Yazarlar onun mükemmel teknik yardım, konfokal ve zaman atlamalı mikroskopi konularındaki teknik danışmanlık için Andreas Wodarz ve Stephan Heermann&#39;ın için Chalid Ghadban teşekkür ederim. Yazarların herhangi için herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Bu çalışma Dres tarafından, Forschergruppe 942 Proje 2 (FOR942 BI 703/3-1) Alman Araştırma Kurumu (DFG) tarafından finanse edilmektedir. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Almanya) ve Tıp Fakültesi, Georg-August-Üniversitesi Göttingen, Almanya Araştırma Programı tarafından.

Bu yeni model, daha önce yayınlanan organotipik hipokampal beyin dilim yaklaşımın 9-12 bir uyarlamasıdır. Değişiklikler ve ilave kanser hücresi-beyin dokusu etkileşimlerini optimize etmek ve garanti etmek için tekrarlanabilirlik tanıtıldı. Çalışma gözden ve yerel etik kurul tarafından onaylandı. Hayvanlar Üniversitesi Tıp Göttingen&#39;de hayvan bakım kurallarına göre özenle tedavi edildi. Organotipik beyin dilim kokültürü iki adım ayrılabilir. Birinci adım Organotipik beyin dilim hazırlanmasıdır. İkinci adım kokültürü modelinde tümör hücre hazırlama ve birikmesini içerir. 1.. Organotipik Beyin Dilim <ol><li> 0.2 mM glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, ve glukoz 4.5 mg / ml ile takviye edilmiş minimum temel ortam (MEM), aşağıdakilerden oluşan diseksiyon orta hazırlayın. </li><li> Doğum sonrası günler arasında herhangi bir fare suşundan fareler başını kesmekAltı ve sekiz (P6-8). </li><li> Aseptik koşullar altında hızlı bir şekilde kafatası beyin çıkarın ve buz gibi soğuk diseksiyon ortamına aktarmak. </li><li> Bütün beyin bölümünden ön kutup ve beyincik çıkarın. </li><li> Düzeltmek ve kriyo tutkal ve 5% agaroz ile bir sahnede beyin stabilize. </li><li> Bir Vibratome kullanarak 350 mikron kalınlığında yatay beyin bölümleri dilimleyin. </li><li> Türler ve yaşına bağlı olarak, tek bir fare beyninden 05:56 tüm beyin dilimleri toplayın. </li><li> % 50 MEM oluşan kültür ortamı hazırlanır,% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS),% 25 normal at serumu (NHS), 0.2 mM glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin (Sigma, Münih, Almanya) ve 4.5 mg / ml glükoz. </li><li> Alt de kültür ortamı içinde 1 ml olan bir altı-çukurlu plaka içinde bir 0.4 um polikarbonat membran transwell uç üzerindeki her Organotipik beyin dilim koyun. </li><li> Bir nemlendirilmiş Kültür organotipik beyin dilimleri gecede37 ° C inkübatör% 5 CO 2 ile d atmosfer. </li></ol> 2. Dilim Coculture Modeli <ol><li> GFP ile transfekte edilmiş tümör veya başka hücrelerden% 15 RPMI ortamı ve% 85 ECM jel oluşan 20 ul jel matrisi içinde (örneğin, MCF-7-hücreleri GFP), 10 5, katıştırma. </li><li> Organotipik beyin dilim kortikal bölgede doğrudan bitişik steril bir metal ara parça (3.8 mm çap) MCF-7-jel matris karışımı koyun ve 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Boşluk çıkarın ve 3D tümör sfero 24-96 saat organotipik dilim ile Coculture sağlar. </li><li> Her gün kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 3. Organotipik Beyin Dilim Coculture içinde Astrositler ve mikrogliyal immünflöresan boyanması <ol><li> 4 ° C &#39;de 8 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile Organotipik beyin dilim kokültür saptamak </li><li> 5 dakika boyunca (% 0,5 Triton X-100 içeren PBS) PBST ile kokültür dilim yıkayın. </li><li> S blok1 saat boyunca oda sıcaklığında PBST içinde normal keçi serumu (01:20) ile depas&#39;lar. </li><li> Keçi anti-fare-TRITC (PBST içinde 1:100) boyama, ardından 4 ° C&#39;de 36 saat boyunca anti-glial fibriler asidik protein monoklonal antikor (GFAP, PBST içinde 1:200) ile beyin dilim ortak kültürü ile enkübe astrositler Leke Oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez PBST ile örnekleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (PBST içinde 1:100) ILB 4-Alexa Fluor 647 ile mikroglial hücreleri boyamak. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca DAPI ile beyin dilim kokültür (1:1000) Counterstain. </li><li> Dağı ve DAKO floresan montaj orta beyin dilim Coculture lamel. </li><li> Aşağıdaki sisteme göre tümör istilasının değerlendirilmesi notu: + + = 1/3 - 2/3,,, + &lt;1/3 hücrelerinin 0 = yok işgal hücrelerin + + + ≥ 2/3 (birinci Tümör göbek ve dilim arasındaki temas bölümünün uzunluğunu, daha sonra fractio ölçmek) İstilacı hücreler tarafından tespit temas n. </li></ol> 4. Glial ve Tümör Hücreleri arasındaki Etkileşim Canlı Görüntüleme <ol><li> Bir Leica altında deneyi gerçekleştirmek 10X büyütme lens ve bir Leica DFC 350 FX CCD kamera DMI 6000B mikroskop ters. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Serebral metastaz Önceki histolojik araştırmalar özellikle astrositlerde ve mikrogliya 13 yerleşik glial hücrelerin hızlı ve köklü değişiklikler göstermiştir. Karsinom hücreleri ile bu değişiklikleri ve etkileşimleri incelemek için, bu yeni kokültürü sistemi iyi uygundur. Diğer araştırmalar alanlar zaten organotipik hipokampal beyin dilimleri ile uzun yıllara dayanan bir deneyime sahip. Bir avantajı organotipik hipokampal beyin dilim kültürlerin uzun süreli deneyler için uygun hale, hafta canlı ve etkili bir gün boyunca korunmuş olmasıdır. 1991 yılında Organotipik hippocampal slice sistemi Stoppini en tanıtılmasından bu yana, yaygın dejeneratif hastalıkların araştırmada, örneğin kullanılmıştır. Bu nedenle, bu yenilik kokültürü sistemi tümörü 9,11 biyoloji uygulamaları bir dizi iyi kurulmuş bir yaklaşım bir modifikasyonunu ifade eder. Modifikasyon tümör yayılması af derecesini değerlendirmek için bize bir tekrarlanabilir bir model sunduArabirim yöntemiyle geliştirilmişlerdir terwards ve kültürler, ideal olarak, üç boyutlu bir yapı gerektiren deneyler için uygundur. Çeşitli teknikler diğer hücrelerle Organotipik hipokampal dilimler ortak kültürü için kullanılmıştır. Bunlar, makrofaj hücreleri ve Organotipik beyin dilim 14 arasında dolaylı sistemi ve hipokamp bölgesinin 15 iki farklı dilim doğrudan bir ortak kültürü içerir. Glioma agrega Ayrıca beyin dilimleri 16 ile kültüre edilmiştir. Bu modeller Beyin dilimleri hücresel ve moleküler olayları incelemek için kullanılabilir, ancak tümör hücreleri, mikroglia ve beyin parankiması arasındaki doğrudan temas fizyolojik izin vermez. Ayrıca, bu yöntem, kemik iliği kaynaklı periferal monositler / makrofajlar kirlenme olmadan mikroglia gözlem sağlar. CCR2 ve CX3CR1 transgenik fare modeli kullanılması nedeniyle monositler işgal yerleşik mikroglia ayırt etmek zor olduğu gerçeğinden için önemli bir gelişmedirOnların benzer özelliklere 17,18,19 dayanmaktadır. Karsinom hücrelerinin intraserebral enjeksiyonu tümör gelişimini araştıran sağlar rağmen, çevrili makrofaj benzeri hücreler beyin-yerleşik mikrogliya nüfus veya kemik iliğinden elde edilen periferal monositler / makrofajlar 17 kaynaklanan olmadığı kadar söyleyemem. Kettenmann ekibi bir micromanipulator 20 ile beyin dilimler halinde glioma hücrelerinin aşılanması dahil bir organotipik beyin dilim modelini tanıttı. Ancak primer kötü huylu gliyömların metastatik karsinom birçok bakımdan farklıdır. İlk olarak, malign gliomalar mezenkimal kökenli, tümör ve beyin dokusu arasında hiçbir sınır gibi tek hücreleri istila / sinir sistemi dışında metastaz ve göç yok. Buna karşılık, infiltratif büyüme tipik patolojik özelliğidir ve bu karsinomlar genellikle göç / kohortlarda olarak işgal. Hücreleri glial İkincisi, karsinom genellikle beyinde epitel yapıları yeniden deneyina (sözde) kapsül ile beyin doku tümörü ayırmak için deneyin. Biyolojik ve morfolojik özellikleri göz önüne alındığında, malign glioma ve karsinom metastazı gerçekten karşılaştırılabilir değildir. Bu nedenlerden dolayı, biz değiştirilmiş ve biz beyin dilim bitişik bir kanserli hücre fiş enjekte ama kokültürü olmayan bir kokültürü sistem geliştirdi. Ayrıca, mikroglia tümör fiş kolayca girip parlak alan mikroskopi ile tespit edilir ve daha sonra konfokal mikroskopi ile teyit edilebilir olabilir, yani, mikroglia ve tümör tıpanın sınırında astrositik birikimi gözlemlenmiştir. Kanser hücreleri in vivo durumda gerçek ve Baumert ve beyin metastazı 21 ile otopsi olgularının% 63 bir sızma bölgesi buldu meslektaşları tarafından yapılan bir gözlem karşılaştırılabilir beyin dilim içine işgal. Çünkü kayıp kan perfüzyon, bu kültür sadece ikamet makrofaj / mikrogliya vardır. Ayrıca, çünkü mIssing T hücreleri ve bu nedenle, mevcut allo-tepkiselliğe göre insan karsinoma hücreleri da bağışıklığı fare veya sıçan beyin dilimlerindeki (NMRI, B6 veya Wistar) ile birlikte-kültür için kullanılabilir. Bu çıplak fare modelinde bir alternatif olarak hizmet verebilir. 4-5 dilim her bir fareden elde edilebildiğinden, hayvan sayısı önemli ölçüde azalır, mevcut enjeksiyon modellere kıyasla gereklidir. Buna ek olarak, hayvan metastatik hastalık uzun bir süre boyunca maruz kalmaz ve arka arkaya 22 ameliyat prosedürleri uğramaz. Bu kokültürü sistemi ile, kanser hücreleri tarafından mikroglia aktivasyonunu ve kanser hücresi istilasını teşvik kapasitesini göstermiştir. Ayrıca, bu bizim bildiğimiz kadarıyla, mikrogliya aktif kanser hücrelerini 23 taşıma bulundu, ilk kez. Tüm bu avantajlara rağmen, kokültürü sistem, gerçekten de sınırlılıkları vardır. Yine de, bir in vitro olduğuönce kolonizasyon metastaz adımlar eksik modeli. Çünkü perfüzyon eksikliği, bu ekstravazasyonu çalışma mümkün değildir. Bu nedenle, çalışma ekstravazasyonu için bir alternatif yol, kan-beyin bariyerini 22,24 taklit etmek için in vivo model veya enjeksiyon değiştirilmiş Boyden haznesi sistemi, hücre dışı matris ile, HUVEC ve astrositler ya kullanmaktır. Beyin dilim kokültürü yöntemi henüz birçok avantaj ile güvenilir ve tekrarlanabilir bir model ve bu kolonizasyon analizi gibi uygulamalar, geniş bir yelpazede, bir potansiyel yerleşik hücrelerin rolü üzerinde bir odaklanma ile özellikle. (Örneğin, immünohistokimya, konfokal mikroskopi ve zaman atlamalı mikroskopi gibi) diğer bilinen teknikler ile kombinasyon doğrudan hücre-hücre etkileşimleri soruşturma destekler. Bu kolay bir alternatif ve diğer tekniklerin tamamlama ve metastatik mikro dayattığı gibi ipuçları ve etkilerinin araştırılması erişim sunmaktadır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Karsinom serebral metastazı olan hastalarda kötü prognoz. Bununla birlikte, metastatik yerinde işlem ancak, özellikle, ikamet (stromal) hücrelerinin rolü araştırılmıştır. Birincil karsinomlarda çalışmalar bile prognoz 1,2 üzerinde, metastaz üzerinde mikroçevresinin etkisini göstermektedir. Özellikle tümör ilişkili makrofajlar (TAM) desteği göç, istila ve çoğalması 3. İlginç bir şekilde, metastazının başlıca hedefi siteleri gibi CNS&#39;deki karaciğer veya mikroglia Kupffer hücreleri gibi doku spesifik, makrofajları da sahiptirler. Ayrıca, metastatik siteleri de astrosit gibi diğer dokuya-özgü hücreleri sahiptirler. Son zamanlarda, astrositler ve kanser hücrelerinin çoğalmasını 4,5 kalıcılığı teşvik etmek için ortaya konmuştur. Bu nedenle, bu dokuya özel hücre tipleri fonksiyonları beyin metastazı, 6,7 sürecinde çok önemli olduğu görülmektedir. Bu gözlemlere rağmen,Bununla birlikte, şu ana kadar, doğrudan parlak alan mikroskopi ile, özellikle de serebral metastaz oluşumu sırasında, glial reaksiyonları görselleştirmek için uygun in vivo / in vitro modelinde uygun bir yoktur. Karsinom hücrelerinin in vivo canlı görüntülemede son kendi serebral kolonizasyon davranışlarını 8. gösterdi. Ancak bu yöntem çok zahmetli, maliyetli ve teknik olarak karmaşıktır. Buna ek olarak, hayvan deneyleri bu tür küçük seri kısıtlanır ve önemli bir (cam levhanın implantasyon ile, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan, tekrar anestezi ve uzun süreli tespit) hayvanlar için stres ile birlikte gelir. Yerleşik hücreleri ile etkileşimleri henüz tasvir edilmemiş ise Dahası, in vivo görüntüleme, şimdiye kadar, karsinoma hücrelerinin görselleştirilmesi ile sınırlıdır. Son olarak, bağışıklığı yeterli hayvanlara içinde insan karsinoma hücrelerinin araştırmalar 8 imkansızdır. Bu nedenlerle, bir kokültürü sistemi consi kurulmuşmatrigel (3D hücre küre) gömülü bir organotipik fare beyin dilim ve epitel hücrelerinin sokması. 3D karsinom hücre küreleri komşu beyin dokusunun işgali araştırmak amacıyla doğrudan yanındaki beyin dilim kenarına yerleştirildi. Bu floresan ile ve daha parlak alan mikroskopi ile glial hücreleri ve kanserli hücreler arasında morfolojik değişiklikler ve etkileşimleri görselleştirmek için sağlamaktadır. Kokültürü Deney sonra beyin dokusu ya da 3B hücre küremsiler toplanabilir ve daha fazla moleküler analizler (ör. qRT-PCR, IHC veya immunoblot) hem de eş odaklı mikroskopi ile araştırmaları için kullanılmıştır. Bu yöntem, beyin dilimlerine zararlı etkiler olmadan gün boyunca canlı bir beyin dokusu içinde olayları izlemek için uygulanabilir. Bu model aynı zamanda, seçici bastırma ve belirli bir genotip ayrı etkisini belirlemek için verici bir dokudan hücrelerin yerleşik hücre değiştirilmesini sağlar. Son olarak, model, kokültürü uygulanabilir bir alternatifhedeflenen farmakolojik manipülasyonlar sınarken in vivo yaklaşımlar.

Öncelikle, kullanılan tüm kanser hücreleri (insan: MCF-7 ve kemirgen: 410.4) organotipik fare beyin dilim işgal etti. İstila türe bağımsız bir şekilde geniş bir uygulama yelpazesi gösterir, bu nedenle türe bağımsız (Şekil 1A) idi. Buna ek olarak, mikroglia hem de in vivo olarak daha önce ve hasta numuneleri 13 de tarif edildiği gibi, ara yüzeyde birikmiş astrositler. Uzun bir süre boyunca zaman atlamalı görüntüleme dilim canlılığı ortaya ama aynı zamanda hücresel etkileşimleri gözlemlemek için iyi bir platform sundu değil sadece. Time-lapse deneyleri ile, Mikroglial hücreleri sırayla, kanser hücrelerinin de beyin dilim (Şekil 1B1-B2) işgal, 3D cep küre süre girmek için kaydedildi. Ayrıca, daha önce bu şekilde karsinom işgali yardımcı olmak için bir mekanizma ile hâlâ anlaşılmaz karsinom hücreleri taşıma mikroglia yeteneğini göstermiştir. Immünofloresan etiketleme teknikleri kullanarak,işgali işlemi sırasında, bu hücreler arasında sıkı bir etkileşim olduğunu gösterir beyin dokusunda ve tümör hücresi fiş (Şekil 1 C-D) hem de tümör hücreleri ve stromal hücre ko-lokalizasyonunu (örneğin, mikroglia ve astrositler), tarif edildiği. Farklı türler, genotip ve cinslerinden hücreleri incelemek için uygulamaların geniş gösteren - Fare Beyin dilimleri bir insan için (Şekil 1C1-C3), ya murin (Şekil 1D1-D3) karsinoma hücreleri ile ya da kültüre zaman karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Fare ve insan karsinoma hücrelerinin 3D sfero ile Brain dilim kokültürü modeli. Fare meme kanseri olan Organotipik bütün beyin dilim cocultures, kanser hücresi yayılımını A) miktarının belirlenmesihücre hattı 410,4 ya da bir insan göğüs kanseri hücre soyu MCF-7. Veriler n ≥ 38 ile her bir grupta beyin dilim içine cep istila derecesinin yüzdesini temsil eder. Bu iki grup arasında anlamlı bir fark (Kruskal-Wallis testi). B) MCF-7-GFP hücreleri ve gün2 (B1 temsili görüntüleri ile organotipik bütün beyin dilim cocultures Time-lapse görüntüleri) ve günde 5 (B2) idi vardı gösterilmiştir. CD) mikroskopisi görüntüleri karsinom, astrositlerde ve mikrogliya kohortlarını gösterdi. Çift astrositlerin boyama (anti-GFAP-TRITC, kırmızı) ve mikroglia 350 mikron kalınlığında Organotipik beyin dilim ve GFP-transfekte edilmiş tümör hücresi fişi (yeşil) ile bütün ko-kültürü (ILB4-Alexa Fluor 647 mor): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) ve 3D-410.4-GFP (D1-D3). Beyaz çizgiler beyin dilim ve tümör işgali ön kenarını gösterdi. Ölçek çubukları 50 um temsil eder. Mikroglia astrositler birnd tümörler colocalizations (C1 ve D1), astrocytes tümörler colocalizations (C2 ve D2) ve dilim kokültür mikroglia-tümör colocalizations (C3 ve D3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

coculture-system-with-an-organotypic-brain-slice-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K Görüntüleme.  University of Göttingen.  Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor. 

Video: Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Tıp

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Anaplastik Tiroid Kanseri Ortotopik Fare Modeli

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

İnsanlardaki Sağlıklı ve Patolojik Beyin Koşulları Eğitim için Kesme Simetrik Bihemispheric Postmortem Beyin

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.