Dr Hay RCUK Bursu tarafından desteklenen Dr West Cerrahi Anabilim Dalı tarafından desteklenen, Dr Medine BHF Core Fonundan hibe tarafından desteklenen, Sayın Baltasar Lucendo-Villarin bir MAM Doktora Studenship tarafından desteklenmiştir. Dr Zhou, Çin Hükümeti bursu ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz insan HLCs ölçeklenebilir seviyelerini oluşturmak için basit, homojen ve in vitro yüksek oranda tekrarlanabilir bir model geliştirdik . Bizim modelimiz bir dizi dış işbirliği laboratuarları tarafından onaylanmıştır. Biz rutin olarak gelişim belirteçler ve karaciğer özel fonksiyonel testlerinin (çoğu ticari olarak mevcuttur) ev araç kutusu kullanılarak kök hücre elde edilen HLCs karakterize eder. Sürecinde önemli aşamaları şunlardır: bakım pluripotency kök hücre, kök hücre...

Matrigel kaplama plakaları ve şişeler <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, İngiltere); -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C. </li><li> Doku kültürü plakaları (iyi 6, 12 iyi, Corning, İngiltere) </li><li> Doku kültürü şişesi (Bacalı 25 cm2, Corning, İngiltere) </li></ol> hESC Bakım <ol><li> Fare embriyonik fibroblast klimalı ortamda (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, ABD); mağaza -20 ° C </li><li> BSA solüsyonu (50 ml, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); 4 mağaza ° C </li><li> İnsan temel fibroblast büyüme faktörü (100 mikrogram, Peprotech, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol> Kollajenaz ile Pasajlanması hESC <ol><li> HESC konfluent iyi veya şişesi. </li><li> Uygun olarak Matrigel kaplı kuyulardan veya cam şişeler. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (MgCl 2, CaCl 2) (500 mL Gibco, Invitrogen, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Kollajenaz IV (1 g, Gibco, Invitrogen, Birleşik Krallık), 4 mağaza ° C </li><li> Fare embriyonik fibroblast klimalı ortamda (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, ABD). </li><li> İnsan temel fibroblast büyüme faktörü (100 mikrogram, Peprotech, ABD). </li></ol> Hepatik endoderm hESC farklılaşma <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); mağaza, 4 ° C </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, İngiltere); mağaza -20 ° C </li><li> Aktivin A (2 mg, Peprotech, ABD); -20 mağaza ° C </li><li> Rekombinant fare Wnt3a (2 mcg, R &amp; D Systems, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Sigara esansiyel amino asitleri (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C </li><li> β-mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın </li><li> Leibovitz L-15 kültür vasatı (500 ml, SigmAldrich, İngiltere); 4 mağaza ° C </li><li> Tryptose fosfat suyu (100 ml, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); 4 mağaza ° C </li><li> Fetal sığır serumu, inaktive ısı (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Hidrokortizon 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, İngiltere); -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> İnsülin (sığır pankreas) (100 mg, Sigma Aldrich, İngiltere); mağaza -20 ° C </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Askorbik asit (25 g, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); mağaza -20 ° C </li><li> İnsan HGF (10 mg, Peprotech, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Rekombinant İnsan onkostatin M (OSM) (50 mikrogram, R &amp; D Systems, ABD); -20 mağaza ° C </li><li> Şırınga filtre ünitesi 0.22 mikron (Millipore, Birleşik Krallık) tahrik </li></ol> HESC türetilmiş Karaciğer Endoderm Karakterizasyonu Immün <ol><li> Fosfat buffer salin (MgCl 2, CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); stooda sıcaklığında yeniden. </li><li> PBST, PBS 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK) ile yaptı. </li><li> Paraformaldehit (PFA) (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), mağaza -20 ° C, PBS içinde oluşur </li><li> Gliserol (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Tris Bankası (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Etanol </li><li> Serum (Serotech ABD, Birleşik Krallık), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> İkincil Antikor, Alexa Fluorophores (Moleküler Probları, Invitrogen, Birleşik Krallık). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) üretici talimatlarına göre Tris HCL ve gliserol oluşur. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK), bir 1:1000 dilüsyon MOWIOL çözüm eklenir. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> İlköğretim antikorlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antijen * </td><td> Tip </td><td> Satıcı </td><td> Seyreltme </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-Cadherin </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> alfa-fetoprotein </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonal Fare </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekonder antikorlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare FITC konjuge </td><td> Monoklonal Keçi </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). HESC kaynaklı karaciğer endoderm immün için kullanılan antikorlar, konsantrasyonları ve şirketlerin geliştirdiği türlerin satın alınır. Karaciğer Endoderm ve Normale Fonksiyonel Analiz (mg protein başına) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kitleri ve luminometre (Promega, USA). </li><li value="1"> Beyaz düz dipli 96 iyi tahlil plaka (BD Biosciences, Birleşik Krallık). </li><li> BCA Testi Kiti (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Şeffaf 96 iyi tahlil plaka (Iwaki, İngiltere) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Modelleme insan ilaç zehirlenmesi ilerlemelere rağmen, birçok bileşikleri klinik çalışmalar sırasında beklenmeyen yan etkiler nedeniyle başarısız olur. Klinik çalışmaların maliyeti büyük, bu nedenle daha fazla öngörü toksikoloji ekranlarında geliştirilen ve ilaç geliştirme (Greenhough ve ark 2010) başlarında konuşlanmış olması çok önemlidir. İnsan hepatositler ilaç toksisitesinin değerlendirilmesi için altın standart model temsil eder, ancak değişken fonksiyon gösteren sınırlı bir kaynaktır. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiştir hücre hatları ve hayvansal doku modelleri kullanımı rutin bolluğu nedeniyle istihdam edilmektedir. Iki kaynaktan bilgilendirici olsa da, yetersiz fonksiyonu, türün değişkenliği ve / veya kültür istikrarsızlık (Dalgetty ve ark 2009) sınırlıdır. Pluripotent kök hücreler (PSC&#39;leri) hücreleri gibi insan hepatosit cazip bir alternatif kaynak (HLCs) (Medine ve ark 2010). PSC&#39;ler yetişkin bulunan tüm somatik hücre türleri için kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve böylece temsilfarklılaşmış hücrelerin bir potansiyel olarak bitmez tükenmez bir kaynak. Biz otomasyon ve verim fonksiyonel insan HLCs (Fletcher ve ark 2008; Hannoun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 ve Hay ve ark 2011 Hay ve ark 2008) için uygun, yüksek verimli, basit bir prosedür geliştirdik. Biz teknoloji, hastalık modelleme, ekstra bedensel cihazlar inşaat ve muhtemelen hücre nakli tedaviler ilaç keşfi için HLCs ölçeklenebilir üretimine yol olacağına inanıyorum.

Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

robust-generation-hepatocyte-like-cells-from-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.