Name: visualizing the early stages of phagocytosis
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Early Stages of Phagocytosis at JoVE.com

Biz görüntüleme için MİT Whitehead Enstitüsü Wendy Somon ve Keck tesisin Nicki Watson teşekkür ederim.

DC2.4 ve RAW 264.7 Hücre Hatları 1. Hazırlık Not: makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7 ve dendritik hücre çizgisi DC2.4 hem sıçangil kökenli ve aşağıdaki koşullar hücreleri büyütmek için kullanıldı. <ol><li> Ile takviye edilmiş DMEM içinde RAW 264.7 hücreleri (Dulbecco minimal Eagle ortamı) büyütün% 10,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu (FBS). </li><li> L-Glutamin yerine DMEM ile takviye edilmiş RPMI kullanımı (Roswell Park Memorial Institute) ortamı dışında RAW 264.7 hücreleri bu benzer koşullar altında DC2.4 hücreleri büyütün. </li></ol> 2. Fluoresan Konjuge parçacıkların hazırlanması: C. albicans, zimosan, IgG kaplı boncuklar <ol><li> Candida albicans Büyüyen <ol><li> URI (% 2 Bacto-pepton,% 1 ile takviye YPD 25 ml donmuş gliserol stokundan bir C. albicans soyu SC5314 inokülemaya ekstresi,% 2 glukoz ve gece boyunca 30 ° C&#39;de 80 ug / ml Üridin). NOT: OD 12 600 den fazla Candida kültürü büyüyen kaçının. </li><li> C. albicans 1 ml alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1 ml PBS ile pelet yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile pelet toplayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 2.1.4. </li><li> Fagositler sayısına göre C. albicans enfeksiyonu (İB) arasında çok sayıda hesapla ve bölüm 3 OD tarif edildiği gibi 1, 600 1, ml başına 2.5 x 10 7 Candida albicans eşdeğerdir fagositoz testinde devam edin. Not: Candida-BFP Üretimi referans 13&#39;de açıklanmaktadır. </li></ol></li><li> Zimosan ve IgG kaplanmış tanelerin hazırlanması Not: zimosan bir β-glukan içerenSaccharomyces cerevisiae türetilen mantar karbohidrat parçacık hazırlanması. Zimosan makrofajlar ve dendritik hücreler ve inflamasyonun uyandırmak için bilinmektedir ve bu fagositoz çalışmaları 13, 14, 15, yaygın olarak kullanılmaktadır. <ol><li> Kısaca partikülleri içeren tüp vorteks ve 1.5 ml tüp içine bir deney için yeterli bir miktar kısım. NOT: Genelde biz (bir hücre için, 10 zimosan parçacıkları veya IgG kaplı boncuklar ekleyin) 01:10 oranını kullanın. </li><li> gibi soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir ve 10,000 x g &#39;de 1 dakika süre ile santrifüjleme ile parçacıkların toplanması. </li><li> Süpernatant aspire ve 1 ml buz gibi soğuk PBS pelletini. </li><li> Adımları tekrarlayın 2.2.2-2.2.3 Not: 2.2.5 adım veya kullanılana kadar 4 ° C &#39;de tüp depolamak için devam edin. </li><li> Bir önlemek için ultrasonik banyo sonikatörü içinde 10 sn için parçacık (120 V, 50-60 kHz) sonikasyonny parçacık toplama. </li></ol></li></ol> 3. Fagositoz Not: Fagositoz partikülünün yüzeyinde ligandlarla PRRS etkileşimiyle fagositlerin hücre yüzeyi üzerinde parçacıkların bağlanması ile başlayan karmaşık bir süreçtir. Bağlama aktin montaj ve temas yerinde ilişkili proteinler ve fagositik fincan oluşumu tarafından takip edilir. daha sonra aktin sökme fagozomun oluşur ve partikül tam yutulma sonuçlanır. biz fagositoz farklı aşamalarını tarif görebilirsiniz. <ol><li> Bağlanma Deneyi NOT: Bu deneyin amacı, hedef partikülleri üzerine ligand ve fagositlerle ilgili reseptörleri arasındaki etkileşimi, fagositoz ilk adım izlemektir. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Alternonları bir arada, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasına slayt (veya plakası) yerleştirin. </li><li> Yavaşça her bir kuyunun bir pipet veya aspiratörü kullanarak orta çıkarın. DİKKAT: odacıklı coverglass sisteminin her kuyu küçük dikkatle bu adımı gerçekleştirin; bir pipet ucu veya aspiratör güçlü bir hava akımı ile hücreleri karıştırmayı kolaydır. </li><li> bir hücre kültür ortamı ile floresan etiketli parçacıkları karıştırın (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Hücrelere, (10 MOl&#39;de) floresan konjüge-zimosan veya lateks boncuklar-tavşan IgG-FITC (hücre başına 10 parçacıklar) Candida -BFP ekleyin. Tüm hücreler sahiptir sağlamak için de bir odadan 200 ul ortam bir son hacim kullanın. </li><li> 277 de kamara slayt aşağı Spin10 ° C&#39;de 3 dakika boyunca xg. Not: Bu santrifüj adımı parçacık ve hücreler arasındaki teması artırmak için yardımcı olur ve bağlayıcı işlem eşitler. </li><li> Hemen 5 dakika için% 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın. </li><li> inkübatör odasına slayt çıkarın ve medya aspire. </li><li> Hücreler buzla soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. NOT: ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse PBS ile birkaç kez yıkayın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için kuyudan bağlanmamış parçacıkları çıkarmak için esastır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek, PBS içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) eklenerek hücrelerin sabitleyin. DİKKAT: Bu adım, yüksek toksik, paslandırıcı ve potansiyel kanserojendir% 4 PFA kullanılmasını gerektirir. Bu sıvıyı kullanırken uygun dikkatli alınmalıdır. Ayrıca, ışık örnekleri korur. </li><li&gt; Odasına PBS 500 ul ekleyerek hücrelerin yıkayın ve yavaşça çözüm aspire. </li><li> iki kere 3.1.9 adımı yineleyin. NOT: Bu aşamada, hemen önceki PBS çıkardıktan sonra her flakon doldurun. </li><li> 10 dakika boyunca PBS içinde 50 mM NH4CI 500 ul inkübe edilerek tespit durdurun. </li><li> Aşama 3.1.10 tarif edildiği gibi PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.1 saponin,% 0.2 BSA) bağlayıcı tampon 250 ul ilave edilerek hücreler geçirgenliği. </li><li> Leke (: bağlayıcı tampon içinde 500 1 seyreltilmiş) floresan konjuge Phalloidin ekleyerek F-aktin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe hücreleri. </li><li> Aşama 3.1.10 de tarif edildiği gibi hücreler PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Konfokal mikroskop (63X objektif ve 402 nm ve 488 nm lazer) kullanarak görüntüleri yakalayabilir ve ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz. Not: başarılı bir parçacık fagositik cu varlığı ile karakterize edilir bağlanmayerinde p nerede partikül temas fagositik hücre (Şekil 1). adım 3.2.5 bakınız. </li></ol></li><li> Fagositoz Uptake Tahlili Not: Bu deney konfokal mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak fagositlerce floresan etiketli parçacıkların tam içselleştirilmesini izlemek için tasarlanmıştır. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Seçenek olarak ise, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasının slaytlar (veya plakası) tutun. NOT: Soğutma senkronize bir fagositoz için sonradan endositoz yanı sıra istenmeyen fagositoz engellemek ve için gereklidir. </li><li> perf3.1.3 den 3.1.5 için orm adımlar </li><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın ve farklı zaman noktalarında inkübe edilir. 30, 60 ve 90 dakika sonrası enfeksiyondan sonra hücrelerin sabitleyin. C. albicans 60 dakika sonrası enfeksiyon hif oluşmaya başlar gözlemlemek; fagositler 90 dakika 8 sonra hücre ölümünü (pyroptosis) göstermeye başlar. Not: Bu bir öneridir ve optimizasyon hücre tipine ve kullanılan parçacık bağlı esastır. </li><li> 3.1.7&#39;de den 3.1.15 adımları uygulayın. ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz edin. Not: başarılı bir alım bir fagosit sitoplazması içinde bir parçacık tam içselleştirme ile karakterize edilir (Şekil 2). Böyle Phalloidin olarak hücre yüzey işaretleyici ile fagositler boyanan hücrelerin kontur çizmek için yardımcı olur. Parçacık, hücre yüzeyi ya YAPIM bağlı olup olmadığını belirlemek için, aynı zamanda sırayla Z yığınları yerine esastıretely içselleştirilmiş. </li></ol></li><li> Fagositoz Canlı Görüntüleme NOT: Bu protokolde floresan konjuge zymosan kullanarak fagositoz farklı aşamalarında yakalamak için konfokal mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz istikrarlı bir şekilde mCherry etiketli F-aktin 8 ifade dendritik hücre hattını DC2.4, canlı hücrelerde ipliksi aktin dağılımını gösteren bir biyosensör kullanın. Fagositoz bir aktin odaklı süreç olduğu için bu hücrede canlı görüntüleme F-aktin ağ hareketini ve dinamiklerini yakalamak için bize sağlar, fakat aynı zamanda canlı hücrelerin içinde farklı fagositik olayları (Şekil 3, Film 1) görselleştirmek için değil sadece. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir konsantrasyonda bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. NOT: Hücreler hemasitometre veya kullanılarak sayılabilirBenzer bir teknik. </li><li> 10 dakika buz üzerinde odasının slaytlar tutun. Not: Soğutma istenmeyen alımını engellemek için, bir senkronize fagositoz olması için gereklidir. </li><li> 3.1.3 den 3.1.5 için adımları uygulayın </li><li> 37 ° C mikroskop aşamasında önceden ısıtmak ve% 5 CO2 ile bölme dengeye. Görüntüleme başlamadan önce stabilize etmek için sıcaklık ve CO 2 için 30-45 dakika bekleyin. NOT: CO 2 ve sıcaklık seviyeleri fagositoz için kritik olduğundan, çevre odasına dengelenmesi deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açmak için çok önemlidir. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde dengelenmiş mikroskop inkübatör muhafaza içinde hücreleri ihtiva eden odası slayt yerleştirin. </li><li> Canlı görüntüleme 17, 18 gerçekleştirin. NOT: Lazer gücü (kazanç, iğne deliği, vs.) ayarları th türüne bağlı olarak değişebilire mikroskop ve floresan prob kullanılır. Bu nedenle, biz canlı görüntüleme 17,18 optimal durum için mikroskop kılavuzuna danışmanızı öneririz. <ol><li> odaklı lazer tarama mikroskobu (ve ilgili yazılım) canlı görüntüleme için kullanılır. 1-1,1 Havalı birimlerinin bir toplu iğne deliğine sahip 63X 1.4NA yağı amacı kullanın. </li><li> görüntüleme başlatmak için, oda slaytta bir temsilci bölgesini bulmak için parlak bir alan kullanılır. Sonra, yazılım üzerinde pozisyonu seçeneğini tıklatarak alanı seçin. 488 ve 582 nm arasında dalga boylarını algılayacak şekilde, 582 nm dalga boyunda bir ışın ayırıcı ile 488 nm lazer için filtre seti kullanılan Takip 1 GFP tespit etmek. </li><li> Takip 2 mCherry (RFP) için en uygun ayarlanmış bir filtre 578 nm ışın ayırıcı kullanarak ve nm 578 ila 600 dalga boylarını tespit seçin. 488 nm ve% 50 lazer güç ve 600-700 bir kazanç çıkışı ile 578 nm lazer kullanır. 90 dakika olmak üzere toplam görüntüleri her 30 sn edinin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Janeway, C. A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition.">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+macrophage+&amp;#34;probing&amp;#34;+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets.">Dynamic macrophage &amp;#34;probing&amp;#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis.">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li><li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans.">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).</li><li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+cholesterol,+lateral+mobility,+and+the+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin.">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li><li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis.">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li><li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li><li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton's+Tyrosine+Kinase+(BTK)+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages.">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance.">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li><li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages.">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li><li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering.">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li><li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+host-Leishmania+interactions:+significance+in+visceral+leishmaniasis.">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li><li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii.">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

makrofajlar ve dendritik hücreler gibi profesyonel fagositler, yutmak ve bu nedenle işgalci patojenlere konak savunma sisteminin önemli bir bileşeni fagositozunu yapma ortadan kaldırır. Bu işlem sırasında fagositler, hücre yüzeyi 8, 19, 20, geniş bir membran yeniden düzenlenmesi ve hücre iskeleti bir yeniden düzenlenmeye maruz. daha bu dinamik süreci anlamak için, fagositoz farklı aşamalarında görselleştir...

Bakteriler, virüsler ve mantarlar gibi patojenlere sürekli maruz kalma rağmen, vücudumuzun iyi enfeksiyona karşı koruma sağlayan bağışıklık mekanizması ile donatılmıştır. doğuştan gelen bağışıklık sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve tanımak ve yabancı hedeflere içselleştirmek fagositik hücreler esas dayanır. Fagositoz 0.5 um&#39;den daha büyük, istenmeyen parçacıkların yutulmasına kapsar evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücresel bir süreçtir. Fagositik hücreler yutulma 3 önce patojenler üzerinde mevcut olan patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) tanımasını sağlamak hücre yüzeyinde (aynı zamanda görüntü tanıma reseptörleri PRR&#39;ler olarak da bilinir), bağışıklık reseptörlerin geniş bir ifade eder. Patojen hücre yüzeyindeki reseptör kümeleme tarafından takip ve bir fagositik fincan oluşumunu tetikler bağlama. Bu çevrede çıkıntı aktin odaklı membran yeniden sonuçlanırHedef, sonunda onu saran ve kıstırma-off ayrı bir phagosomal çarpıtma 2, 5 oluşturulur. Fagosom sonra olgunlaşır phagolysosome 6 oluşturan Geç endozomlar ve lizozomlar ile daha sonra füzyon yoluyla acidifies. Fagositoz reseptör aracılı aktin odaklı bir olay olarak tarif edilmiş olmasına rağmen, bu işlem aynı zamanda, fosfoinositidlerde (İng) ve sfingolipidler 7, 8, plazma zarını oluşturan lipidler, mekansal ve zamansal değişikliği dayanır. Aktin polimerizasyonu fagositik fincan dibinde fosfoiyonositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) yerel bir birikimi tarafından dikte edilirken, aktin depolimerizasyon (PI (4,5) P dönüşümü bağlıdır 2 fosfoinositol-3,4,5-bifosfat için (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Her iki modifikasyonundahedef etrafında psödopod ve ikinci phagocyte 10 sitozolde parçacıkların batan sağlayan başarılı uzantısı eski yol açar olarak önemlidir. Fagosite yeteneğine sahip hücreler, ya -profesyonel fagositlerin, makrofajlar / monositler, granülositler / nötrofil ve dendritik hücreler (DC) ya da fibroblast ve epitel hücreleri 11 ile profesyonel olmayan fagositler gibi. profesyonel fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz patojenlere karşı doğal ve kazanılmış bağışıklık yanıtının koordinasyonundan sorumlu iken, tüm fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz, doku bakım ve yeniden merkezi bir rol oynar. Profesyonel fagositler sadece adaptif bağışıklık sisteminin lenfoid hücrelere de mevcut antijenleri yutan ve patojen öldürmek, yok ama. Bundan dolayı, bu yol, pro-enflamatuar sitokinlerin salınması ve lemfoid hücrelerin katılımı katkıdaenfeksiyon 12 başarılı blokajı. Geleneksel biyokimyasal teknikler post-translasyonel modifikasyonlar ve proteinler arasındaki çeşitli yüksek afiniteli birlikleri gibi fagositoz sırasında farklı hücresel süreçleri, moleküler mekanizması ile ilgili bilgi kazanıyor vesile olmuştur. Bununla birlikte, bilinen biyokimyasal yöntemler kullanılarak fagositik etkinlik mekansal ve zamansal dinamikleri ile ilgili bilgiler elde etmek zordur. Canlı hücre görüntüleme sadece bize zaman hassas bir şekilde hücresel olayları izlemek için izin verir ama aynı zamanda bir tek hücre düzeyinde bilgi edinmek için bize sağlar. Burada fagositoz farklı aşamalarında araştırmak için bir yöntem tarif yanı sıra konfokal mikroskopi kullanılarak spatiotemporally tüm süreci analiz etmek.

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Minimal Eagle&amp;rsquo;s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122&quot;&gt;15-140-122&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 with grids</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the early stages of phagocytosis

memeli vücut patojen istilası kendisini savunmak için yardımcı mekanizmaların çeşitli katmanları ile donatılmıştır. Nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi - - bağışıklık sisteminin -profesyonel fagositlerin algılar ve fagositoz 1 boyunca bu işgalci patojenlere temizlemek için doğal yeteneğini muhafaza. Fagositoz hücre yüzeyinde 2, 3 membran yeniden ve aktin biçimlenme koreografi olayları kapsar. Fagositler başarıyla içselleştirmesi ve fagositoz tüm aşamaları yerine sadece yabancı molekülleri ortadan kaldırmak. Bu adımlar tanıma ve hücre yüzeyinde bulunan örüntü tanıma reseptörleri tarafından patojen (PRR) bağlanmasını içerir, aktin-zenginleştirilmiş membranöz çıkıntıları (psödopod) aracılığıyla fagositik fincan oluşumu partikül çevreleyen ve fagozomun kesme phagolysosome olgunlaşması ile izledi sonuçlanırpatojen 3, 4 öldürülmesi. fagositoz çeşitli aşamalarında Görüntüleme ve miktar bu hücresel sürecin moleküler mekanizmaların için enstrümantal. Mevcut el yazması fagositoz farklı aşamalarını incelemek için yöntemler bildirir. Biz görselleştirmek ve bağlayıcı, fagositik fincan oluşumunu ölçmek için bir mikroskop temelli bir yaklaşım ve fagositlerce partikül içselleştirilmesi açıklar. Fagositik hücreler üzerinde doğuştan reseptörleri den büyük 0,5 mikron, burada mevcut tahliller patojenik mantar Candida albicans ve zimosan ve IgG kaplı boncuklar gibi diğer parçacıkların kullanımını içermektedir hedef parçacığa ligandlar karşılaştıklarında fagositoz oluşur olarak.

fagositoz farklı aşamalarında izlemek için mikroskop tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. DC2.4 hücreleri tarafından çeşitli floresan parçacıkların fagositozu sırasında farklı olaylar gösterilir. Burada tarif edilen teknikler kullanılarak, fagositoz erken aşamalarında sfingolipidler rolünü araştırdık. Bu amaçla, Sptlc2, sphingolipid biyosentetik yolundaki birinci ve oran kısıtlayıcı aşamayı katalizleyen enzim genetik eksikliği DC2.4 dendritik hücreler kullanıldı. Vahşi tip hücrelere k...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Early Stages of Phagocytosis at JoVE.com

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Video: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

IgG-opsonize Kırmızı Kan Hücrelerinin Makrofaj Fagositozunun Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler