Yazarlar, Dr James (Zhijian) teşekkür etmek istiyorum Mavs içeren esansiyel reaktifleri, sağlamak için Chen (Güneybatı UT, Moleküler Biyoloji) - / - fareler ve Dr Ren Sun (California-Los Angeles Üniversitesi, Farmakoloji ve Moleküler Tıp ) bu çalışma için γHV68 bakteriyel yapay kromozom sağlamak için.

1. ΓHV68 ile Fare enfeksiyonu <ol><li> Altı-sekiz haftalık, cinsiyet açısından Kardeş fareler (8 ila 12 fare / grup) viral enfeksiyon için kullanılır. Fareler sevkiyat sonra dört tam gün (96 saat) boyunca gelmesini bekleyin. </li><li> Virüs kullanarak Protokol adımları standart BSL2&#39;ye önlemler kullanılarak biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) bir kabin içinde yapılmalıdır. </li><li> Sadece deneme önce fare başına steril PBS 30 ul γHV68 (40 1 x 10 5 plak oluşturan birim [PFU]) viral süspansiyonu hazırlayın. Buz üzerinde viral süspansiyon tutun. </li><li> Fare sedasyon için ketamin / xylazine çözeltisi (1.5 mg ketamin ve 0.15 mg xylazine/20 g vücut ağırlığı, 100 ul / fare) hazırlayın. Fareler ayak tutam gerçekleştirerek sedatize edilmiştir emin olun. </li><li> 1.5 mg ketamin ve intra-peritoneal enjeksiyon yoluyla 20 mg vücut ağırlığı (100 ul / fare) başına 0,15 mg ksilazin oturaklı fareler. </li><li> Bir damla-bilge, intranazal viral süspansiyon (30 ul / fare) sununsedasyon farelerin bir burun moda. </li><li> 5 için bir tarafta fareler Lay - 10 dk akciğer içine, virüs solunum getirilmesini kolaylaştıran. </li><li> Geri kafes ve monitör farelerde Yeri fareler tam sedasyon kurtarıldı kadar. </li><li> Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, CO 2 boğulma ve ölüm / derin bilinç kaybı güvence sonra hasat akciğerler tarafından fareler kurban. Sıra akciğerler 1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk 500 ul içeren steril 1.5 ml&#39;lik vidalı kapaklı tüpler içine. Buz üzerinde tüpleri tutun. Mağaza örnekleri -80 ° C&#39;de aynı gün sonraki adıma geçmeden değilse. Dalak veya karaciğer dokusu deney zaman dilimine göre viral gecikme analiz için şu anda toplanmış olabilir. </li><li> Tüp içine soğuk serumsuz DMEM 1 ml ekleyin ve boncuk-dayak 30 saniye akciğerleri homojenize. En az 1 dakika boyunca buz üzerinde tüp soğutun. Bir kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Santrifüj akciğer 1 dakika 4 ° C&#39;de 16,000 RCF lizatları ve supern kullanınBir NIH3T3 veya BHK21 monolayer (detaylar için bakınız Bölüm 5) kullanarak bir plak yöntemi ile viral titresi belirlemek için atant. </li></ol> 2. Fare embriyonik fibroblastlar içinde γHV68 çok adımlı büyüme kinetikleri belirleyin <ol><li> Yabani tip fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ve kaplama hücreleri önce alt konfluent (yaklaşık% 80) yoğunluk bir konak gen eksikliği olanlar büyütün. </li><li> 10.000 hücrelerini 24-plaka içine MEFS / Split sıra enfeksiyon öncesi gün (İB) multipilicity-of-bir enfeksiyon için. Deneyler, normal olarak 0.001 arasında, kopyalardaki içinde ve bir İB yürütülür - 0.05 genellikle kullanılır. </li><li> Virüs istenilen miktarda (0.5 ml&#39;de sıra) içeren γHV68 süspansiyonu hazırlayın. </li><li> Orta çıkarın ve kuyu başına γHV68 süspansiyonu 0.5 ml MEFS kapsamaktadır. </li><li> Doku kültürü kuluçka makinesi, kaya her 30 dakikada plaka inkübe edildi ve inkübasyon 2 saat için ilerlemeye olanak tanır. </li><li> Viral süspansiyon çıkarın ve 0.5 ml taze c hücreleri kapakomplete DMEM ortamı% 8 fetal bovin serumu içeren. </li><li> Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, steril 1.5 ml santrifüj tüpleri içine orta ve hücre hasat. Hemen -80 tüpler dondurmak ° C. </li><li> -80 Dondurarak MEFS Bırak&#39;ı γHV68 ° C, 37 çözdürme ° C su banyosu ve vorteks. Dondurma ve buz çözme üç döngü genellikle örnekleri uygulanır. </li><li> Bir NIH3T3 veya BHK21 monolayer (detaylar için bakınız Bölüm 5) kullanarak bir plak yöntemi ile viral titresi belirleyin. </li><li> Viral titresi ve MEFS ilgili arsa γHV68 çok adımlı büyüme eğrisi okuyun. </li></ol> 3. Fare embriyonik fibroblastlar içinde γHV68 litik replikasyon Moleküler diseksiyonu <ol><li> Bölüm 2 2.6 için adım 2.1 &#39;de açıklandığı gibi viral enfeksiyon gerçekleştirin. </li><li> Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, supernatant atın. Soğuk PBS ve Trypsinize hücreleri ile hücreleri yıkayın. 1 dakika için oda sıcaklığında 1,000 rcf de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve-80 mağaza hücreleri ° C </li><li> Önceden yayınlanmış yöntemleri 5,6 göre toplam DNA (konak ve viral genom) ve toplam RNA ayıklayın. </li><li> Toplam DNA ve böyle RTA (ORF50), ORF57 ve ORF60 gibi viral litik transkript, spesifik primerler kullanılarak real-time PCR gerçekleştirin. Bir ana temizlik gen (örn., β-aktin) referans olarak hücre içi γHV68 genomunun nispi miktarını belirler. </li><li> Genomik DNA kontaminasyonu kaldırmak için, RNaz ücretsiz DNaz tedavisi total RNA ve oligo (dT) 11-19 astar ile cDNA hazırlanması için önemlidir. RNaz ücretsiz DNaz ve RT-PCR ile tedavi de dahil olmak üzere RNA ekstraksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı için 5 başvurmak bakın. Konak temizlik genin referans viral transkript göreli miktarını belirlemek için yukarıdaki gibi cDNA ve primerler kullanılarak real-time PCR gerçekleştirin. </li></ol> 4. Rekombinant γHV68 kullanarak bakteriyel yapay kromozom oluşturuluyor Metodolojid ev sahibi-virüs etkileşim içinde dahil olan bir γHV68 gen mutasyonu içine getirmek için kullanılır tanımlanmıştır. <ol><li> Yabani tipteki sekansı ya da PCR ile merkezi bölge, istenen mutasyonu taşıyan sekansı bir DNA fragmanı (1.5 kb) hazırlayın. </li><li> Özellikle midi ölçekli arıtma (OriGene) ile ilgilenilen genin gen, inaktive eden, mutasyon bölgesi, etrafında bir transpozon ekleme 7 içeren, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) hazırlayın. 4 Mağaza BAC DNA ° C (BAC DNA&#39;nın çözülme / dondurma kaçının). </li><li> BAC DNA ile transfekte PCR ürünü, lipofektamin 2000 (Invitrogen) ile, γHV68 litik replikasyonu ile açık olan hücreleri (örneğin, NIH3T3 veya BHK21), içine ilgi geninin Arzu edilen mutasyonları içeren. </li><li> Sitopatik etki (CPE) tek tabaka olarak belirene kadar bölme hücreleri tutun. Virüs içeren süpernatan toplamak ve, gerekirse, NIH3T3 veya BHK21 hücreleri virüs yükseltmek. </li><li> NIH3T3 hücreleri ile Infect1,800 rpm&#39;de santrifüj ile rekombinant virüs, 30 dk için 30 ° C&#39;dir. </li><li> Hasat γHV68-enfekte NIH3T3 hücreleri ve Hirt protokol 8,9 kullanarak circularized viral genom hazırlamak. </li><li> Kloramfenikol direnç (Cm), fakat kanamisin (Kan) (Kan-dirençli gen transpozon iken Cm-dirençli gen, BAC omurga içerisinde duyarlı olan koloniler için elektroporasyon ve ekran ile elektro-MAX yetkili DH10B hücrelerinin (İnvitrojen) Transform ekleme). </li><li> Medium içeren chlorophenicol Cm R Kan S koloniler büyütün ve mini veya midi ölçekli arıtma (OriGene) ile BAC DNA hazırlamak. </li><li> Mutasyon site kanat bölgeleri ve sekanslama için özel primerler kullanılarak PCR ile hedef geni içinde arzu edilen mutasyonların edin. </li><li> Seçilen restriksiyon enzimleri ve nabız-field jel elektroforezi sindirim ile BAC hiçbir kromozom onaylayın. </li><li> Lipofektamin ile NIH 3T3 veya BHK21 hücreleri içine transfekte rekombinant BAC2000 (Invitrogen) rekombinant γHV68 hazırlamak için. </li><li> CPE monolayer olarak belirene kadar hücre pasajı tutun. Virüs içeren süpernatant toplayın ve NIH3T3 veya BHK21 hücrelerinde rekombinant γHV68 yükseltmek. </li><li> Rekombinant virüsün titresini belirlemek ve bölüm 1 ve 2&#39;de tarif viral büyüme özellikleri ex vivo ve in vivo olarak karakterize etmektedir. </li></ol> 5. Bir plak yöntemi ile viral titresi belirleyin <ol><li> Kaplama hücreleri önce alt konfluent (yaklaşık% 80) yoğunluk NIH3T3 hücreleri büyümek. </li><li> 20.000 hücrelerini / iyi enfeksiyonu önceki gün 24-plaka içine NIH3T3 Böl. </li><li> DMEM orta% 8 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) içeren 10 kat seri-seyreltilmiş virüs süpernatantlar hazırlayın. </li><li> Orta çıkarın ve γHV68 süspansiyonu 0.5 ml NIH3T3 hücreleri kapsar. </li><li> , Doku kültürü inkübatör plaka inkübe her 30 dakikada bir kaya, ve inkübasyon devam etmesine izin2 saat için. </li><li> 0.5 ml DMEM,% 2 NCS içeren orta ve% 0.75 metilselüloz (Sigma) ile viral süspansiyon ve kapak hücreleri çıkarın. </li><li> Doku kültürü inkübatör plaka inkübe edin. Günde 6 sonrası enfeksiyona plaklar sayın. Kristal viyole ile örneğin tek tabaka, boyanması, plak sayım kolaylaştırabilir. </li><li> Seyreltilmemiş doku özütündeki viral titre hesaplama ya da hücre lizatları aşağıdaki formül ile: titresi (PFU / ml) D = x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N, uygun dilüsyon plak sayısı ortalaması, D, seyreltme V (ul) (örneğin 5, 10 gibi, 100 .....) kat, seri-seyreltilmiş süpernatant hacmi başına iyi ekledi. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: / - - Fare 10 fare embriyonik fibroblastlar (MEF) olarak γHV68 litik replikasyon fenotipleri ve recombin Üç temsili rakamlar yabani tip ve Mavs ve akciğerde γHV68 litik çoğaltma dahil olmak üzere, burada gösterilmektedirkarınca γHV68 Mavs bağımlı IKKβ tarafından düzenlendiği fosforilasyon siteleri içinde mutasyonları taşıyan. Bu üç doğrulayan deneyler vivo ve ex vivo γHV68 litik replikasyon doğuştan immün bileşenlerin rolleri tanımlamak için bir plan oluşturur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> Şekil 1, Mavs + / + ve Mavs ve akciğerlerde γHV68 yükler -. / - Fareler. A) İki ana doğuştan sinyalizasyon Mavs mansabında patikaların. Da, proinflamatuar sitokinler ve interferonlar gen ekspresyonu up-regüle NFKB ve interferon düzenleyici faktörler (IRFS) etkinleştirmek için sitozolik RIG-I-benzeri reseptörler Mavs adaptör molekül röleleri. B) Mavs + / + ve Mavs - / - farelerde caydırmak edildi Belirtilen zaman noktalarında 40 PFU intranazal γHV68 ve akciğer viral yük ile enfekte edildi<html> NIH3T3 monolayer kullanarak bir plak yöntemi ile mayınlı. Her sembol bir fare temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> Şekil 2. Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olarak γHV68 litik replikasyon kinetiği. Mavs üzerinde γHV68 bir litik replikasyon + / + ve Mavs - / - MEFS çok-aşamalı büyüme eğrilerinin belirlenmesi (A) ve kantitatif gerçek-zamanlı PCR (B) ile ölçüldü. Her iki deney için, γHV68 eşit MEFS sayısı ve miktarı, 0.01 çokluğu-of-enfeksiyon (MOI) de viral enfeksiyonu için kullanılmıştır. (A) Hücreler ve süpernatan belirtilen zaman noktalarında hasat ve viral titresi belirlemek için bir plak tahlil konu edildi. (B) RNA γHV68-enfekte MEFS çıkarılan ve seçilen litik transkript (RTA, ORF57 ve ORF60) spesifik primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. ig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. IKKγ tarafından fosforilasyon kaldıracak RTA transaktivasyonunun etki alanı içinde rekombinant γHV68 taşıyan mutasyonların litik replikasyon kinetiği. (A) Mavs Çok-aşamalı büyüme rekombinant yabani-tip virüs eğrileri (γHV68.wt) ve mutant virüsü (γHV68.mut) + / + ve Mavs - / - hücrelerinde MEFS (MOI = 0.01). MEFS bir İçişleri Bakanlığı 0.01 de γHV68 ile enfekte edildi. Hücreler ve süpernatan belirtilen zaman noktalarında hasat edilmiş ve viral titreler NIH 3T3 tek tabaka ile bir plak deneyi ile belirlendi. ΓHV68 ile enfekte edilmiş NIH3T3 hücreleri içinde (B) γHV68 RTA mRNA düzeyi (MOI = 0.01). 30 saat sonrası enfeksiyon, toplam RNA γHV68-enfekte NIH 3T3 hücreleri elde edildi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz.

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+latency+and+its+regulation:+lessons+from+the+gamma-herpesviruses.">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li><li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li><li>Strauss, W. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+mammalian+tissues.">Preparation of genomic DNA from mammalian tissues.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).</li><li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li><li>Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+&#946;-herpesvirus+genomes+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Cloning of &#946;-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).</li><li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Viral enfeksiyon yanıt olarak, Mavs-bağımlı doğuştan gelen bağışıklık sinyal yollarının antiviral 10-14 enflamatuvar sitokinlerin üretimini teşvik etmek için aktif hale getirilir. İnsan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epstein-Barr virüsü 3,4 için model virüs olarak mürin γHV68 kullanarak, γHV68 usurps Mavs-IKKβ yolu transkripsiyonel aktivasyonu 5 ile viral litik replikasyon teşvik etmek olduğunu keşfetti. Genetiği değiştirilmiş MEFS ve molekü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> Elektro-MAX DH10B yetenekli hücrelerin </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Metilselüloz </td><td> Sigma </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP Plazmid Miniprep Sistemi </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP Plazmid Midiprep Sistemi </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

Viral enfeksiyon yanıt olarak, bir dizi gibi antiviral sitokin üretimini 1,2 yol doğuştan gelen bağışıklık sinyal yolakları aktive gibi çeşitli savunma yanıtları, geliştirir. Ana koloni için, virüs konak antiviral yanıtları kaçmasına ve sinyal yolları işlemek için zorunlu bulunmaktadır. Konak-virüs etkileşimi unraveling viral enfeksiyona karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi ışık tutacaktır. Mürin γHV68 yakından insan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epsten-Barr virüsü 3,4 ilişkilidir. laboratuvar farelerde γHV68 enfeksiyonu insan herpesvirüslerinin için mevcut değildir vivo, konak yanıtları ve viral enfeksiyon tüm kurs incelemek için uysal küçük bir hayvan modeli sağlar. Bu protokol, biz γHV68 litik replic bir fenotipik karakterizasyon yöntemleri paneli ve ana sinyal bileşenlerinin moleküler diseksiyonu sunmakvivo ve ex vivo hem ation. Genetiği değiştirilmiş fare suşlarının durumu vivo γHV68 akut enfeksiyon sırasında ana sinyal yollarının rolleri sorgulamaya izin verir. Buna ek olarak, bu eksik fare suşu izole edilmiş fare embriyo fibroblast (MEFS) ileri γHV68 litik çoğaltma ex vivo sırasında bu moleküllerin rolleri incelemek için kullanılabilir. Virolojik ve moleküler biyoloji deneyleri kullanarak, konak-virüs etkileşimlerinin moleküler mekanizması kesin ve viral litik replikasyon için gerekli ana ve viral genleri tespit edebilirsiniz. Son olarak, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) sistemi özellikle ev sahibi-virüs etkileşim kesme viral faktör (ler) içine mutasyonların girişini kolaylaştırır. Bu mutasyonlar taşıyan rekombinant γHV68 bileşenleri sinyal anahtar konak içinde eksik MEFS içinde γHV68 litik çoğaltma fenotipleri tekrarlamak için de kullanılabilir.Bu protokol vivo ve ex vivo müdahale birden çok düzeyde konak-patojen etkileşimi sorgulamak için mükemmel bir strateji sunar. Son zamanlarda, biz γHV68 usurps doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon yolağı viral litik replikasyon 5 teşvik etmek olduğunu keşfettiler. Özellikle, γHV68 de novo enfeksiyonu bağışıklık kinaz IKKβ aktive Olmanız IKKβ viral transkripsiyonel aktivasyon teşvik etmek, ana viral transkripsiyon faktörü, çoğaltma ve Transaktivatörü (RTA) fosforile. Bunu yaparken, γHV68 verimli çiftler doğal immün aktivasyon ev sahipliği için transkripsiyonel aktivasyon, böylece viral transkripsiyon ve litik replikasyon kolaylaştırmak. Bu çalışmada ana-virüs etkileşimi sorgulamak diğer virüsler uygulanabilir mükemmel bir örnek sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus at JoVE.com

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center. Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Video: Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.