Biz Üniversitesi Dr Paul Weigel teşekkür etmek istiyorum. Oklahoma kullanmak için onun teknik yardım için HARE/Stabilin-2 reseptör ve Janet Weigel tespiti için monoklonal antikor 30. Bu araştırma, Nebraska Araştırma Fonları Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.

1. Karaciğer eksizyonu (değişiklikler 14,15 PO Seglen 12 ve R. Blomhoff 13 kabul) <ol><li> 5.5 L odasında kapalı bir petri polietilen glikol izofluran 10 ml% 30 ekleyin. Bu odanın içinde stabilize bir atmosfer yaratmak için izofluran eklenmesinden sonra 10-15 dakika beklemek en uygunudur. </li><li> Kapalı odasında bir fare koyun ve anestezi olmak için izin verir. Anestezi tam etkileri hayvan tepkisiz, gevşek olduğunda fark edilir ve derin nefes alma sergiler. </li><li> 2 ml, 30 ml şırınga tüpün alt kısmında bazı pamuk topları polietilen glikol izofluran Yeri. </li><li> Bebek bezi kaplı bir tepsi ve burnu üzerinde şırınga tüp sırtında sıçan yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile karın ıslatma hemen derin anestezi onaylayın. Hayvan izofluran doz aşımı ölmesine izin vermeyin. </li><li> Bandaj makasları ve forseps kullanma, tüm abd maruzominal kavite. </li><li> Vena porta bulun ve forseps kullanarak, iki kısımlı mezenterik şube hemen üzerinde vena porta altında cerrahi ipek veya polyester iplik (ligatür) çizin. </li><li> Forseps çekiniz ve gevşek bir overhand düğüm. </li><li> Vena porta altında forseps kullanma ve damar düzeltmek için hafifçe geri çekilerek, bir Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences) veya benzeri bir kateter ile ven cannulate. Kateter parçacığı tarafından oluşturulan döngü ötesinde birkaç mm gitmeli. </li><li> Kateter yaylı tetik serbest iğne geri çekin ve çıkartın. Kan uygun ligatürün yerleşimini gösteren kateter içine sızan başlamalıdır. </li><li> Overhand düğüm aşağı sıkın ve başka bir overhand düğümle sabitleyin. </li><li> Inferior vena kava veya inen aorta (aorta abdominalis), kan dolaşım sistemi tahliye izin ya Sever. </li><li> Oksijenli ile karaciğer kızarma başlayınTBS ° 37 ° C 20 ml / dk akış hızında, kan (beyazlaşma) kaldırmak için. Karaciğer, kırmızımsı mor bir balçık renk açmak gerekir. </li><li> Karaciğer kızarma olmasına rağmen, tüketim, gastrointestinal sistem ve bağ dokusu kesim tarafından karaciğer. Karaciğer veya delinme Glisson kapsül delici için önemlidir. </li><li> Plastik tamponlar toplanan ve sirküle olması için olanak sağlayan bir huni üzerinde net karaciğer yerleştirin. Bu noktada Tamponlar sirküle, ancak atık behere akışı olmamalıdır. Flushing 10 dakika daha fazla sürmemesi. (Şekil 2A). Adım 2.1 &#39;de gerekli endositoz çözüm hazırlayın. </li></ol> 2. 125 I-SA-b-Hep (ya da diğer uygun etiketli ligand), içselleştirme <ol><li> Küçük bir behere 50 ml RPMI ortam, nihai konsantrasyonu% 0.05 BSA ve 0.01 mCi 125 I-SA-b-Hep veya diğer şekilde etiketlenmiş endositoz ligand ekleyin. </li><li> Bu beher takın apparatuoksijenasyon için izin vermek. </li><li> , Pompa kapatın giriş tüp geçiş ve sonra 20 ml / dak pompa açmak. </li><li> Etiketli RPMI karaciğer yaklaşırken, pompayı kapatın ve huni aşırı sıvı ve tüp drenaj izin. </li><li> Etiketli medya devridaim izin ve sonra pompa yeniden başlatmanız drenaj boru medya behere koyun. </li><li> Sıvılar, en fazla 1 saat için karaciğer yoluyla sirküle izin verin. </li><li> Bu içselleştirme adım sırasında, karaciğerde sıcaklığı kapsayan ve kollajenaz sindirim için hazırlamak istikrarlı olduğundan emin olun. </li></ol> 3. Kollajenaz sindirim karaciğer sindirimi <ol><li> Taze çözünmüş ve süzülür (0,45 mikron) kollajenaz 37 60 ml geçmemek üzere toplam hacim ° C (100 mg / kg rat ağırlığı) 2 Tampon eklendi olmalıdır Hacmi boru uzunluğu / iç hacim bağlıdır ve buna göre ayarlanması gerekir. </li><li> Pompa ve döviz DurdurTBS medya beher giriş boruları. </li><li> Kalsiyum bağımlı desmosomal hücre kavşaklarından gevşeme sağlar dk 50 ml / 2 dk karaciğer yıkayın. </li><li> Karaciğer kızarma, beher cihazın kollajenaz içeren medya beher değişimi. </li><li> Hemen yıkamadan sonra, 20 ml / dak akış hızında 15 dakika kadar bir dolaşım döngü içinde kollajenaz ile sindirim başlar. Kollajenaz partiler çok sayısına göre farklılık gösterir, sindirim miktar ve zaman içinde değişiklikler kollajenaz her yeni parti için optimize edilmesi gerekir. Kollajenaz de kalsiyum bağımlıdır. Pompayı kapatın ve Flask B. (Şekil 2B) Flask Yatak atık hattı atık konteyner transfer Flask tampon ve gaz hatlarının geçiş. </li><li> Pompa Dur, kateter kaldırmak ve 20-30 ml Tampon 1 içeren bir çanak karaciğer aktarmak. </li><li> Geri Peel Glisson kapsül ve karaciğer hücre sallamaksıvı s. </li><li> Sıvı hücresel malzeme ile opak hale geldikçe, 30 mikron mesh ile ve daha sonra 50 ml konik içine buz filtrasyon ile 100 mikron mesh yoluyla hücrelere aktarın. </li><li> Karaciğer daha fazla Tampon 1 ekleyin ve mesh filtreleri ve konik sıvı, karaciğer matris hücreleri sarsmaya devam ediyor. </li><li> Adımları tekrarlayın 3,7-3,9 artık hücreleri karaciğer makul sallayarak yerinden olabilir kadar. </li></ol> 4. Hepatosit ve SEC arıtma <ol><li> 3 dakika boyunca 150 xg&#39;de hücreleri içeren 50 ml conicals Santrifüj. hepatositler pelet. </li><li> Buz üzerinde taze 50 ml conicals olmayan parankimal hücre içeren sıvı kısmını aktarın. </li><li> Hepatositler Tampon 3 pelet resuspending ve adımları 4.1 ve 4.2 en fazla üç defa tekrar yıkayın. </li><li> Yıkar sonunda, pelet ≥% 97 saf hepatositler. Sn elde etmek için, tüm borular c santrifüj10 dakika için 200 xg (HKH&#39;lerin, saniye, ve KCS ve bazı küçük hepatositler içeren) supernatant toplanmış ontaining. 4 ° C </li><li> Tampon aspire 4, 5 ml RPMI / BSA tüm pelet ° C tekrar süspansiyon </li><li> 2 tüp içine hücreleri birlikte Havuz ve 35 mL bir birime kadar RPMI / BSA ekleyin. </li><li> 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de conicals santrifüjleyin. </li><li> En iyi 25 ml sıvı ve temiz bir 50 ml konik transfer toplayın. </li><li> Kalan 10 ml medya pelletini tekrar ve tekrar soğuk RPMI / BSA 25 ml ve 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de santrifüj ekleyin. </li><li> 3,8 ve 3,9 adımları tekrarlayın hücre pelet ve alt 10 ml medya, bir kez daha atın. </li><li> Pelet saniye, KCS ve 10 dakika için 200 xg HKH&#39;lerin supernatents santrifüjleyin. 4 ° C </li><li> Buz 20 ml PBS içinde% 25 Percoll içeren üç 50 ml tüpler hazırlayın. Her bir tüp içinde 15 ml% 50 Percoll Underlay. </li><li> 30 ml RPMI / BSA toplam hacmi hücre pelletleri tekrar </li><li> Dikkatle bindirme eac4 h 20 dakika için 900 xg hücreleri ve santrifüj 10 ml degrade ° C </li><li> SAN ve KCS batmaz yoğunlukları çok yakın ve% 25/50 arayüzü var. HKH&#39;lerin / medya lipid depolama hücreleri gibi yüksek kaldırma kuvveti nedeniyle arayüzü tipik olarak 25%. Kalan hepatositler ve kan hücreleri düşük buoyancies ve pelet. 25/50% arabiriminin yanında yukarıdan aşağıya aspire ve bu malzemenin atın. </li><li> 25/50% arayüzü ve soğuk RPMI ile taze bir konik hücrelerin toplayın. Son hacim Percoll sulandırmak için ~ 40 ml olmalıdır. </li><li> 4 az 10 dakika süreyle 350 xg&#39;de konik Santrifüj ° C pelet hücreleri. </li><li> ~ 10 ml önceden ısıtılmış RPMI asitle yıkanmış cam Petri kabındaki 100 U / ml Penicillin/100 g / ml Streptomisin ve yer hücreleri içeren ya da çanak kristalize hücrelerin tekrar </li><li> Hücreler 15 dakika inkübe edin. 37 ° C&#39;de bir doku kültürü inkübatörde. </li><li> Rock ya da girdap plakası birazve sonra süpernatantı sn toplamak. KCS saniye daha çok daha hızlı bir şekilde cama yapışır. Alternatif olarak, SAN, manyetik boncuk konjuge veya anti-Stabilin2/HARE anti-CD31 antikorları kullanarak immunopurification KCS ayrılmış olabilir. </li><li> Canlılık ve hücre sayıları hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama ya da otomatik hücre sayıcı ile değerlendirilebilir. </li><li> Kültür sn 37 ° fibronektin kaplı plastik tabaklar ° C,% 5 CO 2, 40 ng / ml VEGF, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml Streptomisin veya hepatosit klimalı ortam RPMI/0.25% BSA. </li><li> Hepatositler, KCS ve SAN etiketli malzeme içselleştirilmesi için bir gama sayacı kullanımı ile değerlendirmek ve bu kültür yöntemleri kullanılarak (floresan ile işaretlenmiş) toplam hücresel protein veya mikroskobu ile normalize edilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Hepatosit arıtma ≥% 97 ve SEC arıtma typicmüttefiki ≥% 95 bu yöntemi kullanarak. Karın boşluğunda, portal ven, kanülasyon, karaciğer, beyazlaşma eksizyonu en iyi sonuçlar için bir dakika içinde meydana gelmelidir. HARE/Stabilin-2, karaciğer sn belirli bir reseptör ve diğer karaciğer hücre tipleri ifade değildir. Bu örnekte, hepatosit ve SAN hem de hücre lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrıldı Stabilin-2 hem de izoformları (Şekil 3) karşı monoklonal antikor ile probed. Kan dolaşımına enjekte heparin, 16 karaciğer tarafından temizlenir . Gümrükleme, öncelikle hepatositlerde ve KCS 17 aksine, karaciğer sn tarafından yapılır . Stabilin-2/HARE reseptörüne bağlanır ve 18 saniye içinde heparin içselleştirmesi ana bir boşluk reseptör . Buradaki örnekte, biz GlcNAc / NS karboksilat grup biotin etiketiyle heparin etiketli. Biotin, içselleştirilmiş heparin Prot tespiti için iyotlu streptavidin ile konjugeeoglycan. Exsanguination tarafından takip etiketli heparin enjeksiyonu, enjeksiyon sonrası 30 dakika bize hangi organları heparinin bu formu içselleştirmek izlemenize olanak sağlar. Bu kısa zaman aralığında, karaciğer birincil gümrük organ (Şekil 4). Daha açık bir şekilde hücre tipi temizlenmesi için sorumlu olduğu anlamak için,% 0.05 BSA ile desteklenmiş RPMI medya I-SA-b-Hep 125 eklenir ve 20 dakika için karaciğer dolaşmasına izin. Kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma ardından, etiketli heparin hepatositler (Şekil 5) aksine saniye içinde büyük bir çoğunluğu tarafından içselleştirilmiş. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Temel karaciğer mimarisi . Sn sinüzoidler duvarlarını oluşturmak ve normal (çevrelerin küçük kümeleri) Fenestre. Stellat hücreleri (HKH&#39;lerin) Kupffer c aksine Disse Uzay bulundu.arşın (KCS) normalde sinüzoidler mikrovaskuleterini mevcuttur. Hepatositler Disse Uzay diğer tarafında işgal eder. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 perfüzyon cihazların şematik. A) Karaciğer sinüzoidler kızarma / yıkama sırasında aparat Set-up. TBS, 1 litre cam şişe içinde. B) ~ 60 ml Tampon 2 kollajenazlarla içeren 125 ml şişeyi, bir kapalı devre karaciğer sindirim için kullanılır. Atık su hattı da lastik tıpa bir çentik kesi aracılığı ile atık konteyner balon B değiştirildi. Oksijen hattı kollajenaz (balon B) içeren köpük önlemek için tampon içine batmış değildir. Her balona Stoper atık su hattının etkin transferine izin vermek ve artan oksijen gazı basıncı önlemek için çentikli. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. </sTrong&gt; Hepatosit hazırlıkları saniye ile kontamine değildir. Eşit miktarda saflaştırılmış hepatositlerde gruplar halinde (şeritli 1) ve saniye (şeritli 2) cep lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen. HARE/Stabilin-2 hem izoformları (315 kDa ve 190 kDa) karşı spesifik monoklonal antikor # 30 lizatları prob kullanıldı. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 organlarda etiketli heparin Dağılımı. Sıçanlar, 30 dakika boyunca 125 I-SA-b-hep beklemek lateral kuyruk damar yoluyla enjekte edilir ve daha sonra exsanguinated. Kan yapay olarak herhangi bir organ yüksek okuma vermek amacıyla toplanmıştır. Her organ dakika başına (BGBM) Sayımlar, gram olarak organ ağırlığını karşı normalize edildi. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 hepatosit ve saniyede etiketli heparin miktarı. RPM125 içeren medya I-SA-b-Hep kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma takiben 20 dakika için sağlam bir karaciğer ile dolaşmasına izin verildi. Eşit miktarda hepatosit ve SEC hücre proteini lizatları Bradford Testi sayısal ve bir gama sayacı tarafından sayıldı. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6 Kupffer hücreler cam üzerine yapışmasını sn ayrılır. Hücreler bir asitle yıkanmış cam kristalize çanak yerleştirilir ve 37 ° C,% 5 CO 2 15 dakika uyması izin verildi. Olmayan yapıştırılır hücreleri içeren supernatent hafifçe kıvrıldı ve bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. % 8 SDS-PAGE ile ayrılmış iki cam yapıştırılır hücreleri (şeritli 1) ve olmayan yapıştırılır hücreleri (şeritli 2) lizatları lekelenen ve Kupffer hücreleri için spesifik CD163 karşı bir antikor ile probed. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Fibronektin kaplı plastik kaplanmış Şekil 7 sn 6-iyi yemekler,% 0,1 BSA ile desteklenmiş RPMI bir gece inkübe edildi . (A) 100x ve (B), 200x büyütme Faz kontrastlı görüntüler alınmıştır.

<ol>
	<li>Elvevold, K., Smedsrod, B., Martinez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sinusoidal+endothelial+cell:+a+cell+type+of+controversial+and+confusing+identity.">The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 294, G391-G400 (2008).</li><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol. Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochem. J. 266, 313-327 (1990).</li><li>Shiratori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sinusoidal+cell+function+in+vivo.">Quantification of sinusoidal cell function in vivo.</a> Semin. Liver. Dis. 13, 39-49 (1993).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eriksson, S., Fraser, J. R., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+vitro+on+the+uptake+and+degradation+of+sodium+hyaluronate+in+rat+liver+endothelial+cells.">Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells.</a> Biochem. J. 223, 617-626 (1984).</li><li>Harris, E. N., Kyosseva, S. V., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+processing,+and+glycosaminoglycan+binding+activity+of+the+recombinant+human+315-kDa+hyaluronic+acid+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Expression, processing, and glycosaminoglycan binding activity of the recombinant human 315-kDa hyaluronic acid receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 282, 2785-2797 (2007).</li><li>Alkhouri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+the+Pediatric+NAFLD+Fibrosis+Index+and+Enhanced+Liver+Fibrosis+Test+Identifies+Children+with+Fibrosis.">A Combination of the Pediatric NAFLD Fibrosis Index and Enhanced Liver Fibrosis Test Identifies Children with Fibrosis.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. , (2010).</li><li>Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+liver+endothelial+cells:+a+cell+culture+model+for+studies+of+motility+and+angiogenesis.">Immortalized liver endothelial cells: a cell culture model for studies of motility and angiogenesis.</a> Lab. Invest. 90, 1770-1781 (2010).</li><li>Zhou, B., Weigel, J. A., Fauss, L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Identification of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 275, [pii]- (2000).</li><li>Krause, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-supported+serum-free+culture+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J. Hepatol. 32, 718-726 (2000).</li><li>Esser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+endothelial+fenestrations+in+vitro.">Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro.</a> J. Cell. Biol. 140, 947-959 (1998).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods. Cell. Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Blomhoff, R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+rat+liver+stellate+cells.">Isolation and cultivation of rat liver stellate cells.</a> Methods. Enzymol. 190, 58-71 (1990).</li><li>Harris, E. N., Baggenstoss, B. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+and+human+HARE/stabilin-2+are+clearance+receptors+for+high-+and+low-molecular-weight+heparins.">Rat and human HARE/stabilin-2 are clearance receptors for high- and low-molecular-weight heparins.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1191-G1199 (2009).</li><li>Karaa, A., Kamoun, W. S., Clemens, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+disrupts+nitric+oxide+synthase+activation+in+liver+endothelial+cells.">Oxidative stress disrupts nitric oxide synthase activation in liver endothelial cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. 39, 1320-1331 (2005).</li><li>Gustafson, S., Bjorkman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hyaluronan,+chondroitin+sulphate+and+dextran+sulphate+bind+to+a+liver+receptor+that+does+not+recognize+heparin.">Circulating hyaluronan, chondroitin sulphate and dextran sulphate bind to a liver receptor that does not recognize heparin.</a> Glycoconj. J. 14, 561-568 (1997).</li><li>Oie, C. I., Olsen, R., Smedsrod, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+the+principal+site+for+elimination+of+unfractionated+heparin+from+the+circulation.">Liver sinusoidal endothelial cells are the principal site for elimination of unfractionated heparin from the circulation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 520-528 (2008).</li><li>Harris, E. N., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE/Stabilin-2)+is+a+systemic+clearance+receptor+for+heparin.">The human hyaluronan receptor for endocytosis (HARE/Stabilin-2) is a systemic clearance receptor for heparin.</a> J. Biol. Chem. 283, 17341-17350 (2008).</li><li>Knook, D. L., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Kupffer+and+endothelial+cells+of+the+rat+liver+by+centrifugal+elutriation.">Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation.</a> Exp. Cell. Res. 99, 444-449 (1976).</li><li>Graupera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endothelial+COX-1-derived+prostanoids+modulate+the+hepatic+vascular+tone+of+cirrhotic+rat+livers.">Sinusoidal endothelial COX-1-derived prostanoids modulate the hepatic vascular tone of cirrhotic rat livers.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 763-770 (2005).</li><li>Yannariello-Brown, J., Zhou, B., Ritchie, D., Oka, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ligand+blot+assay+detects+different+hyaluronan-binding+proteins+in+rat+liver+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells.">A novel ligand blot assay detects different hyaluronan-binding proteins in rat liver hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Anestezi, izofluran buharı neden olur bilinçsizlik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem olduğu asılı damla yöntemi ile sıçan. Buharlaştırıcı da odasının dışında hayvanın korumak için pamuk ile bir şırınga yerine kullanılan, ancak cerrahi işlemler bu gerekli değildir, çok hızlı olabilir. Polietilen glikol, buhar basıncı ve buharlaşma oranı azaltmak için izofluran eklenir. Çok fazla izofluran buharı çok hızlı bir şekilde ölüme neden olacaktır. Kanüle karaciğer ve TBS, karaciğer havuzu kan olabilir pıhtı ile beyazlatılmış ve kollajenazlarla sinüzoidler ve sindirim verimli çamaşır önlemek önce hayvan ölür. Bir antikoagülan olarak heparin eklenmesi yararlı olabilir ancak bizim prob olarak etiketlenmiş heparin kullanan beri bu çalışmalarda kullanılmaz. Gey tamponlu salin solüsyonu (GBSS) sık sık diğer laboratuvarlar tarafından saniye arıtma değiştirilir. SEC arıtma, hep yararlı olmakla birlikteatocytes 1-3 GBSS yanı sıra Tamponlar tahammül edemez ve canlılığı yaklaşık olarak yüksek değildir. Endositoz ölçerken, organ ve hepatositler saflaştırılmış arka plan düzeylerini ölçmek için iyi bir uygulamadır. Bu yöntem iki biridir kollajenaz ile karaciğer perfüzyon aşağıdaki sn verimli arıtma. Diğer yöntem Yıkayarak tasviye santrifüj 19 yerine Percoll degrade olmayan parankimal hücreleri ayırır. Percoll gradyanlar üzerinde Yıkayarak tasviye kullanmak için avantajları biraz daha yüksek hücre canlılığı ve numaraları. Dezavantajı Yıkayarak tasviye santrifüj özel bir rotor, adanmış santrifüj, ve on binlerce dolar maliyeti birlikte peristaltik pompa gerektirir. Bu yöntem, yalnızca birçok laboratuvarda standart bir buzdolabında masa üstü santrifüj ve peristaltik pompa kullanımını gerektirir. SAN ve seçici yapışma KCS ayrılması standart bir yöntem20-22. Saniye cam ve plastik uygun olacağı doğru olmakla beraber, 37, 15 dakikalık bir inkübasyon daha fazla asitle yıkanmış temiz bir cam kullanmak için kilit nokta ° C,% 5 CO 2. KCS saniye daha hızlı uyacaktır ve bu gevşek bağlı hale gelmiştir kalan sn ayıklamak için medya ile KCS hafifçe yıkamak için tavsiye edilir. Pronase ve diğer proteazlar hücrelerinin canlılığı artırmak için bu protokolü kollajenaz sindirim adımları da atlanmıştır. Proteazlar ekstrasellüler reseptörleri sindirmek ve nihai arıtma adımları hücresel adezyon inhibe edebilir. Burada sunulan yöntem, uygulamalar geniş bir yelpazede. Heparin başlangıçta birincil hepatositler almak için karaciğerin temizlenmesi, perfüzyon için alındığı sonuçta gösterse de, KC, SAN ve HKH&#39;lerin metabolik yollar, immunoregulation, çöpçü faaliyetleri, ve diğer ilgili çok sayıda çalışma için yararlı olabilir fizyolojik Studies. Bu prosedürün en zor kısmı, portal ven kateter kayma kalmadan iyi kanülasyonu, sindirim, karaciğer ve karaciğer taşıma.

<ul><li> Tampon 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES,% 1.5 BSA, pH 7.4 </li><li> Tampon 2 (perfüzyon tampon): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl 2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA% 1.5, pH 7.4. </li><li> Tampon 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO 4, 1.2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 mM HEPES,% 1,5 BSA, pH 7.4 </li><li> RPMI / BSA: 15g / L BSA RPMI </li><li> TRIS-tamponlu salin (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Bankası tuz. </li><li> Kollajenaz: Sigma-Aldrich Roche kollajenaz A (11088785103), Biyokimyasal Worthington veya kollajenaz I kollajenaz Tip I (# LS004691) (# C0130) veya IA (C9891). </li></ul> Tüm tuzları Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Model / katalog # </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> 20L su banyosu </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Su, yaklaşık 45 ° C soğutma telafi etmek için </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Hortumun içinde. </td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serisi </td></tr><tr><td> Soğutmalı Santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> Legend XTR </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Desikatörde odasına </td><td> Balıkçı </td><td> 08595E </td><td> İç plakası kullanın </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikron mesh </td><td> Spectrum laboratuvarları </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mikron mesh </td><td> Spectrum laboratuvarları </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilen glikol </td><td> Spectrum laboratuars </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Karaciğer memeli vücudun metabolik merkezi ve kan için bir filtre olarak hizmet vermektedir. Karaciğer temel mimarisi hepatositlerin karaciğer kütlesinin% 85 den daha fazla oluşur ve hücresel kitle kalan% 15 Kupffer hücreleri (KCS), stellat hücreleri (HKH&#39;lerin) oluşur Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, ve sinüzoidal endotel hücreleri (sn). Sn karaciğer içinde kan damarı duvarlarının formu ve sitoplazmaya içinde Fenestra denilen özel morfolojisi içeren. Sitoplazmaya fenestrasyon saniye hareket, bir elek gibi en şilomikronlar, şilomikron kalıntıları ve makromoleküllerin, ama hücreleri, hepatositler ve HKH&#39;lerin 1 (Şekil üzerinden geçtiği, böylece hücrelerin içinde delik görünüm (~ 100 mikron ) 1). Bazal membran olmaması nedeniyle SAN ve hepatositler arasında boşluk Disse Uzay oluşturur. HKH&#39;lerin yer kaplamaz ve düzenleme ve ben önemli bir rol oynayabilirnjury, retinoik asit ve karaciğer 2 immunoregulation depolama. SAN, hücre yüzeyinde 3 çöpçü reseptörleri bir dizi görüntüleme vücudun en endocytically aktif hücreleri arasında yer almaktadır . Bu SR-A, Stabilin-1 ve Stabilin-2 içerir. Genellikle, büyük partiküller ve hücresel enkaz KCS 4 (fagosite) endocytosed, oysa tampon aşamasında küçük kolloidal parçacıkları az 230 nm ve makromoleküllerin saniye tarafından alınır. Böylece, toplu boşluk gibi kan glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı malzeme, sağlık ve 5,6 saniye endositik fonksiyonları büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, kan hyaluronan düzeylerinde artış, hafif ya da daha şiddetli formları 7 arasında değişen karaciğer hastalığının göstergesidir . Bir rapor 8 istisna ile, varlığını hiçbir ölümsüzleştirdi SEC hücre hatları vardır. Hatta bu ölümsüzleştirdi hücre hattı de-diferansiyebirincil SAN (veri, gösterilmemiştir) çöpçü reseptörleri ifade etmediğini ilişkilidir. Tüm hücre biyolojik çalışmalar, taze hayvandan elde edilen birincil hücreleri üzerinde yapılmalıdır. Ne yazık ki, SAN, standart kültür koşulları altında dediferansiye ve hayvan izolasyon üzerine 1 veya 2 gün içinde kullanılması gerekir. Saniye farklılaşma Stabilin-2 veya HARE reseptör 9, CD31 ve sitoplazmik fenestrasyon 1 varlığı ifade ile işaretlenir. Saniye farklılaşma kültür ortamı VEGF ek veya hepatosit klimalı orta 10,11 kültür hücreleri tarafından uzatılabilir. Bu raporda, SEC özel Stabilin-2 reseptör hyaluronan için radyo-etiketli heparin kullanarak sağlam organ sn endositik aktiviteleri gösterecektir. Daha sonra endositoz ölçmek için perfüze karaciğer hepatosit ve SAN arındırmak.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K Görüntüleme.  University of Nebraska, Lincoln. Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Video: In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biyoloji

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile<em&gt; Yerinde</em&gt; Karaciğer Perfüzyon

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

İlaca Bağlı Karaciğer Toksisitesini In Vitro Olarak Değerlendirmek için İnsan Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Alkole Bağlı Olmayan Yağlı Karaciğer Hastalığının Progresyonunu Değerlendirmek İçin Yeni In Vivo Mikrobilgisayarlı Tomografi Görüntüleme Teknikleri