Biz görüntüleme için MİT Whitehead Enstitüsü Wendy Somon ve Keck tesisin Nicki Watson teşekkür ederim.

DC2.4 ve RAW 264.7 Hücre Hatları 1. Hazırlık Not: makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7 ve dendritik hücre çizgisi DC2.4 hem sıçangil kökenli ve aşağıdaki koşullar hücreleri büyütmek için kullanıldı. <ol><li> Ile takviye edilmiş DMEM içinde RAW 264.7 hücreleri (Dulbecco minimal Eagle ortamı) büyütün% 10,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu (FBS). </li><li> L-Glutamin yerine DMEM ile takviye edilmiş RPMI kullanımı (Roswell Park Memorial Institute) ortamı dışında RAW 264.7 hücreleri bu benzer koşullar altında DC2.4 hücreleri büyütün. </li></ol> 2. Fluoresan Konjuge parçacıkların hazırlanması: C. albicans, zimosan, IgG kaplı boncuklar <ol><li> Candida albicans Büyüyen <ol><li> URI (% 2 Bacto-pepton,% 1 ile takviye YPD 25 ml donmuş gliserol stokundan bir C. albicans soyu SC5314 inokülemaya ekstresi,% 2 glukoz ve gece boyunca 30 ° C&#39;de 80 ug / ml Üridin). NOT: OD 12 600 den fazla Candida kültürü büyüyen kaçının. </li><li> C. albicans 1 ml alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1 ml PBS ile pelet yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile pelet toplayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 2.1.4. </li><li> Fagositler sayısına göre C. albicans enfeksiyonu (İB) arasında çok sayıda hesapla ve bölüm 3 OD tarif edildiği gibi 1, 600 1, ml başına 2.5 x 10 7 Candida albicans eşdeğerdir fagositoz testinde devam edin. Not: Candida-BFP Üretimi referans 13&#39;de açıklanmaktadır. </li></ol></li><li> Zimosan ve IgG kaplanmış tanelerin hazırlanması Not: zimosan bir β-glukan içerenSaccharomyces cerevisiae türetilen mantar karbohidrat parçacık hazırlanması. Zimosan makrofajlar ve dendritik hücreler ve inflamasyonun uyandırmak için bilinmektedir ve bu fagositoz çalışmaları 13, 14, 15, yaygın olarak kullanılmaktadır. <ol><li> Kısaca partikülleri içeren tüp vorteks ve 1.5 ml tüp içine bir deney için yeterli bir miktar kısım. NOT: Genelde biz (bir hücre için, 10 zimosan parçacıkları veya IgG kaplı boncuklar ekleyin) 01:10 oranını kullanın. </li><li> gibi soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir ve 10,000 x g &#39;de 1 dakika süre ile santrifüjleme ile parçacıkların toplanması. </li><li> Süpernatant aspire ve 1 ml buz gibi soğuk PBS pelletini. </li><li> Adımları tekrarlayın 2.2.2-2.2.3 Not: 2.2.5 adım veya kullanılana kadar 4 ° C &#39;de tüp depolamak için devam edin. </li><li> Bir önlemek için ultrasonik banyo sonikatörü içinde 10 sn için parçacık (120 V, 50-60 kHz) sonikasyonny parçacık toplama. </li></ol></li></ol> 3. Fagositoz Not: Fagositoz partikülünün yüzeyinde ligandlarla PRRS etkileşimiyle fagositlerin hücre yüzeyi üzerinde parçacıkların bağlanması ile başlayan karmaşık bir süreçtir. Bağlama aktin montaj ve temas yerinde ilişkili proteinler ve fagositik fincan oluşumu tarafından takip edilir. daha sonra aktin sökme fagozomun oluşur ve partikül tam yutulma sonuçlanır. biz fagositoz farklı aşamalarını tarif görebilirsiniz. <ol><li> Bağlanma Deneyi NOT: Bu deneyin amacı, hedef partikülleri üzerine ligand ve fagositlerle ilgili reseptörleri arasındaki etkileşimi, fagositoz ilk adım izlemektir. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Alternonları bir arada, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasına slayt (veya plakası) yerleştirin. </li><li> Yavaşça her bir kuyunun bir pipet veya aspiratörü kullanarak orta çıkarın. DİKKAT: odacıklı coverglass sisteminin her kuyu küçük dikkatle bu adımı gerçekleştirin; bir pipet ucu veya aspiratör güçlü bir hava akımı ile hücreleri karıştırmayı kolaydır. </li><li> bir hücre kültür ortamı ile floresan etiketli parçacıkları karıştırın (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Hücrelere, (10 MOl&#39;de) floresan konjüge-zimosan veya lateks boncuklar-tavşan IgG-FITC (hücre başına 10 parçacıklar) Candida -BFP ekleyin. Tüm hücreler sahiptir sağlamak için de bir odadan 200 ul ortam bir son hacim kullanın. </li><li> 277 de kamara slayt aşağı Spin10 ° C&#39;de 3 dakika boyunca xg. Not: Bu santrifüj adımı parçacık ve hücreler arasındaki teması artırmak için yardımcı olur ve bağlayıcı işlem eşitler. </li><li> Hemen 5 dakika için% 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın. </li><li> inkübatör odasına slayt çıkarın ve medya aspire. </li><li> Hücreler buzla soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. NOT: ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse PBS ile birkaç kez yıkayın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için kuyudan bağlanmamış parçacıkları çıkarmak için esastır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek, PBS içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) eklenerek hücrelerin sabitleyin. DİKKAT: Bu adım, yüksek toksik, paslandırıcı ve potansiyel kanserojendir% 4 PFA kullanılmasını gerektirir. Bu sıvıyı kullanırken uygun dikkatli alınmalıdır. Ayrıca, ışık örnekleri korur. </li><li&gt; Odasına PBS 500 ul ekleyerek hücrelerin yıkayın ve yavaşça çözüm aspire. </li><li> iki kere 3.1.9 adımı yineleyin. NOT: Bu aşamada, hemen önceki PBS çıkardıktan sonra her flakon doldurun. </li><li> 10 dakika boyunca PBS içinde 50 mM NH4CI 500 ul inkübe edilerek tespit durdurun. </li><li> Aşama 3.1.10 tarif edildiği gibi PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.1 saponin,% 0.2 BSA) bağlayıcı tampon 250 ul ilave edilerek hücreler geçirgenliği. </li><li> Leke (: bağlayıcı tampon içinde 500 1 seyreltilmiş) floresan konjuge Phalloidin ekleyerek F-aktin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe hücreleri. </li><li> Aşama 3.1.10 de tarif edildiği gibi hücreler PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Konfokal mikroskop (63X objektif ve 402 nm ve 488 nm lazer) kullanarak görüntüleri yakalayabilir ve ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz. Not: başarılı bir parçacık fagositik cu varlığı ile karakterize edilir bağlanmayerinde p nerede partikül temas fagositik hücre (Şekil 1). adım 3.2.5 bakınız. </li></ol></li><li> Fagositoz Uptake Tahlili Not: Bu deney konfokal mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak fagositlerce floresan etiketli parçacıkların tam içselleştirilmesini izlemek için tasarlanmıştır. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Seçenek olarak ise, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasının slaytlar (veya plakası) tutun. NOT: Soğutma senkronize bir fagositoz için sonradan endositoz yanı sıra istenmeyen fagositoz engellemek ve için gereklidir. </li><li> perf3.1.3 den 3.1.5 için orm adımlar </li><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın ve farklı zaman noktalarında inkübe edilir. 30, 60 ve 90 dakika sonrası enfeksiyondan sonra hücrelerin sabitleyin. C. albicans 60 dakika sonrası enfeksiyon hif oluşmaya başlar gözlemlemek; fagositler 90 dakika 8 sonra hücre ölümünü (pyroptosis) göstermeye başlar. Not: Bu bir öneridir ve optimizasyon hücre tipine ve kullanılan parçacık bağlı esastır. </li><li> 3.1.7&#39;de den 3.1.15 adımları uygulayın. ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz edin. Not: başarılı bir alım bir fagosit sitoplazması içinde bir parçacık tam içselleştirme ile karakterize edilir (Şekil 2). Böyle Phalloidin olarak hücre yüzey işaretleyici ile fagositler boyanan hücrelerin kontur çizmek için yardımcı olur. Parçacık, hücre yüzeyi ya YAPIM bağlı olup olmadığını belirlemek için, aynı zamanda sırayla Z yığınları yerine esastıretely içselleştirilmiş. </li></ol></li><li> Fagositoz Canlı Görüntüleme NOT: Bu protokolde floresan konjuge zymosan kullanarak fagositoz farklı aşamalarında yakalamak için konfokal mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz istikrarlı bir şekilde mCherry etiketli F-aktin 8 ifade dendritik hücre hattını DC2.4, canlı hücrelerde ipliksi aktin dağılımını gösteren bir biyosensör kullanın. Fagositoz bir aktin odaklı süreç olduğu için bu hücrede canlı görüntüleme F-aktin ağ hareketini ve dinamiklerini yakalamak için bize sağlar, fakat aynı zamanda canlı hücrelerin içinde farklı fagositik olayları (Şekil 3, Film 1) görselleştirmek için değil sadece. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir konsantrasyonda bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. NOT: Hücreler hemasitometre veya kullanılarak sayılabilirBenzer bir teknik. </li><li> 10 dakika buz üzerinde odasının slaytlar tutun. Not: Soğutma istenmeyen alımını engellemek için, bir senkronize fagositoz olması için gereklidir. </li><li> 3.1.3 den 3.1.5 için adımları uygulayın </li><li> 37 ° C mikroskop aşamasında önceden ısıtmak ve% 5 CO2 ile bölme dengeye. Görüntüleme başlamadan önce stabilize etmek için sıcaklık ve CO 2 için 30-45 dakika bekleyin. NOT: CO 2 ve sıcaklık seviyeleri fagositoz için kritik olduğundan, çevre odasına dengelenmesi deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açmak için çok önemlidir. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde dengelenmiş mikroskop inkübatör muhafaza içinde hücreleri ihtiva eden odası slayt yerleştirin. </li><li> Canlı görüntüleme 17, 18 gerçekleştirin. NOT: Lazer gücü (kazanç, iğne deliği, vs.) ayarları th türüne bağlı olarak değişebilire mikroskop ve floresan prob kullanılır. Bu nedenle, biz canlı görüntüleme 17,18 optimal durum için mikroskop kılavuzuna danışmanızı öneririz. <ol><li> odaklı lazer tarama mikroskobu (ve ilgili yazılım) canlı görüntüleme için kullanılır. 1-1,1 Havalı birimlerinin bir toplu iğne deliğine sahip 63X 1.4NA yağı amacı kullanın. </li><li> görüntüleme başlatmak için, oda slaytta bir temsilci bölgesini bulmak için parlak bir alan kullanılır. Sonra, yazılım üzerinde pozisyonu seçeneğini tıklatarak alanı seçin. 488 ve 582 nm arasında dalga boylarını algılayacak şekilde, 582 nm dalga boyunda bir ışın ayırıcı ile 488 nm lazer için filtre seti kullanılan Takip 1 GFP tespit etmek. </li><li> Takip 2 mCherry (RFP) için en uygun ayarlanmış bir filtre 578 nm ışın ayırıcı kullanarak ve nm 578 ila 600 dalga boylarını tespit seçin. 488 nm ve% 50 lazer güç ve 600-700 bir kazanç çıkışı ile 578 nm lazer kullanır. 90 dakika olmak üzere toplam görüntüleri her 30 sn edinin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Janeway, C. A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition.">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+macrophage+&amp;#34;probing&amp;#34;+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets.">Dynamic macrophage &amp;#34;probing&amp;#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis.">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li><li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans.">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).</li><li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+cholesterol,+lateral+mobility,+and+the+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin.">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li><li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis.">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li><li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li><li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton's+Tyrosine+Kinase+(BTK)+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages.">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance.">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li><li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages.">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li><li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering.">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li><li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+host-Leishmania+interactions:+significance+in+visceral+leishmaniasis.">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li><li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii.">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

makrofajlar ve dendritik hücreler gibi profesyonel fagositler, yutmak ve bu nedenle işgalci patojenlere konak savunma sisteminin önemli bir bileşeni fagositozunu yapma ortadan kaldırır. Bu işlem sırasında fagositler, hücre yüzeyi 8, 19, 20, geniş bir membran yeniden düzenlenmesi ve hücre iskeleti bir yeniden düzenlenmeye maruz. daha bu dinamik süreci anlamak için, fagositoz farklı aşamalarında görselleştir...

Bakteriler, virüsler ve mantarlar gibi patojenlere sürekli maruz kalma rağmen, vücudumuzun iyi enfeksiyona karşı koruma sağlayan bağışıklık mekanizması ile donatılmıştır. doğuştan gelen bağışıklık sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve tanımak ve yabancı hedeflere içselleştirmek fagositik hücreler esas dayanır. Fagositoz 0.5 um&#39;den daha büyük, istenmeyen parçacıkların yutulmasına kapsar evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücresel bir süreçtir. Fagositik hücreler yutulma 3 önce patojenler üzerinde mevcut olan patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) tanımasını sağlamak hücre yüzeyinde (aynı zamanda görüntü tanıma reseptörleri PRR&#39;ler olarak da bilinir), bağışıklık reseptörlerin geniş bir ifade eder. Patojen hücre yüzeyindeki reseptör kümeleme tarafından takip ve bir fagositik fincan oluşumunu tetikler bağlama. Bu çevrede çıkıntı aktin odaklı membran yeniden sonuçlanırHedef, sonunda onu saran ve kıstırma-off ayrı bir phagosomal çarpıtma 2, 5 oluşturulur. Fagosom sonra olgunlaşır phagolysosome 6 oluşturan Geç endozomlar ve lizozomlar ile daha sonra füzyon yoluyla acidifies. Fagositoz reseptör aracılı aktin odaklı bir olay olarak tarif edilmiş olmasına rağmen, bu işlem aynı zamanda, fosfoinositidlerde (İng) ve sfingolipidler 7, 8, plazma zarını oluşturan lipidler, mekansal ve zamansal değişikliği dayanır. Aktin polimerizasyonu fagositik fincan dibinde fosfoiyonositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) yerel bir birikimi tarafından dikte edilirken, aktin depolimerizasyon (PI (4,5) P dönüşümü bağlıdır 2 fosfoinositol-3,4,5-bifosfat için (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Her iki modifikasyonundahedef etrafında psödopod ve ikinci phagocyte 10 sitozolde parçacıkların batan sağlayan başarılı uzantısı eski yol açar olarak önemlidir. Fagosite yeteneğine sahip hücreler, ya -profesyonel fagositlerin, makrofajlar / monositler, granülositler / nötrofil ve dendritik hücreler (DC) ya da fibroblast ve epitel hücreleri 11 ile profesyonel olmayan fagositler gibi. profesyonel fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz patojenlere karşı doğal ve kazanılmış bağışıklık yanıtının koordinasyonundan sorumlu iken, tüm fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz, doku bakım ve yeniden merkezi bir rol oynar. Profesyonel fagositler sadece adaptif bağışıklık sisteminin lenfoid hücrelere de mevcut antijenleri yutan ve patojen öldürmek, yok ama. Bundan dolayı, bu yol, pro-enflamatuar sitokinlerin salınması ve lemfoid hücrelerin katılımı katkıdaenfeksiyon 12 başarılı blokajı. Geleneksel biyokimyasal teknikler post-translasyonel modifikasyonlar ve proteinler arasındaki çeşitli yüksek afiniteli birlikleri gibi fagositoz sırasında farklı hücresel süreçleri, moleküler mekanizması ile ilgili bilgi kazanıyor vesile olmuştur. Bununla birlikte, bilinen biyokimyasal yöntemler kullanılarak fagositik etkinlik mekansal ve zamansal dinamikleri ile ilgili bilgiler elde etmek zordur. Canlı hücre görüntüleme sadece bize zaman hassas bir şekilde hücresel olayları izlemek için izin verir ama aynı zamanda bir tek hücre düzeyinde bilgi edinmek için bize sağlar. Burada fagositoz farklı aşamalarında araştırmak için bir yöntem tarif yanı sıra konfokal mikroskopi kullanılarak spatiotemporally tüm süreci analiz etmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:253px;">AppliChem</td>
			<td style="width:332px;">A1108</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP-231-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Minimal Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">FITC-coupled IgG-coated latex beads</td>
			<td style="width:253px;">Cayman</td>
			<td style="width:332px;">500290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-streptomycin (10&#39;000U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;"><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Phalloidin-Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RAW 264.7 cells</td>
			<td style="width:253px;">ATCC</td>
			<td style="width:332px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (1X) (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;85114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Zymosan-Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">Z23374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the early stages of phagocytosis

memeli vücut patojen istilası kendisini savunmak için yardımcı mekanizmaların çeşitli katmanları ile donatılmıştır. Nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi - - bağışıklık sisteminin -profesyonel fagositlerin algılar ve fagositoz 1 boyunca bu işgalci patojenlere temizlemek için doğal yeteneğini muhafaza. Fagositoz hücre yüzeyinde 2, 3 membran yeniden ve aktin biçimlenme koreografi olayları kapsar. Fagositler başarıyla içselleştirmesi ve fagositoz tüm aşamaları yerine sadece yabancı molekülleri ortadan kaldırmak. Bu adımlar tanıma ve hücre yüzeyinde bulunan örüntü tanıma reseptörleri tarafından patojen (PRR) bağlanmasını içerir, aktin-zenginleştirilmiş membranöz çıkıntıları (psödopod) aracılığıyla fagositik fincan oluşumu partikül çevreleyen ve fagozomun kesme phagolysosome olgunlaşması ile izledi sonuçlanırpatojen 3, 4 öldürülmesi. fagositoz çeşitli aşamalarında Görüntüleme ve miktar bu hücresel sürecin moleküler mekanizmaların için enstrümantal. Mevcut el yazması fagositoz farklı aşamalarını incelemek için yöntemler bildirir. Biz görselleştirmek ve bağlayıcı, fagositik fincan oluşumunu ölçmek için bir mikroskop temelli bir yaklaşım ve fagositlerce partikül içselleştirilmesi açıklar. Fagositik hücreler üzerinde doğuştan reseptörleri den büyük 0,5 mikron, burada mevcut tahliller patojenik mantar Candida albicans ve zimosan ve IgG kaplı boncuklar gibi diğer parçacıkların kullanımını içermektedir hedef parçacığa ligandlar karşılaştıklarında fagositoz oluşur olarak.

fagositoz farklı aşamalarında izlemek için mikroskop tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. DC2.4 hücreleri tarafından çeşitli floresan parçacıkların fagositozu sırasında farklı olaylar gösterilir. Burada tarif edilen teknikler kullanılarak, fagositoz erken aşamalarında sfingolipidler rolünü araştırdık. Bu amaçla, Sptlc2, sphingolipid biyosentetik yolundaki birinci ve oran kısıtlayıcı aşamayı katalizleyen enzim genetik eksikliği DC2.4 dendritik hücreler kullanıldı. Vahşi tip hücrelere k...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Early Stages of Phagocytosis at JoVE.com

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Video: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Symbiosis Katmanları - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk görselleştirme

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Biyoloji

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Kalkınma Erken Dönemlerinde Diseksiyon ve Zebra Finch Embriyolar Mansabında Analizi

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...