</li><li>Birnir, B., Korpi, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+sub-cellular+location+and+intracellular+neuronal+proteins+on+properties+of+GABA(A)+receptors.">The impact of sub-cellular location and intracellular neuronal proteins on properties of GABA(A) receptors.</a> Curr Pharm Des. 13, 3169-3177 (2007).</li><li>Olsen, R. W., Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+LXX.+Subtypes+of+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptors:+classification+on+the+basis+of+subunit+composition,+pharmacology,+and+function.">International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function.</a> Update. Pharmacol Rev. 60, 243-260 (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Zilberter, Y., Zilberter, T., Bregestovski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+in+vitro+and+the+in+vivo+reality:+the+role+of+energy+homeostasis.">Neuronal activity in vitro and the in vivo reality: the role of energy homeostasis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31, 394-401 (2010).</li><li>Spruston, N., McBain, C., Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+hippocampal+neurons.">Structural and functional properties of hippocampal neurons.</a> The Hippocampus Book. , (2007).</li><li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Hippocampus Book. , (2007).</li><li>Eghbali, M., Curmi, J. P., Birnir, B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+GABA(A)+channel+conductance+increased+by+diazepam.">Hippocampal GABA(A) channel conductance increased by diazepam.</a> Nature. 388, 71-75 (1997).</li><li>Lindquist, C. E., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+response+to+GABA+by+native+extrasynaptic+GABA+receptors.">Graded response to GABA by native extrasynaptic GABA receptors.</a> J Neurochem. 97, 1349-1356 (2006).</li><li>Birnir, B., Eghbali, M., Cox, G. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+concentration+sets+the+conductance+of+delayed+GABAA+channels+in+outside-out+patches+from+rat+hippocampal+neurons.">GABA concentration sets the conductance of delayed GABAA channels in outside-out patches from rat hippocampal neurons.</a> J Membr Biol. 181, 171-183 (2001).</li><li>Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., Gage, P. W. B. i. c. u. c. u. l. l. i. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pentobarbital+and+diazepam+modulate+spontaneous+GABA(A)+channels+in+rat+hippocampal+neurons.">pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons.</a> Br J Pharmacol. 131, 695-704 (2000).</li><li>Birnir, B., Everitt, A. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+GABAA+channels+in+rat+dentate+gyrus.">Characteristics of GABAA channels in rat dentate gyrus.</a> J Membr Biol. 142, 93-102 (1994).</li></ol>

Tüm hücre akım hücre aktif kanallar tarafından oluşturulan topluluk akımların temsil eder. Farmakoloji ve klorür geçirgenliği GABAA kanalları bu kanallar ile ilgili akımları tespit etmek mümkün kılar. Sinaptik kanalları ve extrasynaptic kanalların tonik aktivasyon aktivasyon geçici doğası, bu iki nüfus arasında bir nöron olarak ifade GABAA kanalları kolay bir farklılaşma sağlar. Ancak, sadece tek kanallı kayıtları bir tonik akımları oluşturur kanal moleküllerin kinetik özellikleri eğitim görebilirsiniz. 100 s içinde aktif hale sinaptik kanalların aksine, tonik GABAA kanalları GABA 4,7,15,16,17,18 uygulanan zaman dakika arasında bir gecikme ile aktive edilir. Bu, pek çok kanal özellikleri kanal sonuçları gecikmeli aktivasyon tüm hücre kayıtları kullanılarak incelenmiştir olamaz. Tek kanallı düzeyinde GABAA kanalları farklı alt popülasyonları değişen fonksiyonel ve farmakolojik özellikleri tespit edilebilir. Böylece, farklı yama klemp yapılandırmaları sunmak için ne bir avantaj alarak, ayrıntılı olarak, nöronlarda sinaptik tonik ve akımlar oluşturmak GABA-aktive kanallarının moleküler farmakoloji fonksiyonu ve çalışma mümkündür.

Birkaç patch-klemp donanım ve yazılım sistemleri mevcuttur ve hepsi aynı temel ilkelerini kullanarak çalışır. Laboratuarımızda Axoclamp amplifikatörler ve PClamp yazılımı (Moleküler Cihazlar, ABD), bizim deneyler kaydetmek ve analiz etmek için kullanırlar. Bir diğer popüler marka Heka amplifikatörler ve yazılım (Heka Elektronik, Almanya) Microforge: Narishige MF-830 (Japonya); Vibrotome: örneğin Leica VT1200S (Almanya) veya Chipping Aletleri vibrotome (UK); Mikroskop: Nikon Eclipse E600FN; su banyosu; mikromanipülatörler: özel yapılmış ve Narishige mikromanipülatörler (Japonya); Çektirme: DMZ evrensel (Almanya) veya Narishige PC-10 (Japonya). Elektrot cam: GC150F-15 (Harvard Apparatus, Birleşik Krallık).

gaba-activated single-channel and tonic currents in rat brain slices

GABA Kanal A tüm nöronların ve onlar sırasıyla 4,5,6,7 GABA bir kanal pentameric GABA-kapılı klorür kanal fazik ve tonik akımlar oluştururlar sinaps sinaps ve dışında bulunmaktadır. Kanal alt birimden, 8 aile (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π ve ρ) gruplandırılmıştır. İki alphas iki betaları ve 3. altbirim fonksiyonel 8 kanal oluşturur. GABA bütün halkları nöron bir kanal da dahil olmak üzere çalışmaları ile alt türüne özgü GABA-aktive tek kanallı molekülleri çalışmaları birleştirerek temel nöronal inhibisyon mekanizması ve farmakolojik ajanları tarafından modüle nasıl anlamak mümkün olur. Biz, hipokampal beyin dilimleri canlı nöronlarda GABA Kanal A fonksiyonel özellikleri çalışma ve tek kanallı ve tam hücreli akımları kaydetmek için yama klemp tekniği 9,10 kullanın . Biz kanalların daha farklı GABA konsantrasyonları, diğer ilaçlar ve içi ve hücre dışı faktörler tarafından nasıl etkilendiğini inceler. Patch-kelepçe yöntemi ayrıntılı teorik ve pratik açıklaması için, B Sakman ve E Neher 10 tarafından düzenlenen Tek Kanal Kayıtlar bakın .

Watch this Scientific Journal Video about GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices at JoVE.com

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

GABA-aktive tek kanal akımları (GABAA kanalları, GABAA reseptörleri) ve nöronlarda sinaptik üreten ve tonik akımları ölçmek için yama klemp tekniği kullanır. Sağlık ve hastalık kanalların aktivasyonu nöronal eksitabilite azaltır<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.1K Görüntüleme.  Uppsala University, Sweden. GABA-aktive tek kanal akımları (GABAA kanalları, GABAA reseptörleri) ve nöronlarda sinaptik üreten ve tonik akımları ölçmek için yama klemp tekniği kullanır. Sağlık ve hastalık kanalların aktivasyonu nöronal eksitabilite azaltır 1,2,3,4.

Video: GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Nörobilim

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...