This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

Hayvancılık, bakım ve kullanım ile ilgili tüm protokoller Sağlık Kanada&#39;nın hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Sergilenmeler <ol><li> Rasgele seçilen yönetim kez uygun bir maruziyet yolu ile test bileşiğinin ve ilgili kontrol ile grupları ve tedavi grupları (dk grup başına = 5) .Treat fareleri kontrol etmek (8-12 haftalık) transgenik erkek fareleri dağıtmak. Ilgi spermatojenik hücre tipi (Şekil 3) göre uygun örnekleme zamanı seçin. </li><li> Örnekleme süresinden sonra, izofloran anestezisi altında, servikal dislokasyon (veya uygun başka bir yöntemle) fareler euthanize. Dikkatle kauda epididimis karın veya skrotum bir kesiden testisler çizin ve kesip. (Şekil 4, epididim koleksiyonu ayrıntılı bir video görebilirsiniz Duselis ve ark. 24 görüntülemek için). Seminifer tübül analiz Alternatif olarak, eğer testisler toplamaks hücreleri. Daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza dondurun. </li></ol> 2. İzolasyon ve Sindirim Kauda Sperm <ol><li> Buz üzerinde kauda epididimiti Defrost. Petri çözülmüş kauda aktarın ve iyice bir neşter veya jilet ile kıyma. </li><li> Petri kabı oda sıcaklığı ile D-PBS içinde 700 ul ilave edin. Çizim ve D-PBS sperm (yaklaşık 10 kat) ile bulutlu olana kadar süspansiyon bırakarak cauda gelen geniş çaplı bir 1000 ul pipet, serbest sperm kullanma. NOT: Geniş çaplı bir pipet hazırlamak için plastik bir pipet ucundan 2-3 mm kesti. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine, paslanmaz çelik bir ağ filtre içerisinden filtre süspansiyonu. D-PBS ilave bir 700 ul ile Petri yıkayıp ağ filtre içerisinden aynı bir 1.5 ml&#39;lik tübe transfer. Buz üzerinde tüp yerleştirmek, örgü çıkarın. </li><li> Tekrar kalan numuneler için 2,1-2,3 adımları. </li><li> 3 dakika boyunca 11.000 xg samplesat Spin. Dikkatle decant süpernatant. Pelet rahatsız kaçının. </li><li> 1.0 ml soğuk 1x tuzlu sodyum sitrat (SSC) ekleyin. Vorteks kadar pelet tamamen yeniden süspansiyon haline getirilir. Bu bazen vorteks birkaç tur alacaktır. </li><li> % 10 SDS 15 ul ekleyin. Ters çevirme / olmayan sperm hücrelerin bozulması için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Çok hafifçe sallanması vasat bozulmasına neden olur ve topak, takip eden basamakta uygun oluşturmayacaktır. </li><li> 2 dakika boyunca 11.000 xg&#39;de Spin. Gevşek, &quot;kabarık&quot; pelet yetersiz olması nedeniyle adım 2.7 sallayarak somatik hücre eksik bozulması göstergesidir. Bu durumda, sadece tekrar örnek sallamak, ve sıkı bir pelet oluşana dek respin. Dikkatlice süpernatant süzün. Pelet rahatsız kaçının. Kısaca tekrar dönmeye ve 200 ul pipet kalan süpernatant kaldırmak. </li><li> Pelet yeniden süspanse kadar 940 ul 0.2x soğuk SSC ve vorteks ekleyin. Bu pelet yeniden suspande edilmesi için çok zor olabilir ve vorteks birkaç tur alabilir. S Bazen kümeleriperma kaçınılmazdır. </li><li> 120 ul β-merkaptoetanol, 100 ul% 10 SDS, 20 ul 0.5 M EDTA, pH 8, ve 20 ul proteinaz K (60 mg / ml taze olarak hazırlanır) eklenir. İyice karıştırın ve 37 ° C&#39;de dönme gecede sindirmek. Fenol / kloroform ekstraksiyonu ile devam edin. </li></ol> Kauda sperm DNA 3. Fenol / kloroform ekstraksiyonu Not: geç faz spermatidler ve olgun sperm nükleer DNA protamin ile kompleks oluşturur ve daha çok somatik hücre DNA ile karşılaştırıldığında yoğunlaştırılan olduğundan, geleneksel nükleik asit izolasyon yöntemleri mutasyon deney çalışması için yeterli verim ve saflıkta DNA oluşturmaz verimli. Saldırgan bir sindirimden sonra birden fazla fenol-kloroform ekstraksiyonu ve serbest (15 ila yöntemlere göre) sperm DNA saflaştırmak için gereklidir. <ol><li> Aktarım, sperm hücresi, bir 15 ml polipropilen tüpe özet. </li><li> Kloroform karışımı: fenol 2 ml ilave edilir (1: 1). 22 rpm&#39;de tüp döndürme3 dakika karıştırıldı. </li><li> 10 dakika boyunca 1600 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe bulanık bir arayüz katmanı ile birlikte sulu bir üst tabaka aktarın. </li><li> Tekrar 3.1.2 ve 3.1.3 3x, fakat sırasıyla 3 dakika, 4 dakika ve 6 dakika için döndürme kez değiştirme adımları tekrarlayın. Final tekrarı üzerine, &quot;bulanık&quot; arayüz katmanının herhangi aktarılmasını önlemek. </li><li> Izoamil alkol (24: 1) 4. Ekstraksiyon işleminden sonra, 3M NaAc, pH 5.2 1 &#39;e göre sulu bir özütünün ml kloroform ve 2 ml 70 ul ekle. 12 dakika boyunca 22 rpm&#39;de tüp döndürün. </li><li> 10 dakika boyunca 1600 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe sulu bir üst tabaka aktarın. </li><li> Mutlak etanol, 2 hacim eklenmesi ve hafif hafif sallanarak hafifçe yan tüpün döndürülmesi ile DNA&#39;nın çökeltilmesi. </li><li> Isı ile sızdırmaz mera pipet ucu üzerine biriktirme ile DNA&#39;nın toplanması. 5 dakika boyunca% 70 etanol ve kuru hava içinde bir pipet ucu ile dönen DNA durulayın. </li><li> 100 ul Üç - ekstre edildikten sonra, 40 DNA çökeltinin çözünmesis-EDTA tamponu, pH 4 ° C &#39;de 8 saklayın. DNA lacZ mutasyon çalışması devam etmeden önce iki gün arasında, en az 4 ° C&#39;de çözünmeye bırakılır. Çözünürlük sorunları karşılaşılırsa, DNA, başka bir kullanım öncesi 15 dakika boyunca 65 ° C &#39;de eritilebilir. Bir 260 ° bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlemek ve çözünmüş DNA konsantrasyonu, 200-2.000 ng / ml arasında olmasını sağlamak. </li></ol> Seminiferous Pipet gelen germ hücrelerinin 4. İzolasyon ve Sindirim <ol><li> Donmuş ise, buz üzerinde (yaklaşık 1 saat) testis defrost. Transfer buzlu cam plaka testis. </li><li> Forseps bir çift testis bir ucunu tutun. Testisin diğer ucunda, forseps başka bir çift veya diseksiyon makas (Şekil 5A) kullanarak epitel kapsül bir delik delmek. Delik yoluyla seminifer tübüller sıkın ve epitel kapsül (Şekil 5B) atın. </li><li> Birdd decapsulated seminifer tübüllerde oda sıcaklığı D-PBS 500 ul. </li><li> Açılı bir doku silindiri, böylece bir uç 5-10 ° (Şekil 5C) yaklaşık bir açıyla plaka ile temas halinde olan (silikon kauçuk sıkıca serbest dönen bir 5 mm çapında paslanmaz çelik boru, ya da benzer cihazı üzerine yerleştirilir). Herhangi bir basınç uygulamaksızın, nazik bir yassı kadar tübüller üzerinde ileri ve geri hareket silindiri ve D-PBS Serbest bırakılan hücreler (yaklaşık 5-10x) ile bulanık hale gelir. </li><li> Bir kaç defa daha tübüllerden üzerinde D-PBS başka 500 ul ekleyin ve yavaşça tübüller üzerinde rulo. </li><li> Aktarılıyor müstakil tübüllerinin miktarını (Şekil 5D) en aza indirirken 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Tekrarlayın, gerekirse daha hücreleri toplamak için 4,5-4,6 adımları. </li><li> Herhangi bir kaza toplanan tübülleri tüpün dibine çökme eğilimi için 2 dk - 1 izin verin. Bir fr D-PBS Transferiyerleşmiş tübüller (D-PBS yaklaşık 100 ul) geride bırakarak 1.5 ml tüp ESH. Bu süspansiyonun Küçük bir alikot hücre popülasyonunun kompozisyonunun bir mikroskop (faz-kontrast) altında kontrol edilebilir. </li><li> 30 saniye boyunca 11.000 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant süzün. Gerekirse hücre topağı, bu noktada, -80 ° C&#39;de dondurulmuş olabilir. </li><li> Gerekirse hücreleri çözülme. Liziz tamponu, 5 ml, 15 ml polipropilen tüp ve tekrar süspansiyon hücrelere transfer (10 mM Tris pH 7.6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1 mg / ml proteinaz K,% 1 SDS). Gece boyunca rotasyonu ile kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de Digest. </li><li> Fenol / kloroform ekstraksiyonu ile devam edin. </li></ol> Tübül Seminiferous germ hücrelerinde DNA 5. Fenol / kloroform ile ekstraksiyon NOT: Daha az agresif ekstraksiyon bu hücre tiplerinin henüz n yoluyla ilerleme değil çünkü, seminifer tübüller germ hücre DNA izole etmek için kullanılıruclear yoğuşma. <ol><li> Karışım, kloroform (1: 1) ile gece boyunca seminifer tübül hücre sindirim fenol 5 ml ilave edilir. 20 dakika boyunca 22 rpm&#39;de tüp döndürün. </li><li> 10 dakika boyunca 1600 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe, &quot;bulanık&quot; arabirim katmanı kaçınarak, sulu bir üst tabaka aktarın. </li><li> 5 ml başına Sulu ekstraktı 5 M NaCI, 100 ul (genellikle 5 mi elde edilir) </li><li> Izoamilalkol: kloroform 5 ml ekleyin (24: 1). 12 dakika boyunca 22 rpm&#39;de tüp döndürün. </li><li> 10 dakika boyunca 1600 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe sulu bir üst tabaka aktarın. </li><li> Mutlak etanol, 2 hacim ekleme ve yavaşça döner ve tüpler ters çevrilerek DNA&#39;nın çökeltilmesi. </li><li> Bir kapalı kapalı mera pipet ucuna biriktirme tarafından DNA toplamak. 5 dakika boyunca% 70 etanol ve kuru hava içinde bir pipet ucu ile dönen DNA durulayın. </li><li> 40-100 | il Tris-EDTA tamponu, pH 4 ° C &#39;de 8 Store DNA çözülür. DNA, iki minimum 4 ° C&#39;de çözünmeye bırakılırgün lacZ mutasyon tahlile geçmeden önce (adım 3.9). Çözünürlük sorunları karşılaşılırsa, DNA, başka bir kullanım öncesi 15 dakika boyunca 65 ° C &#39;de eritilebilir. Bir 260 ° bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlemek ve konsantrasyon, 200 ve 2000 ng / ml arasında olmasını sağlamak. </li></ol> 6. LacZ mutasyon Deneyi Bakteriyel veya fungal kontaminasyon paketleme verimliliği, hem de plak büyümesi ve puanlama engelleyebilir. Bu ambalaj, reaksiyon, ana kültürü ve büyüme ortamı kirlenmesini önlemek için uygun aseptik önlemler kullanarak, lacZ analizini gerçekleştirmek için kritiktir. <ol><li> Gün Tahlil önce: Alt Agar ve Gecelik Kültür hazırlayın <ol><li> Sekiz plakaları Her bir numune başına gerekmektedir ağar 8 ml altını içeren (4 tabak titreye saymak, 4 tabak mutantlar skor) (yani., 64 ml numune başına). Alt agar her ikisi için de aynıdırmutant ve titre sayısı plakalar. Numune sayısı işlenen için yeterli alt agar hazırlayın. Aseptik olarak 90 mm Petri tabaklarda (tabak başına 8 mi) içine dökün ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. NOT: Alt agar plakaları önceden 1 hafta kadar hazırlanabilir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 10 mi LB suyu,% 20 maltoz çözeltisine, 100 ul, 25 ul, ampisilin (20 mg / ml) ve 20 ul, kanamisin (5 mg / ml) ilave edilmektedir. E ile inoküle E. coli (lacZ - / galE -) 25 ve 240 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. </li></ol></li><li> Gün 1: Alt-kültür hücreleri, <ol><li> Taze LB&#39;de, (herhangi bir antibiyotik) &#39;de bir gece boyunca kültür 100 seyreltme: 1 hazırlanması Alt-kültür hücreleri. Alt-kültür 8 ml bir hacmi örnek başına gereklidir. OD 600 = 1 kadar, yaklaşık 3.5 saat boyunca 240 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> OD 600 = 1, 10, 15 ° C&#39;de 1300 x g&#39;de bölme hücre 50 ml tüpler içinde düzgün bir şekilde süspansiyon ve santrifüjmin. Süpernatantı ve (örneğin,., Numune başına 4 mi) LB 10 mM MgSO 4 içeren orijinal hacminin yarısına hücreleri yeniden askıya. [Adımı 6.2.4.3] ihtiyaç kadar bir kenara hücreleri koyun. </li></ol></li><li> Gün 1: Lambda faj DNA Parçacıklar Ambalaj <ol><li> 30 ° C su banyosu Isınma. </li><li> Geniş çaplı bir 10 ul pipet, 1.5 ml&#39;lik bir tüpe transfer 4 ul DNA kullanılarak ölçülür. Not: Bu adım hazırlama süresini azaltmak için önceden bir gün ya da daha fazla gerçekleştirilebilir. </li><li> Bir faj ambalaj özü kiti ilk tüp (kırmızı) (her 2 numuneler için 1 tüp) ısıtın. Kısaca tüpün dibinde özü toplamak için dönerler. </li><li> DNA örneği için, birinci boru ikinci ambalaj ekstresi 4.8 ul aktarın ve pipet ucu ile yumuşak bir şekilde karıştırma ile karıştırılır. Kısaca tüplerindeki numuneleri aşağı doğru döndürün. 30 ° C su banyosunda 1.5 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Ikinci (mavi) ambalaj özü tüp (~ 15 örnekler için 1 tüp) ısıtın. Kısaca altındaki özü toplamak için dönmeyetüp. </li><li> DNA örneği ikinci tüpten ambalaj ekstresi 4.8 ul aktarın ve yumuşak bir şekilde karıştırma ile karıştırılır. Kısaca tüplerindeki numuneleri aşağı doğru döndürün. 30 ° C su banyosu içinde ek bir 1.5 saat boyunca kuluçkalayın. </li><li> 500 ul SM tamponu içinde faj parçacıkları yeniden askıya ve 20 rpm&#39;de 30 dakika boyunca döndürülerek karıştırılır. </li><li> Tüplerin dibinde örnekleri toplamak için 30 saniye boyunca 11.000 xg, kısaca vorteks örnekleri ve santrifüj döndürdükten sonra. Faj parçacıkları enfeksiyon [adım 6.2.4] için hazırız. </li></ol></li><li> 1. Gün: En Agar hazırlayın <ol><li> Titre plakaları ve bir mutasyon seçimi plakaları ayrı ayrı üst agar hazırlayın. Her numune 4 titre tabak ve 4 mutant plakaları gerektirir. Her bir plaka 8 mi üst ağarı gerektirir. Sadece ağar bir mutasyon seçimi üst seçici maddesine fenil-β-D-galaktopiranosid (P-Gal) ekleyin. Her iki üst Agarların önceden (deney günü) hazırlayın ve her iki üst jelöz için MgSO 4 eklemeden önce 50 ° C &#39;de muhafaza ve PGark seçimi agar mutantrepresor. </li></ol></li><li> 1. Gün: faj ve Kaplama ile bulaşıyor Hücreleri <ol><li> Numune başına iki adet 50 ml tüpler Etiket: numune başına 1 &quot;mutant&quot; tüp ve örnek başına 1 &quot;titre&quot; tüp </li><li> Numune başına 4 &quot;mutant&quot; levhaları ve numune başına 4 &quot;titre&quot; plakaları: numune başına agarlar Etiket 8 </li><li> Kısım her bir tüpe [6.2.1.2 ikinci aşama] yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 2 mi. </li><li> Için &quot;Mutan&quot; 50 ml tüp (ihtiva eden hücreler) [6.2.2.8 ikinci aşama] faj partiküllerinin 500 ul ilave edin. , Yavaşça karıştırın ve faj partikülleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücrelerini enfekte etmek için izin verir. </li><li> 30 dakika sonra, kısa bir süre için girdap hücreleri enfekte edilmiş ve (hücresi içeren) için uygun olan, 50 ml &quot;titre&quot; tüp üzere enfekte olmuş hücreler 15 ul transfer. </li><li> Plaka titre örnek, sıcak (50 ° C) &quot;titre&quot; üst agar içeren (NOT P-Gal) için &quot;titre&quot; 50 ml tüp 30 ml ekleyin. Hemen distrib4 &quot;titre&quot; plakalar arasında ute ağar / hücre karışımı (~ plaka başına 8 mi) hazırlandı. Üst agar pipetler serin ve hava kabarcıkları tanıtmak için çalışmaz o kadar hızlı çalışın. </li><li> Yanındaki &quot;mutant&quot; örnekleri Plate. P-Gal &quot;mutant seçimi&quot; üst agar eklenir emin olun. Sıcak &quot;mutant seçimi&quot; agar içeren (P-Gal) için &quot;mutant&quot; 50 ml tüp 30 ml ekleyin. Hemen (~ plaka başına 8 ml) içinde 4 &quot;Mutan&quot; plakalar arasında, agar / hücre karışımı dağıtın. </li><li> Plakalar daha sonra (~ 15 dakika) ters kuvvetlendirmek ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe izin verin. </li></ol></li><li> 2. Gün: Sayma Plaketler <ol><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, mutant ve titre plakaları üzerinde plakların sayısını. Istilanın sayıda için, toplam sayısını tahmin etmek için plakanın sadece bir kısmını sayısı (örneğin,. Genellikle ¼ titre plakasının 100-200 arasında plaklar olacaktır). 100 istilanın az zaman cou plaka başına sayılmalıdırbitiş levhasının bir bölümünü nting. </li><li> Hücre ul başına plak oluşturucu birim (pfus) sayısını hesaplayın. Bu kaplama hücrelerinin hacminin (15 ul) ile &quot;titre&quot; plakaları üzerinde bakteri sayısını bölünmesi ile yapılır. </li><li> / Ul &quot;Mutan&quot; plakaları (pfus / ml * üzerine kaplanmıştır enfekte olmuş hücrelerin toplam hacmi pfus sayısını tahmin etmek pfus sayısını kullanarak [2 mi hücreler + 0.5ml faj partikülleri - titre plakaları 15 ul] ). </li><li> &quot;Titre &#39;plakaları tespit enfekte olan hücrelerin toplam hacmi pfus tahmini toplam sayısına göre 4&quot; Mutan &quot;plakaları üzerinde sayıldı mutant plakların toplam sayısına bölünmesiyle MF tahmin. </li></ol></li><li> Bu MutaMouse germ hücreleri için, OECD kriteri hayvan olmak ekran başına 125,000 ila 300,000 mutant olmayan pfus miktarı minimum olarak kendiliğinden lacZ MF, kontrol grubunda 3 x, 10&#39;dan -5, mertebesinde olduğu zamanGüvenilir bir temel sinyal elde etmek için mutasyon için ed. Diğer transjenik modelleri pfus daha fazla sayıda gerekli olacaktır ki bu durumda daha düşük spontan MF sahip olabilir. Bir istatistiksel güç testi istenen çözünürlüğü elde etmek için gerekli pfus ve hayvanların asgari sayısını belirlemek amacıyla yapılabilir. Birden çok kez tekrarlanmış olan veriler, bu en az bir PFU gereksinimi karşılamak için toplanmış önemli ölçüde farklı mutant frekansları üretmek yok edilebilir. </li></ol> 7. İstatistik Analiz için deneysel birim faredir. Bu testte üretilen veriler genellikle normal dağılım değildir. Bu nedenle, verilerin dağılımı özelliğine göre istatistiksel analizi için bir yöntem seçin. Not: Uygun bir veri dönüştürme Observa aralığı boyunca yanıtın varyans eşitlemek için uygulandığı takdirde standart parametre analizi (örn., ANOVA) kullanılabiliryon. Poisson veya binom regresyon analizleri genellikle daha uygundur. Parametrik olmayan analizi de kullanılabilir. Rutin genel lineer model prosedürü kullanılarak Poisson regresyon modeli kullanır (yani. Proc GENMOD) Lemieux ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 26 SAS olarak v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC).

<ol>
	<li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa.">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li><li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins,+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation.">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li><li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants.">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father's+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation.">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage.">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities.">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li><li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens.">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals.">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li><li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+mutations+in+mice.">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li><li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+mutagens:+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century.">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li><li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide:+A+cooking+carcinogen.">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li><li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay.">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li><li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen.">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li><li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus.">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li><li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci.">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li><li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population.">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li><li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species:+Cautious+optimism.">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li><li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene:+Evidence+for+in+vivo+rearrangements.">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li><li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays.">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).</li><li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice.">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li><li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency,+nature,+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse.">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice.">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).</li><li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids.">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li><li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+benzo[a]pyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations,+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse.">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li><li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice.">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li><li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia.">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li><li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system.">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li><li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+induced+male+germline+mutation:+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays,+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays.">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, TGR germ hücre mutasyonu tahlil vivo germ hücre mutasyonlarının uyarılmış nicel daha hızlı, daha ekonomik ve daha duyarlı bir araç sağlar. Yavrular hayvan sayısı aksine, doğrudan sperm transgen MF değerlendirerek, tek bir zaman ve bileşik germline gen mutasyonu değerlendirmek için gerekli kaynak önemli ölçüde azalır. Duyarlılık açısından, biz doz grubu başına sadece 5 hayvanları kullanılarak 25 mg / kg TRK maruz aşağıdaki spermatogonium kök hücre MF önemli bir 2.6 katlık bir artış tespit başardık. Buna karşılık, belirli odağı tahlil kullanarak bu aynı dozda MF herhangi önemli bir değişiklik&gt; maruz kalan grupta 3.000 fareler ve&gt; 500.000 kontrol fareleri 28 algılayamadı. Hem mekanik ve düzenleyici araştırmalar için uygun olması ek olarak, bu yöntem, somatik ve germ mutasyonlarına arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar için bir fırsat sağlaroranları. Son kanıtlar, somatik mutasyon için gerekli olandan daha bazı maddeler için germ hücre mutasyonlar daha düşük bir konsantrasyonda neden olabileceğini düşündürmektedir. Örneğin, N-hydroxymethylacrylamide uzun süre maruz kalma, gıda kanserojen akrilamidin 12 bir metaboliti, kırmızı kan hücreleri mikronükleus frekansı, somatik hücre sitogenetik hasar 13 geleneksel bir ölçü etkilemeden farelerde baskın öldürücü germ hücre mutasyonların sıklığı artar. Ayrıca, kan mikronukleus frekansı 14 artış yok dozlarda sperm tandem tekrar DNA loci hem ana akış ve yan tütün dumanı nedenleri yüksek mutasyon frekansları farelerin maruz kalma. Bu bulgular somatik genotoksisite testleri her zaman mikrop koruyucu varsayıma meydan ve germ hücre mutasyonu sıklığını ölçmek için daha verimli ve maliyet-etkin yöntemlerle talebi güçlendirmek. Ancak, tercihli germ hücreli mutajen için kanıt hala zayıf, Büyük ölçüde somatik ve germ hücre dokularında mutasyon oranlarını karşılaştırarak için kullanılabilir veri eksikliği. TGR mutasyon deneyi paralel test ve aynı transgenini kullanarak birden dokularda oluşturulan mutasyon oranları karşılaştırılmasına olanak sağlar. Nitekim, karşılaştırmalı mutasyon tercihli germ hücreli etkileri olasılığını çevreleyen veri boşlukları doldurmak yardımcı olacağını TGR testi kullanılarak test. Düzenleyici test için somatik ve germ hücre mutasyon aynı anda değerlendirmesi aynı zamanda gerekli hayvan sayısını azaltarak verimliliğini artıracaktır. Somatik mutasyon OECD rehber üç gün örnekleme zamanı (+ 3 28) tarafından takip 28 günlük yönetim süresini önerir. Spermatogenez spermatosit ve spermatid fazlarında (Şekil 3) sırasında çoğunlukla maruz kalan hücrelerini hedefleyen beri kauda sperm analizi, bu zaman noktasında duyarlılığı zayıf sunabilir. Bu aşamada hücreler DNA sentezlemek ve giderek DNA onarımı 6 kapasitelerini kaybetmezler &lt;/ Sup&gt;. Ayrıca, bu zaman noktasında örnekleme KES sperm spermatogonia ve kök hücreleri meydana gelen mutasyonları tespit etmek için başarısız olur. Böylece, 28 + 3 tasarımı entegrasyon için, OECD rehber seminifer tübüllerde germ hücreleri toplamak önerir. Bu karışık bir popülasyon, DNA sentezi ve kök hücreleri dahil olmak üzere tamir yetkin hücre tipleri, türetilen hücreleri içerir ve spermatojenik fazların çoğunluğu boyunca maruz kalır. Ancak, bu hücrelerin karışık doğası nedeniyle, seminifer tübüller hücre analiz aşaması özel bilgi vermez. Ayrıca, hedef olmayan hücrelerin varlığı görülmektedir MF etkileyebilecekleri endişe vardır dolayı (örneğin, DNA onarımı eksik germ hücrelerinde mutasyona uğramış bir germ hücre sinyalinin mutasyona uğramış somatik hücrelerin kirlenmesi ya da seyreltme için yanlış pozitif tohum hücresi bir mutajen çağrıları) . Şu anda sonuçlandırmak için yeterli veri olup olmadığını 28 + 3 teklif aynı duyarlılık ve özgünlüğü bir de seminifer tübüller hücrelerden sonuçlarsonraki zaman noktalarında s kauda sperm. Laboratuvarımız şu anda bu noktayı ele almak için çeşitli örnekleme zamanları sonra toplanan seminifer tübüller hücreleri ve kauda sperm uyarılan MFS karşılaştırıyor. Biz, OECD kriteri bu da germ hücre analizi için uygun karaciğer gibi yavaş bölünmesi dokular için 28 günlük bir alternatif bir örnekleme süresi göstermektedir unutmayın. Bununla birlikte, mevcut veriler hala yetersiz olduğunu ve somatik hücre ve düzenleyici test için TGR mutasyon deneyi kullanılarak germ hücrelerinin eşzamanlı analizi için tek bir deneysel tasarım tavsiye edemiyoruz. Unutulmamalıdır Bu deneyde bir özelliği mutasyon olayları, murin olmayan transgenin değerlendirilir olmasıdır. Ancak, transgen endojen genlerin 20 benzer bir şekilde çevresel mutajen yanıt önermek için yeterli kanıt yoktur. İlave olarak, bağımsız bir mutasyon olayları, kesin kaynakların zordurgidermek sonuçlar genel (bir mutasyon sıklığı aksine) bir mutant frekansı olarak rapor edilir. Sonuçlar DNA dizilimi yolu ile (transgen mutantların gözlenen frekansına katkıda bulunduğu tek bir mutasyona uğramış hücrenin, yani. Bölünmesi ve çoğalması) klonal genişleme için düzeltilirse, gerçek Mutasyon frekansı çözülebilir. Bu zaman ve analiz maliyeti anlamlı ölçüde fazlalaştırır rağmen mutant transgenlerin dizilenmesi, lacZ mutasyonları temsil ederler ve klonal genişleme etkinlikleri türetilebilir mutantlann tespit edilmesi için gerçekleştirilebilir. Daha kısa (294 3021 bp&#39;lik bp&#39;lik lacZ v, Şekil 1) ve 29 sırası daha kolay λ CII geni, bir varyantını: lacZ genine ek olarak, theλgt10 transgenik vektör, alternatif bir sıcaklık bağımlı mutasyon raportör genini barındırmaktadır. Dizilenmesine de mutatio ilişkin bilgi temin bağlı mutasyon spektrumunun analiz edilmesini sağlarSöz konusu bileşiğin nal mekanizması. Klonal genişleme uç bir örnek &quot;jackpot&quot; mutasyon oluşumu (yani., Transgen bir dramatik yükseltilmiş MF katkıda bir organın gelişiminin çok erken bir aşamada mutasyonlar, bazen yüzlerce arka plan daha fazla binlerce kat). &quot;Jackpot&quot; mutasyonu ile hayvanlar ya da dokuları analiz çıkarılmalıdır. Tanımladığımız deney, (20 gözden geçirilmiştir) &#39;e benzer bir mutasyon raportör vektörü barındıran her biri BigBlue fare ve sıçan ve lacZ plazmid fare gibi diğer tgr modeller için geniş çapta uygulanabilir. Benzer yöntemler kullanmaktadırlar bugüne kadar yapılmış germ hücre çalışmalarında büyük çoğunluğu bu TRK ve (30 gözden) radyasyon gibi neredeyse sadece üzerinde iyi karakterize mutajen odaklanmıştır. Bu tgr deneyi için OECD Test kılavuzun yayınlanması ile birlikte, bu deney olacağı beklenmektedirkimyasal tarama ve düzenleyici değerlendirme için giderek daha popüler. Bir düzenleyici test pilin içine TGR germ hücre mutasyonu tahlil Ortaklığın germ hücreleri 11 mutasyon indüksiyon verimli değerlendirmesini izin vererek, mevcut boşluğu dolduracak. Ayrıca, bu deney, aynı genetik uç noktalarında çevresel faktörler tarafından mutasyon indüklenmesine somatik hücreleri ve tohum hücreleri göreceli hassasiyetleri karşılaştırmak için uygun bir araç temin, hemen hemen herhangi bir dokuda MF ölçmek için kullanılabilir.

Germlin sporadik DNA mutasyonları azaltılmış üreme başarısına yol açabilir ve, miras varsa, yavrular 1-3 kansere genetik hastalık veya artan yatkınlık neden olabilir. Deliller de novo mutasyonlar büyük bir kısmı baba germlinlerinden 4 miras olduğunu gösteriyor ve yavrularda mutasyonların sayısının olumlu anlayışının 5 zamanında baba yaşı ile ilişkili olduğunu. Erkek mutasyonlar daha yüksek oranda cinsiyetler arasındaki gametogenezde sırasında yaş farkı bir sonucu olduğuna inanılıyor, kadın germline&#39;a 2 oogenic hücre bölünmeleri sayısı ile karşılaştırıldığında Spermatogenik hücre bölünmeleri daha fazla sayıda ve DNA ilerici bir düşüş Erkeklerde yaş ile verimliliği onarın. Tüm bu faktörler erkek Germlin 6 çoğaltma hatalarını artan bir olasılık katkıda bulunur. Ancak, baba maruz kalma etkisi Enviro içinnovo mutasyonlar frekansına nmental faktörler hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, çevresel etkenlere, çok sayıda kemirgenlerde 7 germ hücreli mutasyonu sağlamak bilinir, ve bu maddelerin bir kısmı, aynı zamanda, insan eşey hattı 8 etkileyebilir montaj kanıt vardır. Bu endişelere rağmen, kimyasal rutin düzenleyici amaçlarla somatik hücrelerinde mutasyona uyarabilme özellikleri açısından test edilir ve genellikle somatik testleri mikrop hattı korumak için yeterli olduğu varsayılmaktadır. Bu nedenle, kimyasal nadiren germ hücre mutasyon indükleme kabiliyetleri bakımından değerlendirilir. Bir nedeni germ hücre mütagenliği test edilmesi büyük ölçüde düzenleyici karar verme sürecinde ihmal edilmiştir pratik metodolojileri bir eksikliğidir. Böyle baskın 9 ölümcül ve belirli odağı 10 testler gibi geleneksel kemirgen-tabanlı yöntemler, embriyolar veya çocuklarında mutant fenotipleri puanlama tarafından germ hücre mutasyon oranları tahminmaruz anne. Bu deneyler, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için hayvan, zaman ve kaynak çok sayıda kullanılmasını gerektirir. Germ hücreli mutasyona ölçülmesi için birkaç modern yöntemler son zamanlarda ortaya çıkmış olsa da, birçok onların pratiklik, verimlilik, ve biyolojik alaka açısından eksiklikleri muzdarip. Örneğin, genişletilmiş basit tandem repeat (ESTR) loci uzunluğu mutasyon tekrar tek bir molekülün PCR yaklaşımı 15 kullanılarak erkek germ hücreleri belirlenebilir. Bununla birlikte, bu yöntemin yürütülmesi teknik olarak zor ve zahmetli olabilir ve nokta mutasyonları, farklı olarak, yüksek ölçüde kararsız ESTR lokusların tekrar uzunluğu değişikliklerin, biyolojik, sağlık ve önemi belirsiz 16 kalır. Kalıtsal mutasyonlar 4,17 sorununa uygulandığında Modern tüm genom dizileme teknolojileri biyolojik olarak anlamlı bir veri zenginliği sağlayabilir, ancak yüksek maliyet, yüksek hata oranları, ilgili doğrulama gereklimutasyonları teyit ve biyoinformatik zorluklar hala bir düzenleyici test kapasitesi 18 bu seçeneğin rutin uygulama sınırlamak için. Burada, transgenik erkek farelerin tohum hücreleri içinde doğrudan uyarılmış mutasyonlar miktarının belirlenmesi için pratik bir yöntem tarif eder. Bu protokol, kromozom 3 19 (Şekil 1) her iki kopya entegre bir Escherichia coli LacZ raportör geni ihtiva eden bir rekombinant faj λgt10 vektörünün çok sayıda birleştirilmiş kopyaları içeren transjenik MutaMouse modeli tarif edilmiştir. Bu protokol ayrıca aynı ilkeler (BigBlue fare ve sıçan, veya lacZ&#39;dir plazmid fare, vb.) Ya da biraz farklı raportör genler (gtp delta fare ve sıçan dayalı diğer transgenik kemirgen (TGR) modelleri alakalı, TGR modelleri Lambert et gözden ark. 20). Bu yöntem, son zamanlarda piyasaya tarif tgr mutasyon deneyine dayanmaktadırve OECD Test Klavuzu 21 revize ve biz nedeniyle spermatogenez eşsiz özelliklerinden erkek Germlin mutasyonların değerlendirmesini karşılamak için gerekli özel hususlar üzerine koyuyoruz. Kısaca, tahlil öncesi lezyonlar mutasyon mutasyonu kararlı içine sabit bir örnekleme zaman takip eden bir mutajenik madde ile transgenik erkek farelere verilmesi, ışığa maruz bırakılır. Seçilen örnekleme zamanda, fareler öldürülür ve germ hücreleri kauda epididimis ya da seminifer tüp ya da toplanmıştır. Aşağıda tartışıldığı gibi, spermatogenez farklı aşamalarında mutajenik etkileri maruziyet ve örnek toplama arasındaki zamanı seçerek belirlenebilir. Hücre başına λ faj genomunun birden çok kopyasını içeren transgenik uçları, germ hücre genomik DNA izole edilmiştir ve daha sonra bir E. enfekte etmek için kullanılır bulaşıcı λ fag parçacıklarını oluşturmak boş λ faj kapsidleri halinde paketlenmekte coli konakçı. Enfekte edilmiş bakteriler selec yetiştirilmektedirvahşi tip lacZ barındıran hücrelerden lacZ mutasyona uğramış bir kopyası olan bir vektör içeren hücreler ayırabilir tive ortam. Erkek germline maruziyetin mutajenik etkisi (Lambert et al. Bölgesindeki 20, Şekil 2) kontrol ve tedavi edilen fareler arasındaki mutan transgenlerin frekansı karşılaştırılarak belirlenir. Germ hücre sayıda gerekli hayvan sayısını azaltırken, geleneksel yöntemlere göre, bu deney, üstün hassasiyet sağlayan, tek bir fare test edilebilir. Hiçbir özel ekipman veya eğitim gereklidir çünkü bu deney, en modern toksikoloji / moleküler biyoloji laboratuvarlarında germ hücre mutasyonu testi için pratik ve etkili bir seçenek sağlar. TGR germ hücre mutasyonu tahlil etkin uygulanması için bir temel gereksinim spermatojenik döngüsü (Şekil 3) bir anlayıştır. St ilerleme fare germ hücrelerinde zamanıSonunda spermatogonium spermatositler, spermatidler, ve seminifer tübüllerde em hücreleri (yani. spermatogenez) yaklaşık 49 gündür epididimde sperm olgun. Mutasyon Bu döngüsünün çeşitli aşamalarında meydana gelebilir ve genellikle bileşik özgüdür edebilirsiniz. Erkek germ hücreleri mutajenesise özellikle önemlidir iki temel özellikleri erken mayoz sırasında DNA sentezinin bırakma ve geç post-mayoz sırasında DNA onarım kapasitesi 6 ilerleyici kaybı, bir indüksiyon ve tespiti için gerekli olan iki süreçler çoğu mutasyonlar. Çünkü Spermatogenezisin bu eşsiz özellikleri, TGR germ hücre mutasyonu tahlil yürütülmesi için üç kritik deneysel değişkenler vardır: (1) test bileşiği uygulama zamanı; (2) numune alma süresi; ve (3) ile germ hücre popülasyonunun seçimi analizi (Şekil 3 ve Tablo 1) için toplayın. Uygulama süresi olan experimeUzun hedef hücreler, test bileşiklerine maruz şeklini belirler ntal değişken. Uygulama süresinin uzunluğu, aynı zamanda belirli bir hücre tipi veya spermatogenez fazlarına maruz hedeflemek için kullanılabilir. Örneğin, tek bir uygulama için uygun şekilde belirli bir hücre tipine bağlı akut maruz kalma etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Benzer şekilde, Etki sadece meiotically bölünmesi sperm hücrelerine hedefleyen ya da mitotik 2 hafta yönetim süresi ve uygun bir örnekleme süresi kullanılarak spermatogonium bölünmesi, örneğin bütün bir spermatojenik faza odaklanabilir. Kronik ve alt kronik uygulanması kez test bileşiği yeterli farmakokinetik dağılımını sağlamak, ya da 28 günlük uygulama süresi, OECD testi önerilen örneğin zayıf mutajenler mutasyonların yeterli bir birikimi (izin vermek için, uzun süre maruz kalma etkilerini değerlendirmek için kullanılır kılavuz). Numune alma zamanı belirlemek için kritik bir değişken olduğunu hangispermatogenez faz hedef hücrelerin maruz kalma sırasında vardı. Örnekleme süresi ne kadar zaman dikte, ve bu nedenle ne kadar fazla spermatojenik döngüsü boyunca, hücrelerin maruz kaldıktan sonra geçer. Örneğin, kök hücre spermatogonyumlarda etkilerini araştırmak için, bir örnekleme zaman&gt; 49 gün&gt; 42 gün tam olarak olgunlaşmış sperm toplamak gerekirse, veya tüm hücreler toplandı için yeterli zaman vardı emin olmak için, seminifer tübüllerin gelen immatür germ hücreleri toplamak eğer maruz gelişir hücreleri kaynaklanıyor. Bu, en az 70 günlük bir örnekleme süresi spermatogenez sonraki aşamalarında maruz kalan hücrelerin ortadan kaldırılması için, bir toksik madde farmakokinetik: dağıtılmak için yeterli zamanı sağlamak için doğru sap hücresi etkisini göstermek için tercih edilir, ve hesaba dikkat etmek önemlidir yüksek mutajenik bileşiklerin 22 maruz kaldıktan sonra ~ 6 hafta oluşabilir geçici kısırlık dönemi. Benzer şekilde, 21 günlük bir örnekleme süresi sperm colle sağlayacakkauda epididimden cted sadece maruz kalma son gününde mayoz tamamlamış olurdu. Germ hücreleri, KES epididimden veya seminifer tüp çeşitli spermatojenik hücre tiplerinin bir karışımı gibi olgun sperm toplanabilir. Olgun spermlerin doğruluğunda sperm herhangi bir deney dizaynı oluşturulduğu spermatogenez hücre tipi ya da faz ile tespit edilmesini mümkün kılar, ~ 3 gün boyunca cauda kalır. Böylece, kauda sperm izinlerin analizi çok sahne özgü mutasyon etkileri soruşturma hedeflemiştir. Öte yandan, seminifer tüp toplanan hücre süspansiyonları, farklı gelişim safhalarında farklı germ hücre tiplerinin bir karışımını içerir ve bu şekilde mutasyon kökenli olan spermatojenik fazın düşük çözünürlüğe sahiptir. Buna ek olarak, seminifer tüp geri kazanılan hücre süspansiyonları, bir spermatositler ardından spermatidlerin aşırı temsilini, VER içeren eğilimiy birkaç spermatogonia ve kök hücreler (bu oranlar Şekil 3&#39;te mezun beyaz çubuklar tarafından temsil edilmektedir). Ayrıca, seminifer tüp hazırlanır süspansiyonlar da farklı somatik hücre içerebilir. Pek çok hücre tipinin mevcut olduğu için nedenle, mutasyonel etkileri hedef olmayan çeşitli hücreler tarafından etkilenebilir. Ancak, seminifer tübüllerin numune toplama aynı anda birden fazla germ hücre tiplerini ve somatik mutasyon için standart OECD test protokolüne germ hücre analizi kolay entegrasyon taranması için ekonomik bir seçenek sunuyor. Araştırmacı, uygulama süresi, örnekleme zamanında ve toplanan hücre popülasyonunun ihtiyaçlarına bağlı olarak, önce belirtildiği gibi çeşitli hücre tiplerinde ve spermatogenez farklı aşamalarında ne etkilerinin sorgulamak için ayarlanabilir. Dikkatli Bu değişkenleri seçerek, deney, ya da daha genel bir düzenleyici test için hedeflenen mekanik çalışmalar için tasarlanabiliramaçları ing. Deneyde yeterlilik elde etmek için, 70 günlük bir örnekleme zaman pozitif kontrol olarak, ardından / kg N-etil-N-nitroso 100 mg (TRK) akut oral uygulama kullanımını tavsiye edilir. Kauda sperm analizi böylece genellikle TRK bu son derece mutajenik dozu takiben kontroller üzerindeki mutant frekansı (MF), 4-5 kat artış sergileyen spermatogoniyal kök hücreleri (Şekil 3), hedefliyor. Bu nedenle daha kısa örnekleme zamanları için uygun bir kontrol bir doz olabilir, bu doz sterilite 6 hafta maruz kaldıktan indüklediği bilinmektedir olduğu not edilmelidir. Bu doz, aynı zamanda en çok somatik dokulardaki 20 MF tespit edilebilir bir artış üretecektir. Aşağıda sunulan sonuçlar temsili için ve 100 mg / kg dahil olmak üzere, üç TRK dozları kullanılarak akut 70 maruz rejimi aşağıdaki üretilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Hayvan başına 200.000 plakların ortalama plak sayımı ile, biz genellikle bizim kontrol gruplarında 1,7 x 10 -5 bir standart sapma ile yaklaşık 2,8 x 10 -5 erkek germ hücreleri ortalama arka plan MF gözlemlemek (bağımsız sekiz verilere dayalı deneyler). N = 5 hayvan ile plak sayısı, arka plan düzeyi ve varyans, doz gruplarının her gücü&gt; 0.8 MF 2 kat artış ile tespit etmek için yeterlidir. Sonuçlar, tipik olarak Tablo 2 ve Şekil 6, tek bir 0 akut oral doz, 25, 50 maruz MutaMouse erkeklerin KES sperm (grup başına n = 5) için temsili sonuçlar göstermektedir. Tablo veya grafik biçiminde bildirilmiştir, ve 100 mg / kg&#39;dan 70 gün örnekleme zamanı ile takip ettiği N-etil-N-nitroso (TRK). Bu 70 günlük süre maruz kalma sırasında spermatogoniumların hücreleri, sperm meydana gelen mutasyon olaylar ölçümü (bakınız Şekil 3 izin verir). Mutant ve titre plakaları üzerinde tipik yoğunluklar, plak, Şekil 7 &#39;de gösterilmiştir. Tablo 2 ve Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, akut TRK maruz spermatogoniumların MF bir doza bağlı olarak belirgin bir artış uyarmıştır. Düşük doz 2,6 x 10 -5 bir başlangıç ​​MF kontroller üzerinde önemli bir 2.6 kat artış, uyarılmış. En fazla indüksiyon kontroller üzerinde bir 4.4 kat artış ortaya yüksek dozda meydana geldi. Seminifer tübül germ hücreleri üzerinde yapılan bu tayinin bir örneği, Douglas ve ark. 27 MF / kg TRK 50 mg 5 günlük tekrar intraperitonal enjeksiyonu takiben çeşitli zaman aralıklarında borucuk tohum hücreleri içinde tespit edilmiştir bulunabilir. Bu çalışmada, erkek seminifer, hücrelerde mutant frekansları tedaviden sonra 15 güne kadar artmış ve daha sonra sabit kalmıştır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> ExpoEmin rejimi </td><td> Toplanan doku </td><td> Toplanan hücre tipi (hedef hücre) </td><td> Maruz başında hedef hücrenin Aşama </td><td> Aşama pozlama sırasında geçti </td></tr><tr><td> Akut + 70 </td><td> Kauda </td><td> Olgun sperm </td><td> Kök hücre </td><td> Kök hücre </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Kauda </td><td> Olgun sperm </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 +35 </td><td> Kauda </td><td> Olgun sperm </td><td> Kök hücre </td><td> Spermatosit </td></tr><tr><td> 28 ± 3 </td><td> Kauda </td><td> Olgun sperm </td><td> Spermatosit </td><td> Spermatosit Spermatid Olgun sperm </td></tr><tr><td></td><td> Tübüller </td><td> Kök hücre </td><td> Kök hücre </td><td> Kök hücre </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatosit </td><td></td><td> Spermatosit </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 ± 49 </td><td> Kauda </td><td> Olgun sperm </td><td> Kök cel </td><td> Kök hücre </td></tr><tr><td></td><td> Tübüller </td><td> Kök hücre Spermatogonia Spermatosit Spermatid </td><td> Kök hücre </td><td> Kök hücre </td></tr></tbody></table> Çeşitli deneysel tasarımlar ile transgenik kemirgen mutasyon deneyi ile hedeflenen Tablo 1. Hücre tipleri ve spermatogenez aşamaları. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Doz grubu </td><td> Hayvan # </td><td> Mutant PFU </td><td> Toplam PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> Ort MF (x 10 -5) </td><td> Kat değişiklik </td><td> p-değeri </td></tr><tr><td> Kontrol </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180.245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385.672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431.396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6,9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196.978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135.847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252.807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 mg / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170.968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234.584 </td><td> 11,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145.289 </td><td> 6,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292.236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. transgenik erkek m kauda sperminin acZ mutant frekansıonlar spermatogonial kök hücreler (= 1 gün uygulama zamanı, örnekleme süresi = 70 gün) iken buz TRK için akut maruz. PFU plak oluşturma birimi, MF = mutant frekansı =. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> Şekil 1. λgt10 faj yapısının şematik bir temsili. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> Şekil 2. transgenik kemirgen germ hücre mutasyonu tahlil bir taslak. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> Şekil 3. fare, spermatogenez ve hücre tipleri ve PHA şematik bir diyagramıÇeşitli deneysel tasarımları ile transgenik kemirgen mutasyon analizi ile hedeflenen ES NOT.:. dereceli beyaz çubuklar seminifer tüp hazırlanan hücre süspansiyonları içinde mevcut hücre tipleri (örneğin, Spermatidler&gt; spermatositler&gt; spermatogonia &#39;&gt; kök hücreler) göreceli oranını temsil eder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">, lütfen Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> Fare kauda epididimde 4. Koleksiyonu Şekil. A)) skrotum. B&#39;ye doğru karında bir kesi olun yavaşça testisler ve epididim dışarı çekmek için yağ yastığı çekin) epididim yağ yastığı. C tanımlayın. D) bulun ve kauda epididimiti kesip. Seminifer tübüller germ hücrelerinin süspansiyon 5. hazırlanması Şekil. A) Bir kesi 5-10 ° açıyla seminifer tübüllerin kapsülün. C) bir doku rulo hafifçe tübüllerden üzerinden geçirilir dışarı sıkılmış seminifer tübüller. B) açığa testis epitel kapsül yapılır . D içinde ihtiva edilen tohum hücrelerine) germ hücre süspansiyonu daha fazla işlenmek üzere toplanır bırakın. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> MutaMouse sperm, lacZ, mutant frekans Şekil 6 grafiksel gösterimi (n = 5) TRK için kök hücreleri gibi akut maruz bırakılmıştır. AdetÜçgen bir hayvanın MF temsil eder. * p &lt;0.05 Poisson regresyon analizi ile belirlenmiştir. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> Plaklar ile transgenik bir kemirgen mutasyon çalışması Şekil 7&#39;de Örnek agar plakaları E. bir çim kurdu coli konakçı bakteri. A) &quot;mutant&quot; plakaları bazen bazı levhalar sıfır plaklar. B) &quot;titre&quot; plakalar plakların yüzlerce olabilir olacak özellikle kontrol doz gruplarında oklarla işaretlenmiş çok az plaklar (), sahip olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency at JoVE.com

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Görüntüleme.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Video: Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Biyoloji

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...