Dr Hay foi apoiado por uma bolsa RCUK, o Dr. West foi apoiado pelo Departamento de Cirurgia, Dr. Medine foi apoiado por uma subvenção do Fundo Núcleo BHF, o Sr. Baltasar Lucendo-Villarin foi apoiado por um PhD MRC Studenship. Dr. Zhou foi apoiado por uma bolsa do governo chinês.

<ol>
	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós desenvolvemos um modelo simples, homogêneo e altamente reprodutível in vitro para gerar níveis escalável de HLCS humana. Nosso modelo foi validado por uma série de laboratórios colaboradores externos. Rotineiramente caracterizar HLCS com células-tronco derivadas usando a nossa caixa de ferramentas na casa de marcadores específicos de desenvolvimento e testes funcionais do fígado (a maioria dos quais estão disponíveis comercialmente). As fases críticas em nosso processo são: a manutenção da p...

Placas de revestimento Matrigel e frascos <ol><li> Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Placas de cultura de tecido (6 assim, 12 bem, Corning, UK) </li><li> Frasco de cultura de tecidos (25 cm2 ventiladas, Corning, UK) </li></ol> Manutenção CTEh <ol><li> Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> BSA solução (50 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li></ol> HESCs Passaging com colagenase <ol><li> Bem confluentes ou frasco de hESCs. </li><li> Matrigel poços revestidos ou frascos conforme o caso. </li><li> Fosfato salina tamponada (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Colagenase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, EUA). </li><li> Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA). </li></ol> Diferenciação de hESCs a endoderme hepática <ol><li> RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Suplemento B27 (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Ativina A (2 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Recombinante Wnt3a mouse (2 mg, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Não-aminoácidos essenciais (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> β-mercaptoetanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); armazenar à temperatura ambiente </li><li> Leibovitz L-15 meio de cultura (500 mL, Sigmuma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Triptose fosfato de caldo de carne (100 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Fetal de soro bovino, inactivado pelo calor (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Armazenar a -20 ° C.; hidrocortisona 21 hemissuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK) </li><li> Insulina (pâncreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> L-Glutamina (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> O ácido ascórbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Humana HGF (10 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Recombinante humana Oncostatina M (OSM) (50 mg, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Seringa de unidade orientado filtro de 0,22 mM (Millipore, UK) </li></ol> Caracterização da CTEh endoderma hepática derivada Imunocoloração <ol><li> Tampão fosfato salino (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store à temperatura ambiente. </li><li> PBST, PBS feita com 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldeído (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) é composto, em PBS, armazenar -20 ° C. </li><li> Glicerol (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Etanol </li><li> Soro (ABD Serotech, UK), armazenar a -20 ° C. </li><li> Anticorpo secundário, fluoróforos Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, EUA) é composta de Tris HCL e glicerol como por instruções dos fabricantes. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) é adicionado à solução MOWIOL na diluição de 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Anticorpos primários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * Antígeno </td><td> Tipo </td><td> Fornecedor </td><td> Diluição </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 05/0100 </td></tr><tr><td> E-caderina </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoproteína </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticorpos secundários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-camundongo conjugado FITC </td><td> Cabra Monoclonal </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os anticorpos utilizados para CTEh imunocoloração derivados hepática endoderme, as concentrações utilizadas, a espécie desenvolveu e as empresas que são comprados a partir de. Análise funcional do endoderma hepática e normalização (por mg de proteína) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits e luminômetro (Promega, EUA). </li><li value="1"> Branco flat bottom 96 placa de ensaio bem (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> 96 placa transparente de ensaio bem (IWAKI, UK) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Apesar dos progressos na modelagem de toxicidade dos medicamentos humanos, muitos compostos falhar durante os ensaios clínicos devido a efeitos colaterais imprevisíveis. O custo de estudos clínicos são substanciais, por isso, é essencial que mais telas de toxicologia preditiva são desenvolvidos e implantados no início do desenvolvimento de drogas (Greenhough et al 2010). Hepatócitos humanos representam o modelo atual do ouro padrão para avaliar a toxicidade dos medicamentos, mas são um recurso limitado que exibem função variável. Portanto, o uso de linhagens de células imortalizadas e modelos de tecido animal são rotineiramente empregados devido à sua abundância. Enquanto ambas as fontes são informativos, eles são limitados pela função pobres, a variabilidade das espécies e / ou instabilidade na cultura (Dalgetty et al 2009). Células-tronco pluripotentes (PSC) são uma importante fonte alternativa de hepatócitos humanos como células (HLCS) (Medine et al 2010). PSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação de todos os tipos de células somáticas encontrada no adulto e, portanto, representamuma fonte potencialmente inesgotável de células diferenciadas. Temos desenvolvido um procedimento que é simples, altamente eficiente, passível de automação e rendimento funcional HLCS humano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Acreditamos que nossa tecnologia irá levar à produção escalonável de HLCS para descoberta de drogas, modelagem de doença, a construção de extra-corpórea dispositivos e, possivelmente, terapias celulares transplante base.

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Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

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47.7K visualizações.  University of Edinburgh. Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.