Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü uyuyan ve metastatik tümör hücre hatları bakım <ol><li> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) yüksek glukoz ve% 10 fetal sığır serumu (10 cm kültür plakaları uykuda (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) ve metastatik tümör hücrelerinin (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) büyütün FBS) ve antibiyotikler. Hücrelerin% 70-80 izdiham ulaştıklarında, aşağıdaki testleri geçin. </li></ol> 2. 3D BME sistemi atıl (latent) ve metastatik (prolifere) tümör hücreleri hücre proliferasyonu tayininde kültür 3D sistemi atıl / metastatik hücreler Kültürleme <ol><li> Tahlil yapılmadan önce, 4 çözülme Cultrex büyüme faktörü azaltılmış Bodrum Membran Extract (BME) ° C buzdolabında bir gece. BME her zaman buz üzerinde ele alınmalıdır. </li><li> Ertesi gün, 96 plaka laminar kaput içinde buz bir tepsi yerleştirin. Buz BME bir şırınga ile bir dağıtıcı kullanarak 50-100μl Coat her yanı. Kuyularda kabarcıklar oluşur emin olun. 30 dakika boyunca 37% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör BME ile kaplı 96 plaka ° C yerleştirin. </li><li> Bu arada uyuyan veya metastatik tümör hücrelerinin (Bölüm 1 hazırlanan) medya aspirat. Kültür plakaları, 10 ml fosfat tuzlu su, ph 7.4 (PBS) tamponlu ile durulayın. PBS ve eklemek 2ml tripsin 37 ° önceden ısıtılmış ° C, kültür plakaları aspire. 37 2 nemlendirilmiş bir% 5 CO plakaları ° C&#39;de, 5 dk. </li><li> 5ml% 10 FCS ve antibiyotikler ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz içeren 15 ml konik tüp hücreleri transferi ve hücreleri saymak. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 1500g bir hızda bir doku kültür santrifüj kültüre toplam hücre sayısı aşağı spin. Analizlerde incelenmek üzere, her bir hücre hattı ya da zaman noktası / 2x10 3 hücre hazırlamak. Ancak, bu kullanılan hücre hatları bağlı olarak değişebilir. </li><li> Süpernatantı dikkatlice aspire. Not Çoğu durumda, pelet görünmez. Bu nedenle, bazı medya geride bırakın. Bir tek hücre süspansiyonu elde olduğundan emin olmak için parmaklarınızı konik tüp 15ml alt dokunun. DMEM ile desteklenmiş antibiyotikler ile düşük glukoz ile pelet yeniden askıya% 2 FCS +% 2 BME (testi medya). 100 test medya ul her 2x10 3 hücreler için ilave edilmelidir. 5ml pipet yardımıyla tek bir hücre süspansiyonu muhafaza edilmesini sağlamak için hücrelerin birçok kez Karışım. </li><li> Plaka hücre karışımı 100μl başına 96 BME kaplı plaka üstüne. Arka plan değerlendirme (bölüm 2.8) ek 100μl plaka başına 96 iyi BME kaplı plaka üstüne sadece tahlil medya için. 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör kültürlü 96 kuyucuğu inkübe ° C. Hücreler test medya ile her 4 günde bir yeniden beslenen olmalıdır. </li></ol> Silahların Yayılmasını Önleme tahlil: <ol start="8"><li> Hücrelerin çoğalması tahlil: istenilen zamanda kuyuların eklemek Hücre titresi 96 sulu Bir Çözüm Hücre Çoğalması tahlil kiti 20 ul işaret ediyor. 2s için nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör 37 ° C&#39;de inkübe edin. 490nm bir Elisa Plaka Okuyucu kayıt absorbans kullanma. Hücre titresi 96 sulu Bir Çözüm Hücre Çoğalması tahlil kiti, BME ile kuyu öncesi kaplamalı arka plan değerlendirme ve çıkarma için 20μl ekleyin ve sadece tahlil medya ile kaplamış. Elisa Plaka Okuyucu kayıt absorbans 490 nm dalga boyunda kullanılması. </li></ol> 3. Ve / veya metastatik (prolifere) uykuda (latent) tümör hücrelerinin tümör hücrelerinin hücre sinyal molekülleri Immunofluorescent boyama Immunfluorescence boyama 3D sistemi kültür uykuda / metastatik hücreler * Aşağıdaki protokol Debnath J ve ark 18 tarafından yayınlanan bir 3D kültür protokolü bir değişiklik. <ol><li> BME bölüm 2.1 &#39;de açıklandığı gibi hazırlayın. Ertesi gün: 8 oda cam slayt sistemi laminar kaput içinde buz bir tepsi. 200μl Pipetman kullanarak buz soğuk BME 50ul Coat her yanı. BME yayılır ve kuyulardan kabarcıklar oluşur emin olun. 20 dakika süreyle 37 2 nemlendirilmiş bir% 5 CO BME ile kaplı 8 odasının cam slayt ° C yerleştirin. </li><li> Bölüm 1 ve bölüm 2.3-2.4 açıklandığı gibi kültür hazırlamak Hasat uykuda veya metastatik hücreler. 15 ml konik bir tüp içinde kültür hücrelerinin toplam sayısı toplayın. Biz, incelenmek üzere her hücre dizisi ve zaman noktası için / 5 x10 3 hücreleri hazırlarlar . 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, hücrelerin doku kültürü santrifüj 1500g bir hızda dönerler. Supernate dikkatlice aspire. Not pelet görünmez olduğunu, bu nedenle bazı medya geride bırakmak. Tek bir hücre süspansiyonu elde olduğundan emin olmak için parmaklarınızı konik tüp 15ml alt dokunun.Tahlil medya pelet yeniden askıya aldı. Test medya 400μl her 5x10 3 hücreler için ilave edilmelidir. 5ml pipet ile hücreleri birçok kez Karışım. Bu adım, tek hücre süspansiyonu muhafaza edilmesini sağlamak için çok önemlidir. </li><li> BME ile kaplı 8 odaların her birinin üstüne başına iyi hücre karışımı Plaka 400μl. 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör kültürlü 8 odaları cam slayt sistemi inkübe ° C. Hücreler test medya ile her 4 günde bir yeniden beslenen olmalıdır. </li></ol> Immünofloresan boyaması: <ol start="4"><li> İstenilen zaman noktalarında, medyanın üst tabakası aspire ve% 4 Paraformaldehit (PFA),% 5 sakkaroz ve% 0.1 Triton X-100 içeren fiksatif 200μl ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Fiksatif aspire ve oda sıcaklığında 25 dakika süreyle% 5 sakkaroz ve inkübe içeren% 4 PFA 200μl ekleyin. </li><li> Fiksatif aspire fosfat eklemek 400 ul her kuyuya tamponlu salin (PBS). Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBS aspire ve 400 μ PBS oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 0.05 Tween 20 içeren ekleyin. </li><li> % 10 eşek serum ya 200μl ile veya oda sıcaklığında 1 saat için% 3 (kullanılmak üzere bir çözüm, her bir birincil antikor için ampirik olarak tespit edilmelidir engelleme) BSA ile sabit hücreler engelleyin. </li><li> Engelleme çözüm aspire ve primer antikor 200μl (seyreltme için ampirik olarak kullanılmak üzere her birincil antikor tespit edilmelidir). % 10 eşek serum engellemek için ise% 10 eşek serum primer antikor seyreltilir ya da% 3 BSA engelleme çözümü ise% 3 BSA primer antikor sulandırmak. 4 gece primer antikor ile inkübe ° C. </li><li> Antikor aspire 400μl PBS ile 15 dakika boyunca kuyulardan yıkayın ve iki kez tekrarlayın. PBS aspire ve rodamin kırmızı (seyreltme ampirik olarak tespit edilmelidir) anti-ilgili-IgG konjuge eşek 200μl eklemek için alüminyum folyo ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe 8 odasına slayt kapsayacak. </li><li> 400μl PBS (Her yıkamadan 3x15 dakika) kuyular yıkayın. Aspire PBS. VECTASHIELD DAPI orta montaj monte edilmiştir. Karanlık oda sıcaklığında 40 dakika Kuru slaytlar. Slaytlar 4 ° C&#39;de 1 hafta süreyle saklanabilir Slaytlar karanlıkta saklayın. Resim mikroskopisi slaytlar. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1A 3D kültür uykuda D2.0R ve metastatik D2A1 tümör hücrelerinin çoğalması analiz bir örnek gösterilmiştir. Ise yüksek metastatik D2A1 hücreleri sadece 4-6 gün sonra hızla artmaya başlar uykuda kalır D2.0R hücreler, tüm deneysel, 14 günlük kültürü dönem boyunca (latent) uykuda. Prolifere olmayan diğer hücreleri çok hücresel parçacıklarının formu ise; uykuda ilk aşamasında, birçok hücre (Günde 4 Şekil 1B) 3-GE kültürü yalnız kalır. 3-GE kültürü proliferatif devletin atıl D2A1 hücreleri (Şekil 1B, 12 gün) geçiş hücre morfolojisi dramatik değişiklikler ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu testte ne faktörü test etmek için kullanılır / s onların uykuda devlet ortaya atıl D2.0R hücreleri tetikleyebilir ve ne faktörü / s, hareketsiz duruma geçiş D2A1 hücreleri engelleyebilir. Şekil 2, bir ajanın bir örnektir uyuyan bir proliferatif devlet geçiş D2A1 hücreleri engeller. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, miyozin hafif zincir kinaz (ML-7) belirli bir inhibitörü ile D2A1 hücre tedavileri, atıl bir durumda D2A1 hücreleri sürdürdü . 3D sistemi kültür uyuyan ve prolifere olan tümör hücrelerinin sinyal Hücre hücre sinyal molekülleri için immünofloresan boyama ile incelenebilir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, aktin stres lifler (yeşil boyama) oluşturan f-aktin filamentler reorganizasyonu ile takip D2A1 hücreleri (kırmızı boyama) miyozin hafif zincir fosforilasyon önemli bir artış dormancy den geçiş (1-4 gün) sırasında oluşur. proliferasyon (7 gün). Ancak, shRNA ya da belirli bir ilaç (ML-7) D2A1 hücre miyozin hafif zincir kinaz aktivitesini bloke D2A1 atıl bir durumda hücreler ve miyozin hafif zincir fosforilasyon ve f-aktin stres fiber organizasyonu (Şekil 4) inhibisyonu sonuçları korur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> Şekil 1 soliter tümör hücre dinlenmesi ve metastatik büyümeye geçiş çalışma in vitro model. A) 3-D Cultrex BME uykuda D2.0R ve metastatik D2A1 Silahların Yayılmasının Önlenmesi, n = 8 (ortalama ± SE). Üç deneyleri (* p ≤ 0.05) Temsilcisi sonuçlar. B) D2.0R ve D2A1 hücreleri Işık mikroskobu görüntüleri, 3-D Cultrex BME büyütme x20 kültüre .Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> Şekil 2. Dormansi (sessizliğini) D2A1 hücrelerin çoğalma miyozin hafif zincir kinaz (MLCK) inhibisyonu 3D kültür sistemi geçiş önlenmesi. 3-D Cultrex BME n kültür D2A1 hücre proliferasyonu ders = 8 (ortalama ± SE). Hücreler (kontrol) tedavi edilmemiş ya da belirli bir MLCK inhibitörü (ML-7, 5 mcM) ile tedavi edilen kültür 5 gün 48 saat başında. Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> Şekil 3. F-aktin yeniden yapılanma ile miyozin hafif zincir fosforilasyon dormancy den D2A1 hücrelerin proliferatif büyüme geçiş sırasında izledi. 8 oda cam slayt D2A1 hücreleri 3-D Cultrex BME kültüre edildi. Hücreleri sabit ve nükleer lokalizasyonu için DAPI (mavi), f-aktin Phalloidin (yeşil) ve çeşitli zaman noktalarında belirtildiği miyozin hafif zinciri (MLC-p) (kırmızı), fosforile formu karşı bir antikor ile boyandı. F-aktin ve MLC-p boyama (sarı) Birleştirme. MLC-p İfade dormansi (gün1 4) D2A1 hücreleri aktin stres lif oluşumu (oklar) takip proliferatif büyüme (7 gün) geçiş sırasında arttı. Mikroskopisi, büyütme X63. Beyaz çubuğu, 20 mikron eşittir. Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> Şekil 4. Kültür günde 48 saat başında, miyozin hafif zincir kinaz (MLCK) D2A1 hücreler aracılı f-aktin stres lif oluşumunu inhibisyonu D2A1 Hücreler (kontrol) tedavi edilmemiş, ya da MLCK (5 mcM ML-7) için inhibitörleri ile tedavi edilen 5 ya da şifreli veya MLCK shRNA ile tedavi ve miyozin hafif zinciri (MLC-p) (kırmızı), f-aktin (yeşil) ve çekirdekleri (mavi) fosforile formu için boyanmış. F-aktin ve MLC-p boyama (sarı) Birleştirme. Mikroskopisi, büyütme X63. Beyaz çubuğu, 20 mikron eşittir.

<ol>
	<li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models,+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy.">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li><li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors.">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases.">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations.">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site:+a+possible+contributor+to+dormancy.">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li><li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+solitary+metastatic+cells.">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells.">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li><li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+dormancy:+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer.">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li><li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li><li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target.">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li><li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth.">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tümör hücrelerinin metastatik büyümeye geçiş sönmüş bir devlet ya da sonucu dissemine korumak altında yatan mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir kalır. Bu fenomen, insan hasta 4,12 ve birkaç preklinik modellerde bu sorunu çözmek için geliştirilmiştir çalışma için son derece zor olmuştur . Bununla birlikte, in vivo ve ex-vivo tümör dormansi için model sistemler (1,12 gözden) karakterize edilmiştir. Ancak, tümör dormansi in vivo mod...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> DMEM yüksek glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM düşük glikoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Büyüme faktörü azaltılmış 3-D Cultrex Bodrum Membran Özü </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> 14-15mg/ml arasında protein konsantrasyonu </td></tr><tr><td> D2.0R ve D2A1 hücre hatları </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 ve K7M2AS1.46 hücre </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bir 8 odasının cam slayt sistemi </td><td> (Lab-TEK, Thermo bilimsel) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre titresi 96 sulu Tek Çözüm hücre proliferasyonu tahlil kiti </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD DAPI ile orta montaj </td><td> Vektör Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normal eşek serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Elisa Levha Reader </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> Kayıt 490nm </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss-EKK-510 </td><td></td><td> Büyütme X63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

Meme kanseri nüks genellikle kanserin hiçbir belirti bulunduğu uzun bir latent dönem takip ve metastaz primer tümörün çıkarılması ve adjuvan tedavi sonrası uzun yıllar kadar, klinik olarak belirgin hale olmayabilir. Bu olgunun olası bir açıklama, tümör hücrelerinin metastatik siteleri numaralı seribaşı geleneksel tedavilere dirençli ve 1-4 kez uzun süre atıl kalması olduğunu . Ikincil sitelerde, uykuda kanser hücrelerinin varlığı, ne prolifere ne apoptozis 5-7 geçmesi latent tek kişilik hücrelerinde daha önce açıklandığı gibi olmuştur . Dahası, bu tek kişilik hücrelerinde erken bir aşamada hastalığın ilerlemesi 8-10 primer tümörün yaygınlaştırılması ve hastaların kemik iliği, kan ve lenf düğümleri 1,4,11 büyüme tutuklandı ikamet gösterilmiştir. Bu nedenle, proliferatif bir devlet ya da geçiş dormansi düzenleyen mekanizmaların anlaşılması, hastalığın tekrarını önlemek için yeni hedefler ve müdahaleler keşfetmek için kritik öneme sahiptir. Ancak, mevcut model sistemler eksikliği, metastatik büyüme tümör dormancy den anahtarı düzenleyen mekanizmalar çözülüyor engel olmuştur. in vivo ve ex vivo tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesini çalışma model sistemler daha önce 1,12-14 tarif edilmiştir. Ancak bu model sistemler, gerçek zamanlı ve yüksek kapasiteli metastatik hastalık olarak prolifere yalnız uyuyan tümör hücrelerinin ortaya çıkması ne tetikler bir şekilde mekanistik anlayışlar var. Yakın zamanda (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) ya da uyuyan (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) veya proliferatif metastatik davranış sergileyen hücreler in vivo büyüme özellikleri modeli in vitro sistemde 3D ​​geliştirdik in vivo olarak. 3-boyutlu (3D) bazal membran ekstraktı (BME) kültüre, metastatik bir yerinde in vivo dormansi sergi tümör hücrelerinin in vivo metastatik hücreler son derece değişken sonra kolayca 3D kültür prolifere ise, latent kalır, ama nispeten daha kısa olduğunu göstermiştir sükunet, dönemleri. Daha da önemlisi, in vitro model sistem 3D kullanılarak biz ilk defa ECM kompozisyon uykuda tümör hücrelerinin proliferatif durumuna geçer ve in vivo çalışmalar 15-17 doğruladı olmadığını düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu nedenle, bu raporda açıklanan model sistem model tümör dormansi in vitro yöntem sağlar ve mikroçevresinin kaynaklanan proliferatif büyüme geçiş çalışma.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth at JoVE.com

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

In vitro sistemi değiştirilmiş 3-D sulandırılmış bazal membran birçok tümör hücre hatlarının büyüme özellikleri tümör hücrelerinin metastatik ikincil site uykuda veya proliferatif davranışı ile ilişkili olduğu<em&gt; In vivo</em&gt;.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

an-vitro-system-to-study-tumor-dormancy-switch-to-metastatic

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.7K Görüntüleme.  University of Haifa. In vitro sistemi değiştirilmiş 3-D sulandırılmış bazal membran birçok tümör hücre hatlarının büyüme özellikleri tümör hücrelerinin metastatik ikincil site uykuda veya proliferatif davranışı ile ilişkili olduğu In vivo.

Video: An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

İnsan Nöromusküler Sistem Eğitim Transkraniyal Manyetik Uyarım kullanımı

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Tıp

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Ambliyopi içinde Bastırma Ölçme ve Tedavisi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Demans çalışması için retina Imaging'i kullanma

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Vestibüler sistem çalışmaya farenin cerrahi Labyrinthectomy

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Sıçan DRG Sıkıştırma Modeli için Standartlaştırılmış Tuina Protokolü

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Yazar Spotlight: Tuina'nın Dorsal Kök Ganglion Ağrısının Sıkışması ile Sıçan Modelleri Üzerindeki Analjezik Etkisi  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Dorsal Kök Ganglion Ağrısının Sıkışması ile Tuina'nın Sıçan Modellerinde Analjezik Etkisi

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...

Bir In Vitro Sistem