TRAP-seq ile RNA'yı belirli hücre tiplerinden izole edebiliriz, örneğin yaralı karaciğerde yeniden oluşan hepatositler gibi bu hücrelerde meydana gelen gen ekspresyonu değişikliklerini analiz edebiliriz. Bu doku istenmeyen hücreleri kaldırmak için herhangi bir adım gerektirmez. Hücre tipine özgü RNA tüm organ lysates gelen yakınlık saflaştırma ile izole edilir.
Bu teknik, belirli hücrelerin yaralanmalara nasıl tepki verebileceğini belirlememize yardımcı olur, bu da karaciğer hastalığıyla mücadele etmek için yeni stratejiler veya ilaçlar belirlemenize yardımcı olabilir. Bu karaciğer hücrelerinin karaciğer yaralanmaları farklı türde nasıl tepki belirlemek için kullanılabilir. Şu anda, ciddi akut karaciğer yaralanmaları için birkaç seçenek vardır ve bu yöntem yeni tedaviler bize ipucu yardımcı olacaktır.
Bu yöntem beyin kökenli. Karaciğerde, biz hücre tipleri çeşitli dinamik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir öngörülen, hepatositler, safra kanalı hücreleri, Kupffer hücreleri, ve endotel hücreleri birkaç isim. Prosedürü gösteren Amber Wang, yüksek lisans öğrencisi ve benim mentee olacaktır.
Başlamak için, nazik pipetleme ile manyetik boncuklar resuspend. Bir dakikadan fazla bir manyetik standında boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Daha sonra, manyetik standdan mikrosantrifüj tüp çıkarın ve PBS bir mililitre ekleyin, boncuk yıkamak için yukarı ve aşağı pipetleme izledi.
Boncukları toplamak ve PBS'yi çıkarmak için tüpü manyetik standa bir dakikadan fazla yerleştirin. Protein L kaplı boncuklar hazırlamak için, resuspended ve yıkanmış manyetik boncuklar için biyotinylated protein L 16 mikrolitre ekleyin ve son hacmi bir mililitre yapmak için 1X PBS ekleyin, bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp kullanıyorsanız, veya 1.5 mililitre, iki mililitre mikrocentrifuge tüp kullanıyorsanız. Manyetik boncukları biyotinylated protein L ile 35 dakika oda sıcaklığında bir tüp rotator üzerinde kuluçka.
Daha sonra, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve protein L kaplı boncuk toplamak için supernatant çıkarın. Manyetik standdan mikrosantrifüj tüp çıkarın ve% 3 BSA tampon ile PBS bir mililitre ekleyin, protein L kaplı boncuk yıkamak için en az beş kez nazik pipetleme izledi. Yine, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve kaplamalı boncuk toplamak için supernatant çıkarın.
BSA'yı dört kez daha yıkadıktan sonra tekrarlayın. Daha sonra, GFP antikor 19C8 ve GFP antikor 19F7 her protein L-kaplı boncukiçine antikorlar 50 mikrogram ekleyin ve bir tüp rotator üzerinde dört derece santigrat bir saat kuluçka. Yakınlık matristoplamak için, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve supernatant çıkarın.
Tüpü manyetik standdan uzaklaştırın ve bir mililitre düşük tuz tamponu ekleyin. Afiyet matrisini yıkamak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın ve düşük tuz tamponunu iki kez daha yıkayın. 200 mikrolitre düşük tuz tamponu ndaki boncukları yeniden askıya alın ve 200 mikrolitre afinite matrisi yapın.
İlk olarak, ptfe cam tüplerhomojenizasyon sırasında buz üzerine yerleştirilebilir böylece doku öğütücü kurmak. PTFE cam tüpleriçine soğuk lysis tampon dört mililitre doldurun. Karaciğeri petri kabına koy.
Karaciğer parçaları 200 ila 500 miligram izole etmek ve PTFE cam tüpler içine taşımak için bir bıçak kullanın. Sıvı azot içinde önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp ve flaş dondurma içine kalan karaciğer dokusu yerleştirin. Karaciğer yapısından hepatositleri ayrıştırmak için en az beş vuruş için 300 rpm'den başlayarak, motorlu homojenleştiricideki numuneleri homojenize edin.
Cam tüpü her seferinde indirin. Pestisiti çözeltinin altında tutarak protein denatürasyonuna neden olabilecek havalandırmayı önleyin. Daha sonra, tam olarak en az 12 tam vuruş için karaciğer dokuları homojenize 900 rpm hızını yükseltmek.
Lysate'yi, her biri bir mililitreden fazla olmayan etiketli ve önceden soğutulmuş tüplere aktarın. Nükleer lysis başlatmak için, 10 dakika boyunca 4 santigrat derece 2,000 kez g karaciğer lysate santrifüj, sonra buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüpüne %10 NP-40'lık süpernatant hacminin 1/9'u ekleyin ve tüpü yavaşça ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.
Hızlı bir mini santrifüj ile mikrocentrifuge tüpler aşağı spin ve% 10 DOC örnek hacminin 1/9th ekleyin. Mikrocentrifuge tüpleri yavaşça ters çevirerek karıştırın ve hızlı bir şekilde mikrocentrifuge tüpler aşağı spin ve beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 20, 000 kez g'de nükleer lysate'yi santrifüj edin ve süpernatantı buz üzerinde yeni önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplere aktarın.
Her tüp için, pre-immünoprepitasyon kontrolü olarak supernatant toplam hacminin% 1 almak. İmmünoprepreresians itkontrolleri bir gecede dört derece bir tüp rotatörüüzerine yerleştirin. Pipetleme ile afinite matrisi nazikçe askıya almaya dikkat edin, ardından her numuneye 200 mikrolitre ekleyin.
Bir tüp rotator üzerinde nazik karıştırma ile bir gecede dört derece santigrat lysates inkübün. RNA'yı izole etmek için, mini santrifüjdeki lysatları içeren tüpleri hızlıca aşağı doğru döndürün ve en az bir dakika boyunca manyetik rafa koyarak boncukları toplayın. Ek mikrosantrifüj tüplerde supernatant toplayın.
Her tüpe bir mililitre taze yüksek tuz tamponu ekleyin ve ardından kabarcıkları tanıtmadan en az beş kez hafif pipetleme. Bir dakikadan fazla buz üzerinde manyetik standı üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Yıkama adımlarını dört kez daha tekrarlayın.
Daha sonra, manyetik standdan mikrosantrifüj tüpleri çıkarın ve ısınmak için beş dakika oda sıcaklığında yer. 100 mikrolitre likit tampondaki boncukları 0,7 mikrolitre beta-mercaptoetanol ile yeniden askıya alarak bağlı RNA'yı yakınlık matrisinden serbest bırakın. En yüksek hızda en az beş saniye boyunca tüplergirdeve hızlı bir şekilde aşağı spin.
Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri en az bir dakika boyunca manyetik standa yerleştirin, sonra süpernatant'ı toplayın ve kitteki RNA temizleme protokolüne göre derhal RNA temizliğine devam edin. İzole RNA maksimum kalite elde etmek için, 60 santigrat derece ye elüsasyon tampon önerilen ön ısıtma da dahil olmak üzere DNa sindirimi ve tüm RNA elüsyon adımları da dahil olmak üzere tüm isteğe bağlı adımları gerçekleştirin.
Bu çalışmada, GFP-L10A füzyonu ve Fah transgenler hidrodinamik enjeksiyon ile karaciğerlere transpozon içeren plazmid trap vektörü içinde birlikte teslim edildi. Nitisinone'nin çıkarılması toksik karaciğer hasarına neden oldu. İmmünofloresan boyama FAH ve GFP-L10A füzyon proteini ve karaciğer repopülasyon iki hafta sonra repopulating hepatositlerin birlikte ekspresyonu doğruladı.
Tüm hepatositler AAV8-TBG-Cre enjeksiyonundan sonra GFP-L10A ekspresinden bu yana, quiescent numunesi en yüksek füzyon proteinverisini üretti. Tersine, ancak herhangi bir RNA GFP-L10A transgene yoktu vahşi tipi kontrollerde tespit edildi, TRAP prosedürü son derece spesifik olduğunu gösteren ve düşük bir arka plan var. GFP-L10A transdüktüllü hepatositile repopülasyon geçiren karaciğer dokusunda TRAP kullanıldığında bol miktarda yüksek kaliteli RNA elde edildi.
Buna karşılık, negatif kontrol örneği için Bioanalyzer ile RNA izi saptanmadı. Gsta1 ekspresyonu, heratositlerin yeniden doldurulmasında, quiescent hepatositlere göre on kat daha fazla indüklenmiş, giriş RNA eksikliği nedeniyle vahşi tip fareden TRAP-izole RNA ile eşik döngüsü değerleri saptanmadı. Doku homojenize ederken, havalandırmayı önlemek için yavaş yavaş pestle hareket emin olun.
RNA izole sonra, yüksek-throughput sekanslama veya qPCR gen ekspresyonu analiz etmek için yapılabilir. TRAP-seq ile, şimdi özellikle hepatositler repopulating Gelen RNA izole etmek ve karaciğer repopulation sırasında gen ekspresyonundaki değişimi analiz etmek için bir yöntem var. Bu bize bu süreç sırasında değiştirilmiş genleri ve karaciğer hasarının tedavisi için potansiyel terapötik hedefleri belirlemenize olanak sağlar.
Siklohekamid ve DTT, çeşitli tamponlar mevcut, her ikisi de toksik. Atıklar kurumsal kurallara göre toplanmalı ve atılmalıdır.
