Belirli bir protein fonksiyonu gen manipülasyonu ile değiştirildiğinde, tahriş edici yetmezlik ve motor koşu bozukluğu koordinasyonu LTD ve motor öğrenme arasındaki nedensel ilişki için gerekli bir koşul olarak kabul edilir. Burada, gen lemanlı hayvanlarda telafi mekanizmaları ile indüklenebilecek LTD'yi değerlendirmek için birden fazla protokolün kullanıldığını gösteriyoruz. Beyin hasat önce, soğuk ve buz üzerinde ACSF iki 50 mililitrelik gagaları oksijen.
Çözelti sıcaklığı dört santigrat derecenin altına ulaştığında, buz gibi gagalardan birine bir milimolar tetrodotoxin 50 mikrolitre ekleyin. Beyin hasat için, baş tutun ve orta hat boyunca yüzeysel deri kesmek için oftalmolojik makas kullanın. El ile kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için deri geri ve her iki göz üzerinde bir çizgi boyunca kafatası kesmeden önce göz ve kulaklar sadece üzerinde büyük spinocerebellar delikten yatay olarak kafatası boyunca kesmek için makas kullanın.
Beynin ortasındaki beyni kesmek ve beyincik de dahil olmak üzere beynin kaudal kısmını kafatasından izole etmek için neşter kullanın. Acsf buz soğuk kabında örnek batırın ve beher beyin bloğu karıştırmak değil, böylece kabarcık boru ayarlayın. En az yedi dakika sonra, beyin bloğu almak ve herhangi bir aşırı ACSF absorbe etmek için filtre kağıt bir parça kullanmak için bir spatula kullanın.
Uygun bir tıbbi yapıştırıcı ile agar bir iki şer metrelik bir parça üzerine doku ventral tarafı aşağı monte edin. Mümkün olduğunca Purkinje hücrelerinin dendritik düzleme paralel olarak beyin dokusunun sağ yarımkürekesmek için bir bıçak kullanın. Kesme ve yarımkürenin diğer tarafında kaldırmak ve üstün ve inferior colliculi arasında beyin kesti.
Omuriliği kesin ve kesilmiş beyincik sağ tarafını agar bloğu ile önceden soğutulmuş numune tepsisine yapıştırın. Daha sonra, numune tepsisini yatırarak, eti onarmak ve fazla tutkalları temizlemek için numunenin üzerine ACSF dökün. Beyin örneğini dilimlemek için, serebellumun dorsal tarafı nın ön tarafta olduğu numuneyi yönlendirin ve tetrodotoksin le takviye edilmiş buz gibi kesme ACSF'yi tamamen serebelluma batırın.
Kesme çözeltisi içine bir gaz tüpü yerleştirin ve bir oksijen-karbondioksit gazı karışımı ile köpürme başlatmak. İnce cımbız ve büyüteçler kullanarak, araknoid mater kaldırmak ve serebellar peduncle çıkarmak. Beyin sapı ve agar bloğu çıkardıktan sonra, serebellumun dorsal yüzeyinin vibratomun jiletine bakması ve ilk kesme yerini ayarlaması için tepsiyi 180 derece döndürün.
Vibratom genliğini 5,5'e, frekansı 85 Hertz'e, hızı üçe dörte, dilim kalınlığını 300 mikrometreye ayarlayın. Serebellar dilimler elde edilir gibi, 26 derece santigrat su banyosunda bir akrilik kuluçka için bölümleri aktarmak ve tamamen en az bir saat taze oksijenli ACSF örnekleri batırmak için bir naylon ağ kullanın. Tüm hücre yama kıskacı raporlama için, dakikada iki mililitre akış hızı nda toksin çözeltisi ile 30 derece santigrat kayıt odası perfüzyon önce üç dakika boyunca ultasonication tarafından ACSF bir mikromolar picrotoksin eritin.
Birkaç dakika sonra, kayıt odasına bir serebellar dilim aktarın ve platin ağırlığı ve naylon iplikleri ile doku düzeltmek. Sonra taze ACSF ile uyarıcı bir elektrot doldurun. Paralel lifleri uyarmak için, Purkinje hücre tabakasıyaklaşık 50 mikrometre moleküler tabaka yüzeyinde uyarıcı elektrot yerleştirin.
Tırmanma lifleri uyarılması için, Purkinje hücre tabakasının altına uyarıcı elektrot yerleştirin ve 0,45 mikrometre filtrelenmiş potasyum veya sezyum bazlı iç çözelti sekiz mikrolitre ile bir kayıt elektrot doldurmak için bir mikroyükleyici kullanın. Elektrot ACSF'ye batırmadan önce kayıt elektrobuna zayıf pozitif basınç uygulayın. Elektrot direnci 2-4 megaohm olmalı ve sıvı bağlantı potansiyeli düzeltilmelidir.
Bir Purkinje hücresinin sağlıklı parlak hücre gövdesine kayıt elektrotuyla yaklaşın ve Purkinje hücresinin yüzeyini hafifçe itin. Sonra pozitif basınç uygulayarak durdurmak ve bir gigaohm mühür oluşana kadar negatif basınç uygulayın. Daha sonra eksi 70 milivolt membran potansiyelini korumak ve 0.1 hertz eksi iki milivolt 100 milisaniye darbeler uygulayarak, giriş direnci, seri direnç ve giriş kapasitans sürekli izleme, bütün bir hücre yapılandırması kurmak için negatif basınç kullanın.
Uzun süreli depresyon indüksiyonu için, 0.1 milisaniyelik darbe ile moleküler tabakayı uyarmak ve paralel lif uyarıcı post-sinaptik akımları tanımlamak için bir çift darbe uyarıcı uygulayın. Bir eşleştirilmiş nabız kolaylaştırılması ve stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre genlik kademeli artış gözlenmelidir. Test yanıtını kaydetmek için tek bir 0.1 hertz darbesi uygulayın ve uyarılmış genlik 200 pikoamp civarında olacak şekilde uyarıcının yoğunluğunu ayarlayın.
Purkinje hücre tabakasının altındaki tırmanma lifleri teşvik ve tırmanma lif aktivasyonu tarafından ortaya çıkarılan paralel lif uyarıcı post-sinaptik akımları belirlemek için, bir çift darbe uyarıcı uygulayın. Eşleştirilmiş nabız depresyonu stimülasyon yoğunluğundaki artışla ilişkili olarak tamamen veya hiçbiri gözlenmemelidir. Bu temsili deneyde, dilim hazırlanmasında mevcut kelepçe koşullarında bir paralel lif stimülasyonu ve bir tırmanma lifsi stimülasyonu kullanılmıştır.
Konjonktif stimülasyontarafından ortaya çıkarılan karmaşık başak şekli, sadece tırmanış lifi stimülasyonu nun ortaya çıkardığı ilk dik başakletve ardından iki ila üç başakletin ortaya çıkardığına benzerdi. Benzer şekilli karmaşık bir başak, 50 milisaniye sonra konjonktif ikinci paralel ve tırmanma lif stimülasyonu ile paralel bir lif stimülasyonu takip edildiğinde gözlenmiştir. Sezyum bazlı iç solüsyon kullanılarak gerilim kelepçesi koşullarında yapılan bu testte, 50 milisaniye sonra ikinci bir paralel lif stimülasyonu ve somatik depolarizasyon uygulaması ile paralel lif stimülasyonu takip edilmiştir.
Somatik depolarizasyon üzerine eksi 70 ile sıfır milivolt arasında bir içe akım ortaya çıktı ve kuyruk akımı da repolarizasyondan sonra uyarıldı. Son olarak, voltaj kıskacı koşullarında somatik depolarizasyon ile aynı anda 100 hertz beş paralel lif uyaranları verildi. Yine de depolarizasyon sırasında tekrarlayan içe akım nesli ortaya çıkarılmış ve repolarizasyon dan sonra kuyruk akımı indüklenmiştir.
Gen leğenli hayvanlarda serebellar LTD ile motor öğrenme arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için, rahat fizyolojik koşullar altında LTD'yi ikna etmek için birden fazla protokol kullanılmalıdır. Motor öğrenme sonrası gen leğenli hayvanlarda serebellar LTD görselleştirilmişse, aralarındaki nedensel ilişki daha doğrudan incelenebilir.
