Bu çalışma Tıp İç Fonları Massachusetts Genel Hastanesi Bölümü (JMT, MKM, MLC, JMV) Ulusal Biyomedikal Görüntüleme Enstitüsü ve Biyomühendislik hibe T32EB006348 (MSK), Massachusetts Genel Hastanesi Kullanıcı Hesaplamalı ve Bütünleştirici Biyoloji geliştirme fonu için Merkezi ve AI062773 (tarafından desteklenen oldu RJH), hibe AI062773, DK83756 ve DK 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV .) Nicholas C. Yoder teknik yardım için yararlı tartışmalar için teşekkür eder, ve Charles Keçeler (RPI, Inc.)

1. Kültür koşulları optik yakalama patojenlerin <ol><li> 3 gün boyunca 30 SBD (Sabouraud dekstroz) içeren yarı-katı agar medya ° C A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) büyütün. </li><li> C. büyütün 30 gece bir çalkalayıcı inkübatör 100 mg / ml ampisilin içeren YPD albicans (SC5314) (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı kültür ° C </li></ol> 2. Floresan etiketlenmesi için patojenlerin hazırlanması <ol><li> Hasat patojenlerin miktarı istenen ve 1.5 ml reaksiyon tüpüne transfer. </li><li> Fosfat ekle 300 mcL reaksiyon tüpü tamponlu salin (PBS). </li><li> 30 saniye boyunca karışımı sonikasyon. </li><li> 4000 rpm&#39;de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Pelet bozulmamış bırakarak süpernatant aspire edin. </li><li> Tekrarlama (2.4) ve (2.5) iki kez daha. </li><li> 500μL PBS içinde süspanse edin. </li></ol> 3. Floresan boya ile patojenler Etiketleme <ol><li> 100 mcL dimetilformamid (DMF) (10 mg / ml konsantrasyon) ilgi boya (örneğin Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) 1 mg çözülür. </li><li> Yıkanmış patojenler içeren reaksiyon tüpleri 3 mcL boya karışımı ekleyin. </li><li> ° C &#39;de 1 saat süreyle Döndür veya az 37 örnek sallamak. </li><li> 1 dakika 4000 rpm&#39;de santrifüj PBS 3X örneği ile yıkayın. </li><li> PBS 300 mcL süspanse edin. </li></ol> 4. T-hücrelerinin tüm kan Hasat <ol><li> Tam kan (taze) edinin. </li><li> Sıcak kan, PBS +% 2 fetal sığır serumu (FBS) ve oda sıcaklığına kadar histopaque. </li><li> 50 mcL / mL tam kan RosetteSep İnsan CD4 + T hücre Zenginleştirme Kokteyl ekleyin. </li><li> Örnek döndürün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> PBS +% 2 FBS eşit hacmi ile örnek seyreltilir ve hafifçe karıştırın. </li><li> Katman karışım en aza indirilmesi, histopaque üst örnek seyreltilmiş </li><li> Fren kapalı olarak oda sıcaklığında 1200 xg&#39;de 20 dakika santrifüjleyin. </li><li> Zenginleştirilmiş hücrelerin çıkarın. </li><li> PBS +% 2 FBS çözüm 2x zenginleştirilmiş hücreleri yıkayın. </li><li> Kırmızı kan hücrelerinin parçalanması tamponu ile 2 dakika boyunca kırmızı kan hücreleri Lyse </li><li> 5 dakika için 10 ml PBS +% 2 FBS ve 1500 rpm&#39;de santrifüj parçalanmış kırmızı kan hücreleri ekle </li><li> Pelet rahatsız etmemek için dikkatli, supernatant aspire </li><li> % 10 fetal sığır serumu içeren IMDM medya içinde süspanse edin </li></ol> 5. Oda slaytlara RAW 264,7 makrofajların hazırlanması <ol><li> DMEM (Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta)% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin içeren hazırlayın. </li><li> Sıcak ortamı, sıcak banyo 37, tripsin ve PBS ° C </li><li> Plaka 2x PBS ile yıkayın </li><li> Her yıkama arasında PBS aspire. </li><li> 5 ml tripsin yüzeyini kapsayacak şekilde (10 cm doku kültürü plaka için) plaka ekleyin. </li><li> 37 5 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Plaka yüzey hücreleri ayırmak için hafifçe plaka yana tak. Plaka dışında tripsin sıçrama için dikkatli olun. </li><li> 5 ml tripsin medya eşdeğer miktarda ekleyin. </li><li> Karışımı bir tepki tüp içine aspire edin. </li><li> 3 dakika boyunca 1000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aspire medya, pelet rahatsız etmemek için dikkatli. </li><li> 10 ml medya süspanse edin. </li><li> Medya odası slayt her odasına 400 mcL ekleyin. </li><li> 5 mcL hücre süspansiyonu, her iki mecliste de ekleyin. </li><li> 37 ° inkübatör geceleme büyütün ° C,% 5 CO 2 ile . </li></ol> 6. Örnek patojenlerin eklenmesi <ol><li> Ilgi etiketli patojenlerin pipetleyin 5-10 mcL odasına (adımları 1-3). </li><li> Yapıştırılır makrofajlar rahatsız odasının alt dokunmak için değil, dikkatli ve aşağı yukarı pipeting iyice karıştırın. </li></ol> 7. Disk konfokal mikroskop iplik üzerine numune yükleme (video, bileşenler üzerinden tarama) <ol><li> Disk konfokal mikroskop iplik tüm bileşenleri açın. </li><li> DIC görüntüleme için mikroskop hizalayın. </li><li> Inkübatör odasına slayt çıkarın. </li><li> Uzman aşamaya oda slayt takın. </li><li> Oda slayt üst (DIC görüntüleme için gerekli) çıkarın. </li></ol> 8. Optik yakalama Hazırlık (video bileşenleri üzerinden tarama ve nasıl mikroskop içine entegre) <ol><li> Optik tuzak için deklanşör açın. </li><li> IR lazer açın. </li><li> Açık optik tuzak çekim hızı (lazer). </li><li> IR lazer önünde deklanşör Onayla KÖ kart ile kontrol ederek kapalı. </li></ol> 9 - Optik tuzak Seçme ve patojen manipülasyonu <ol><li> Focus yapıştırılır slayt makrofajlarda. </li><li> Özgürce dalgalanan patojenlerin makrofajlara bitişik bir çözüm bulun. </li><li> Patojen tuzak çevresinde olduğu gibi sahne taşıyın. </li><li> Deklanşör açın ve tuzak meşgul. </li><li> Sabit tuzak ile temas makrofajlar getirmek için örnek Taşıped patojen. </li><li> DIC, floresan, ya da her ikisinin kombinasyonu ya da disk konfokal mikroskop iplik ile görüntü. Tipik olarak, yakalama DIC yapılır ve gerçek zamanlı görüntüleme floresan ile yapılır. </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar: In vivo ve in vitro ortamda, patojenler ve boncuk tam mekansal ve zamansal kontrol uygulamayın, biz dönen bir disk konfokal mikroskop (şematik Şekil 1) üzerine entegre edilmiş bir özel inşa edilmiş yakalama cihazları tasarlanmıştır. Tam güçte lazer, 350 mW güç ve ışık optik tuzak aparatı çeşitli optik bileşenleri ile kaplin sonra, bir güç metre ile ölçülen güç TIRF amacı ~ 80 mW, tuzak oluşturmak için kullanılır Odanın. Sıkışıp nesne yakalama lazer ile sabit tutarken, kapana kısılmış bir nesneye göre odasında bir nesne konumlandırmak için sahneye taşındı. Sahne tuzağa parçacık sürtünme kuvveti maksimum yakalama gücü geçmemişse, böylece, yavaş yeterli hızlarda taşındı. C. albicans ayrı popülasyonları (tipik boyutu - ~ 5 mm), çok sayıda floresan kanalları ile görüntüleme göstermek için her üç renk (AF488, AF568, ve AF647,,, yeşil, mavi, ve karşılık gelen bu rakam kırmızı, sırasıyla ) ile etiketlenir. aynı anda optik patojen yakalama. Bir tek C. gri oklarla gösterildiği gibi, kalabalık bir ortamda bile, operatör tarafından seçilen tek bir patojenin belirli bir konuma (Şekil 2A) yakalamak ve manipüle etme yeteneğini gösteren albicans, diğer maya bir küme ile bir kare desen sıkışıp kalmasına ve taşındı . Patojen organizmalar tarafından sergilenen farklı şekil morfolojileri yakalamak için bu sistem daha fazla esneklik göstermek için, optik cımbız, aynı zamanda bir C tutun ve yerleştirme başardı psödohif ile albicans parçacık. C. AF647 (kırmızı) ile etiketli albicans, beyaz ok tarafından özetlenen ve floresan GFP-LC3 RAW hücreleri (Şekil 2B) yanında yer yörüngesi boyunca taşındı . C maya kısmını psödohif birlikte izledi albicans çakılıp kalmıştım. Ayrıca bu özel hücre hattı ve patojen (Şekil 3A) fagositoz mutlak bir zaman çerçevesi analiz etmek için RAW fare makrofaj hücre yanında Aspergillus konumlandırılmış. Patojen hücre ile temas edinceye tuzak kapalı, ve zaman atlamalı görüntüleme (Şekil 3B) sonraki hücresel olayları gözlemlemek için kullanılır. Optik tuzak da birincil T-hücrelerinin kandan izole ve boncuk boncuk (Şekil 4) ile bir immünolojik sinaps formu T-hücre için anti-CD3 antikoru ile kaplı bitişik yönettiği yakalamak için kullanılan, ek göstermek çok yönlülük doğrudan tuzak ve bağışıklık hücreleri manipüle. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Genel bilgiler ve şematik kombine optik tuzak ve dönen disk konfokal mikroskop kurulum . Enstrüman düzeni (bindirme kiriş (mor), elektron-çarparak şarj cihazı birleştiğinde aydınlık görüntüleme (turuncu), floresan uyarma ışın (kırmızı), floresans emisyonu (yeşil), şarj çiftli aygıt (CCD) kamerası, aydınlatma yolunu gösteren EM- CCD) kamera (D1 ve D2) dikroik aynalar, aynalar (M1 ve M2) ve objektifler (L1, L2, L3, L4). Tuzak konfokal mikroskop sistemi tüm diğer bileşenler rakam olarak etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 (A) Floresan görüntüleri sıkışıp kalmasına ve C. manipüle albicans. Diğer C. floresan etiketli bir alanda sıkışıp floresan etiketli (Alexa Fluor 488 (AF488), mavi) organizmanın albicans (AF568, kırmızı, yeşil ve AF647). Sahne gri oklarla gösterildiği gibi tuzak, mavi CA parçacık dolaştı. (B) C Trapped pseudo-hifal formu GFP-LC3 RAW hücre gelecek albicans. CA floresan etiketli psuedohyphal formu (kırmızı, AF647) optik sıkışıp kalmasına ve GFP-LC3 komşu taşındı RAW makrofajlar dile getirdi. CA organizma yörünge boyunca beyaz ok ile gösterildiği gibi taşınır. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. A. Yakalama ve konumlandırma fagositik bir RAW hücre gelecek fumigatus. (A) sıkışıp A. aydınlık görüntüler fumigatus, kırmızı ok ile gösterilen yol boyunca taşınır ve konumlandırılmış, beyaz ok ile gösterilir. Sıkışıp patojen organizma biraz odak düzlemi üzerinde iterek tuzak nedeniyle odak dışı biraz. İstenen RAW hücreye bitişik yerleştirilen kadar fumigatus taşınır. (B) GribiA. fagositoz orescence görüntüleme RAW hücre tarafından fumigatus. Sıkışıp patojen RAW hücreye yerleştirildikten sonra, fagositoz süreç devreye girer. 30 sn, RAW hücre zarı etrafında bir fincan parçacık değiştirmek ve form başlar. 60 s, fincan tam olarak oluşur. 90s 150s, A. fumigatus sardı ve 180 s, parçacık tamamen içselleştirmiş <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Optik tuzak anti-CD3 antikoru ile bir boncuk kaplamalı yanında bir konuma taşındı T-hücre birincil primer T hücre anti-CD3 kaplı boncuklar ile sinaps formu. DIC görüntü bindirme. Hücre, daha sonra görüntüleri kolayca ayırt edilemez bir immünolojik sinaps oluşturur.

<ol>
	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

- 5 mikron Bu çalışmada, 3 mikron arasında boyutları ile patojenler yakalamak için optik bir tuzak. Laboratuara ilgi patojenler genellikle bu boyutları olsa da, burada açıklanan optik cımbız sistemi, boyutları çok geniş bir yelpazede yakalamak için esnek. Aslında optik tuzakları tek atomdan hücreleri çapı yaklaşık 10 mikron arasında değişen partiküller yakalamak için kullanılmıştır. Küresel, eliptik ve biyolojik patojenler ile çalışırken yararlı çok uzamış parçacıklar: Ayrıca, ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Albino zorlanma, B-5233/RGD12-8, KJ Kwon-Chung, NIH hediye </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutant, Eleftherios Mylonakis, MGH hediye SC5314 zorlanma, Gerald Fink hediye, Whitehead Enstitüsü&#39;nden </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetilformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Taze kan </td><td></td><td></td><td> MGH, HMS RJW Heath, hediyelik </td></tr><tr><td> Nikon inverted mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Model Ti-E </td></tr><tr><td> Yakalama lazer, ChromaLase </td><td> Blue Sky Araştırma </td><td> CLA-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan uyarma lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td> Model Innova 70C </td></tr><tr><td> Yakalama bileşenleri için Breadboards </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Optik hava tablo </td><td> Teknik Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pedal kontrolü Elektronik shutter </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Vincent Associates, Rochester, NY satın </td></tr><tr><td> Singlemode fiber optik </td><td> Oz Optics </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber pozisyoner </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Fiber kolimatör </td><td> Oz Optics </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Teleskop için objektifler </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Odak uzaklığı 150 mm </td></tr><tr><td> Çeviri aşamaları (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dikroik ayna </td><td> Renk parlaklığı </td><td> ET750-sp-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> Objektif lens (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1.49, immersiyon yağı, TIRF hedefi </td></tr><tr><td> Konfokal kafa </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Kutuplaştırıcı </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston prizma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD kamera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Filtre tekerlek </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre tekerlek </td><td> Sutter </td><td> LB10-Nwe </td><td></td></tr><tr><td> Odacıklı coverglass </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Anti-CD3 ile kaplı </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Dinamik canlı hücre görüntüleme, bağışıklık sistemi 1, 2 hücreleri arasında gerçek zamanlı etkileşim doğrudan görselleştirme sağlar; Ancak, fagositik hücre ve mikrop arasındaki mekansal ve zamansal kontrol eksikliği patojenlere karşı konak yanıtının ilk etkileşimler içine gözlemler odaklı hale getirdi zordur. Tarihsel olarak, hücrelerarası kişi olaylarının fagositoz 3 gibi iki hücre tipleri karıştırma imaged ve sonra sürekli etkileşim uygun aşamada serendipitous hücrelerarası kişileri bulmak için tarama alan görünümü. Bu olayların stokastik bu sürecin doğa sıkıcı işler ve bu yaklaşım, erken ya da hücre-hücre teması kısacık olaylar gözlemlemek zordur. Bu yöntemi, temas eşiğinde hücre çiftleri bulma ve onlar erdirmek onların iletişim kadar onları gözlemleyerek gerektirir, ya da yoktur. Bu sınırlamaları aşması için, hücre kültürü yerleştirmek için bir non-invaziv, yıkıcı olmayan, ancak hızlı ve etkili bir yöntem olarak optik yakalama kullanın. Optik tuzaklar, ya da optik cımbız, giderek, hücre ve diğer mikron boyutlu parçacıklar üç boyutlu 4 yakalama ve fiziksel olarak manipüle biyolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Radyasyon basıncı ilk gözlenen ve 1970 5, 6, optik cımbız sistemleri uygulanan ve ilk kez 1987 7 biyolojik örneklerin kontrol etmek için kullanılmıştır. O zamandan beri, çeşitli biyolojik olgunun 8-13 prob optik cımbız bir teknoloji haline gelmişti. Biz gelişmeler, optik bir tuzak olarak belirlenen ana hücreleri ile etkileşimleri kolaylaştırmak için fizyolojik bir ortamda patojen organizmaların nefis mekansal ve zamansal kontrol sağlamak için sıcaklık ve nem kontrolü ile disk konfokal mikroskopi iplik ile entegre ederek hücre görüntüleme canlı bir yöntem 14 tarif operatörü. Canlı, immün sistemi baskılanmış bireyler 15, 16 (örneğin AIDS, kemoterapi, ve organ nakli), potansiyel olarak ölümcül, invaziv enfeksiyonlara neden Candida albicans ve Aspergillus, patojen organizmalar gibi optik bitişik tahribatsız lazer yoğunlukları kullanılarak yakalanmış ve taşındı makrofajlar, patojen fagosite. Yüksek çözünürlük, ışık ve floresan tabanlı filmler iletilen canlı hücreler fagositoz erken olayları gözlemleme yeteneği kurulmuştur. Immünoloji geniş uygulanabilirliğini göstermek için, birincil T-hücrelerinin sıkışıp kalmasına ve in vivo anti-CD3 kaplı mikrosferler ile sinaps oluşturmak için manipüle ve sinaps oluşumu zaman atlamalı görüntü de elde edildi. Canlı patojenlerin bağışıklık sistemi hücrelerine göre ince mekansal kontrolü uygulamak için bir yöntem sağlayarak, hücresel etkileşimler hücrelere az pertürbasyon floresan mikroskobu ile yakalanan ve güçlü bir anlayış doğal ve adaptif bağışıklık erken cevaplar verebilmesidir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Video: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Makrofaj Fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...