The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

NOT: uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada, iki ekspresyon kasetleri içeren tek bir yapı kullanılmıştır (örneğin ağır ve hafif zincir ekspresyon ayrı promoterler tarafından tahrik edilir). Trastuzumab, ağır ve hafif zincirler, daha önce vektörüne klonlanmıştır. Bu vektör bir değil, kar amacı gütmeyen plazmid depo 13 ile elde edilen Andrew Beavil bir hediye oldu. 1. geri kazanımı ve vektör DNA ölçek büyütme Not: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Mavi suşu bir yumuşak agar levha kültür olarak alınmıştır; Vektör higromisin direnç taşımaktadır. <ol><li> Daha sonra çizgi bir Luria Bertani (LB) agar plaka 75 mikrogram ile hazırlanan bıçak kültürünün yumuşak agar içine steril bir aşılama bıçak ya da döngü takın / izole koloniler için ml higromisin. 18-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 75 ug / ml higromisin içeren 5 ml Terrific suyu (TB) içine tek bir koloni inoküle. incu225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kesmek kültürü. </li><li> yavaşça -80 ° C de meydana gelmekteydi ve dondurularak 200 ul% 80 gliserol ile kültür, 800 ul karıştırılarak vektör DNA, bir gliserol stokundan hazırlamak için bir gece boyunca kültür kullanın. <ol><li> Ihtiva eden 100 mi TB gecelik kültüründen 100 ul ekle 75 ug / bölmeli bir çalkalama şişesinde (örneğin 1/1000 seyrelti) içinde higromisin ml. 225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> bir gece kültürden sonra, ayıklamak ve şu istisna ile MIDI / maksi hazırlama kiti üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırılması; su (pH 7,0-8,5) ile son adım, elute veya tekrar süspansiyon DNA sırasında. </li><li> daha sonra -20 ° C de, DNA depolamak 260 ve 280 nm &#39;de konsantrasyon ve absorbans okumaları ile DNA saflığı kontrol edin. NOT: İsteğe bağlı (tavsiye): Sıra DNA kimliğini doğrulamak için vektör-spesifik primerler kullanılarak. </li></ol> 2. HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ve Erlenmeyer şişelerinde% 0.1 noniyonik yüzey aktif madde ile takviye edilmiş serumsuz ortamda, standart protokollere göre, HEK-293 hücreleri (süspansiyon hücreleri) korur. 2 x 10 5 hücre / ml ve alt kültür her dördüncü gün koruyun. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Not: Hücreler, en az 4 gün boyunca kültür edilmiş ve transfeksiyondan en fazla 4 hafta önce olmalıdır. Serum içeren ortam içinde mono-tabaka olarak yetiştirilen HEK-293 hücreleri bu işlem için kullanılabilir. </li><li> Günde, transfeksiyondan önce, tohum, HEK-293 hücreleri, bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içinde 3 x 10 5 hücre / ml&#39;de 2% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi ( FBS). Transfeksiyon gününde, hücreler% 80-90 konfluent ulaşmış kontrol </li><li> Daha sonra karıştırın transfeksiyon medyada ayrı ayrı DNA ve polietilenimin (PEI) seyreltin.<ol><li> 300 ul transfeksiyon medyada kuyu başına 1.25 mikrogram vektör DNA (12 kuyuları için 15 mikrogram) seyreltin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> (12 kuyu 30 ul, yani 1: PEI DNA 2 oran) 1 mg / ml PEI solüsyonu 2.5 ul seyreltilir 300 ul transfeksiyon ortamı içinde. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, seyreltilmiş PEI seyreltilmiş DNA ekleyin. </li></ol></li><li> plakanın her oyuğuna DNA / PEI karışımı damla damla 50 ul ekle. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 transfeksiyon karışımı daha sonra plaka yer dağıtılması için hafifçe plaka sallayın. </li><li> Oyuk başına B higromisin ve 10 gün boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile plaka dönüş ml / 50 ug ekleyin. Not: kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücrelerde, uygulanabilir ve plakaya eklenir ise 10. günde, un transfekte edilmiş hücreler, plaka yüzeyindeki öldü ve müstakil olacaktır. </li><li> ile kuyularda medya değiştirin1/4 hacim serumsuz ortam ve 3/4 hacim DMEM% 10 FBS (örneğin, 0.5 mi serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe ile takviye edilmiştir. </li><li> % 10 FBS (+ 1 mi DMEM =% 5 son serum konsantrasyonu, yani 1 mi serumsuz ortam) ile desteklenmiş 1/2 hacim serumsuz ortam ve 1/2 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 10 FBS (örneğin, 1.5 mi serumsuz ortam + 0.5 mi DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş 3/4 hacim serumsuz ortam ve 1/4 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 0.1 noniyonik yüzey aktif madde (örneğin,% 0 son serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş serumsuz ortam 2 ml kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. Not: serumsuz uyarlanması sırasında hücreler üzerinde 50 ug / ml higromisin B seçici bir basınç muhafaza edin. serum ücretsiz medya adapte Hücreler kuyuların yüzeyinden ayırmak ve i küme olabilirn süspansiyon. 50 ug ek takviyesi ile kültür koşulları için 2.1 adıma bakın / B. ml higromisin </li><li> Bir pipet kullanarak, hafifçe ayrı tüp içine 12 oyuklu plaka ve havuz hücre süspansiyon kültürleri karıştırın. <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak, 2 x 10 5 hücre / ml bir Erlenmeyer şişesi içinde 30 ml serumsuz ortam içinde toplanmış hücreleri ve tohum numaralandırmak. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Altkültür ve her dördüncü gün genişletin. </li></ol></li><li> / 1 x 10 7 hücre 10 şişe elde etmek için gerekli hücre yoğunluğu kültür boyutunu genişletmek sıvı azot içinde dondurulması için şişeyi devam edin. % 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden serumsuz ortam hücreleri dondurun. Not: antikor içeren koşullu ortam, protein üretimini teyit etmek için her bir alt kültür hasat veya saflaştırma koşulları optimize etmek için kullanılabilir. klimalı ortam hasat ve alt kültür hücreleri korumak, en kültürünü santrifüj5 dakika boyunca 300 x g daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden süpernatan filtre-sterilize edin. Filtre yüzer 1-2 hafta veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C, 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Toplu kaplamak Kültür 3. Büyük Ölçekli Antikor Üretimi NOT: Antikor üretimi mevcut hücreler kurulum toplu kaplamak kültür hacmine dayalı gerekli hücre yoğunluğuna genişletilir adım 2.11 dan takip edilebilir. Aksi takdirde, soğukta korunan çözülmüş olan hücreler bir kez uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletilmiş bu aşamada başlar. Çeşitli kültür takviyeleri antikor üretimini optimize etmek için kullanılabilir; tripton kullanımı antikor verimi Bu protokolde gösterilmiştir artırmak için. <ol><li> Tohum hücreler iki Erlenmeyer şişelerinde 100 mi serumsuz ortam içinde 2 x 10 5 hücre / ml&#39;de (takviye un ve besin takviye kültürlerden antikor verimlerini karşılaştırmak üzere). 37 ° C&#39;de Kültür ° C,% 5 CO2 </sub&gt; ve 120 rpm. </li><li> 24 saat sonra, besin takviye kültüre% 0.5 bir son konsantrasyona tripton ekleyin. serum serbest medya ile un takviye kültür hacmini eşitlemek. </li><li> Gün 8, hücre canlılığı izlemek için bir hemositometre kullanılarak, günlük kültürlerin hücre sayımı gerçekleştirin. hücre canlılığı, 80% &#39;den daha az bir kez kültür süpernatanlarının hasat. <ol><li> 3,000 xg 15 dakika için kültürlerin santrifüj ile hasat yüzer madde daha sonra 0.22 um&#39;lik bir filtreden süpernatan içeren (antikoru) filtre-sterilize edin. 4 ° C (kısa süreli) olarak süpernatantlar saklayın veya -20 ° C (uzun vadeli) donma. </li></ol></li></ol> Bağlantı Kromatografisi ile saflaştırma 4. Antikor otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografi kullanarak (FPLC) Sistem Not: Aşağıdaki prosedür, genel olarak, çoğu otomatik sistemlere uygulanabilir. Saflaştırma, oda sıcaklığında gerçekleştirilir ya da 4 ° C &#39;de (FPLC sistemi serin bir odada muhafaza edilir ise) olabilir.keşif bir dizi test (Sonuçlar bölümüne bakınız) koşullandırılmış ortamdan saflaştırıldı antikorun en iyileşme sağlamak için tampon elüsyon tampon ve pH, bağlayıcı uygun sütun matrisi içeren uygun saflaştırma koşulları belirlemek için gerçekleştirilebilir. Optimal koşullar, antikor veya protein arındırılmadan bağlıdır. Saflaştırma otomatik bir FPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma 5 ml&#39;lik bir Protein A kolonu kullanılarak oda sıcaklığında yapıldı. <ol><li> ultra saf su kullanılarak, aşağıdaki tamponlar hazırlamak ve daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden filtre tavsiye edilen pH ayarlamak. <ol><li> 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCI, 0.01 M Na-2 HPO 4 0.001 M KH 2 PO 4: aşağıdakileri karıştırarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 (bağlanma tamponu) 1 L hazırlayın. tampon filtreleme önce gerekirse pH ayarlayın. </li><li> 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu), 500 ml hazırlayın. buff filtreleme önce pH ayarlayıner. </li><li> 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) 50 ml hazırlayın. </li></ol></li><li> yapılan bilgisayar ile tüm sistem güç ve iletişim bağlantılarını sağlamak. Cihazlar yazılımı &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde görünür olmalıdır. Emin UV cep 280 nm dalga boyunda ayarlanır. İsteğe bağlı: Bağlı ve kullanılacak eğer pH metre kalibre. </li><li> sistemin yıkanması, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri bırakın. boru içindeki hava veya sistemde bir hava şüphe varsa bir şırınga ile pompaları temizleyin. sistem kontrolörü üzerinden veya otomatik yöntemiyle manuel kullanıma su ile sistemi yıkayın. Bu basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH tutarlı kalır ve sütun için basınç limiti üreticinin şartnamesine göre aşmamak gözlemleyin. NOT: anormallikleri devam etmeden önce ele alınması gereken sistemde hava veya tıkanıklığa işaret eder. </li><li> sistem kontrol modülü, 1 de debi başlatmakml / dk manuel ya yük pompa A yoluyla (örnek döngü atlayarak) veya sütun bağlayan başlamak için pozisyon (örnek döngü yoluyla) enjekte edilir. Kes sistem sütun konumunu girişinde boru ve sütun girişine bağlı tıpa kaldırın. <ol><li> Su daha sonra kolona sistemi boru eklemek sütununun tepesine sistem boru damla damla akmasına izin verir. Sütun girişi olan ve giriş uydurma su damlaları ile taşan hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar. </li></ol></li><li> mansap çıkışında sütun çıkışını takın ve tüm parçaları sıkıca tutturulmuş emin olun. Sütun artık sisteme bağlı sütun şartnamesinde belirtildiği gibi, maksimum basınç sınırı ve debi sınırlarını aşmamaktadır. </li><li> su, 5 kolon hacminde (CV) ile kolon yıkanır. Gerekirse UV280 izleme stabilize kadar, kolon yıkama devam ediyor. </li><li> tampon Bağlama A&#39;nın giriş tüpleri daldırın, Tasfiye B tampon ve Ciltleme tampon t örnek pompasıo doğru tamponlarda sistemi dengeye. manüel işlemle PumpWash kullanarak tamponu ile giriş tüpleri doldurmak. </li><li> Yazılımın &#39;yöntemi Editörün&#39; modülünde, kurulum için bir yöntem sihirbaz kullanılmak üzere tasarlanmıştır sütun için bir afinite kromatografisi yöntemi kullanın. NOT: Otomatik FPLC sistemler yöntemleri önerilen ayarlar (yani debi ve basınç sınırı) ile önceden doldurulmuş ve saflaştırılması için seçilen sütunun (üretici, matris ve boyut) dayalı adım koşmak ile birlikte gelir. <ol><li> Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın: <ol><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li><li> Sütun üzerine yük numune ve ayrı bir kabın içine flowthrough toplamak (hacim yöntemi elle belirtilen yüklenecek). </li><li> Bağlama tampon çözeltiden 5 CV ile yıkama sistemi, ayrı bir kap içine flowthrough toplar. </li><li> 5 CV isocrat ile elüt sütunuElüsyon tamponu ve fraksiyon toplayıcı tarafından fraksiyonları gibi saflaştırılmış antikor numune toplamak kullanarak IC fraksiyonasyon. </li><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li></ol></li></ol></li><li> yöntem kurulumu edildikten sonra, koşullu ortamın hacmi kolonuna uygulanacak belirtmek ve yöntem kaydedin. Not: Yöntem belirtilen birim örnek akımı boyunca hava giriş önlemek için, gerçek hacmi 5-10 mi az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml. </li><li> klimalı ortamı içeren kabına numune pompa hortumunu Batmak. </li><li> Belirtilen çıkış boru ile örnek flowthrough toplanması için ayrı bir kap hazırlanır. NOT: sütun veya arıtma r uygulanamayacağı için flowthrough gerektiren aşıldığında bir hata çalıştırmak veya sütun bağlama kapasitesi sırasında oluşması durumunda flowthrough toplamak için önemlidirepeated. </li><li> fraksiyon toplayıcı toplama tüpleri hazırlayın. 1 mi fraksiyon hacim başına nötralizasyon tampon 100 ul ekle. FPLC sistem otomatik toplama tüpleri içine kesirler Zehir. </li><li> Yazılımın &#39;Sistem Kontrolü&#39; modülünde, yöntem açmak çalıştırılacak. NOT: yöntem çalışma yöntemi, fraksiyon toplayıcı kurulum değişkenleri kontrol ve sonuç dosya adını ve depolama konumunu tanımlayan dahil sayfaların bir dizi başlatılır. </li><li> Çalışmayı başlatmak için BAŞLAT tıklayın. run &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde izlenebilir. </li><li> arıtma çalışmasının bitiminde, sistem yazılımı &#39;Değerlendirme&#39; modülünde sonuçlanan kromatogramı kontrol edin. </li><li> Ayrı bir tüp, tampon değişimi içine tüm protein ihtiva eden fraksiyonlar birleştirilir ve kesik 30 kDa molekül ağırlığına sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak PBS içinde konsantre edilir. üreticinin göre santrifüj adımları uygulayıntalimatlar. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit analizi (BCA) kullanılarak antikor konsantrasyonu ölçümü. </li><li> Başka bir arıtma çalıştırmak yapılacak ise, Bağlama tampon ve tekrar başbakan örnek pompa hortumu 4.9-4.14 adımları. </li><li> saflaştırma çalışır tamamlanmasından sonra, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri daldırın ve adım 3&#39;te yapılan gibi bir sistem ve sütun yıkayın. </li><li> sistem ve kolonun depolanması için% 20 etanol ve tekrar yıkama prosedüründe A, B ve örnek pompa hortumunu Batmak. </li><li> aşağı prizden sütun ayırın ve sütun stoper yerine, daha sonra girişinde sütun ayırın ve stoper yerine, sisteme boru bağlayın. 4 ° C&#39;de sütun saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments.">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li><li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates:+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety.">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li><li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies.">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li><li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies.">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Food and Drug Administration. 22, (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Medicines Agency. 13, (2014).</li><li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab.">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).</li><li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+Remsima.">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab.">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies.">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li><li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus.">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li><li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines.">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li><li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies.">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885 (2014).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals.">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g/l+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions.">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).</li><li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker.">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li><li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells.">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells:+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency.">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li><li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers.">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid:+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li><li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility.">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak...

terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere 4 antikor fragmanları 1, antikor-ilaç konjugatlarının 2 bispesifik antikorlar 3 ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak &#39;son derece benzer&#39;. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite 5, 6 ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır. onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde 7, 8, 9 ortaya çıkıyor. terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi. antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir. İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde 10 heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder. iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA 11 iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin 10, 12 eş ifadesini elde etmek için ası,. geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar. Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç ​​karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir. Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA&#39;nın hazırlanması oluşur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1730">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">pFUSE vector series</td>
			<td style="width:189px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:1003px;">Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAbXpress vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td>
			<td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1 vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&#160; Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GS vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;</td>
			<td>61883</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro Agar</td>
			<td>fas-hg-s</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &#181;g/ml hygromycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro TB</td>
			<td>fas-hg-l</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &#181;g/ml hygromycin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol, BioXtra, &#8805;99%</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>G221020</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293-F Cells</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Kolliphor P188</td>
			<td>K4894</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose&#160;</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&#160;</td>
			<td>23966</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at -80oC until use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiPro SFM</td>
			<td>12309-050</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Transfection formulated serum-free media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B Solution</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>AJA2225</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tryptone (casein peptone)</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td>
			<td>GE17-0403-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AKTApurifier 100</td>
			<td>28406266</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine-HCl</td>
			<td>G2879</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citric Acid, monohydrate</td>
			<td>BIOC2123</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>BIOCB0035</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td>
			<td>BIOSD8146</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td>
			<td>UFC803008/UFC903008</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td>
			<td>23227</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLItz System</td>
			<td>45-5000</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A biosensors</td>
			<td>18-5010</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td>
			<td>786-502</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>AM0486</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>AM0761</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>786-498</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td>
			<td>1610374</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile trastuzumab kararlı üretim biyo-tabakalı interferometrik (BLI) kullanılarak teyit edilmiştir. Bir IgG standart eğrisi IgG antikoru standart ve Protein A biyosensör (Şekil 1A) arasındaki bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham yüzer kısım Örnek Benzer ölçülmüş, daha sonra da konsantrasyonu, standart bir eğrisi (Şekil 1B) arasın...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.2K Görüntüleme.  University of Sydney.  Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir. 

Video: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...