Name: ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1
Uploaded: 2015-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

Biz teknik danışmanlık için B6.A2G-MX1 fareler ve Semra Özçelik sağlamak için Peter Staeheli teşekkür ederiz. Bu çalışma SFB829 ve KN536 / 16 ile Alman Araştırma Vakfı ve Tıp Köln Fortune Program / Fakülte, Köln Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Etik bildirimi. Kurban hayvanlardan epidermal tabakaların hazırlanması Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz, Northrhine-Vestfalya (Almanya) ve Kılavuz önerileri ile tam uyum içinde yürütülür. Çalışma LANUV NRW (Sayı 8.84-02.05.20.13.018) tarafından onaylanmıştır. Göstergeler ve Kültür Medya 1. Hazırlık <ol><li> Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) / yüksek glukozlu glutamin dipeptid,% 10 FCS, 100 lU / ml penisilin içeren ve / ml streptomisin, 100 ug (bundan sonra &quot;DMEM&quot; olarak anılacaktır), epidermal yaprak geliştirin. </li><li> Epidermal tabakaların hazırlanması için, dikkatli bir şekilde ısıtılmış PBS (kadar 37 ° C) &#39;de dispaz II tozu (5 mg / ml) çözülür. 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre edin ve solüsyonu tedavisi için doğrudan kullanılır. </li><li> Epidermal bütün hazırlanması 13 bağlar için, buff bloke hazırlanması% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile er. Maddeler bir döner mikser üzerinde oda sıcaklığında en az 2 saat süre ile kuluçkaya bırakılması ve erimesine izin verir. Ayrıca yıkama tamponu gibi PBS içinde Tween 20% 0.2 hazırlar. Tespit için,% 3.4 ve PBS içinde% 4 formaldehit hazırlar. </li><li> Cryosections immün için,% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20, PBS tamponu ile bloke hazırlar. Tespit için, PBS içinde% 0.5 Formaldehit hazırlar. </li></ol> Fare Skin gelen Epidermal Levhaların 2. Hazırlık <ol><li> Enfeksiyon çalışmaları için yeni doğan arka deri epidermis hazırlanması <ol><li> Bir diseksiyon çanak içine bir decapitated fare (1 ila 3 gün doğumdan sonra) yerleştirin ve ekstremitelerde kesti ve gövde yakın kuyruk tam gövde derinin etkili kaldırılmasını sağlamak için. Ekstremite kaldırılması sırasında, çapı mümkün olduğunca küçük kesikler tutmaya çalışın. </li><li> Kavisli ince forseps a ile gövde Fixyavaşça gövdeden cilt ayırmak için sırt boyunca kaudal kafatasın deri altına künt uçlu makas hareket nd. Sırt boyunca cildi kesti. </li><li> FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için gövde itmek doku ve kör uç makas düzeltmek için forseps kullanarak gövde komple deri soyulabilir. Cryosections veya tüm bağlar hazırlanması için arka cilt sadece parçalara ayırın. </li><li> Yaklaşık 10 x 10 mm 1-2 parçaya bir neşter ile arka cilt doğrayın. ~ 1 ml steril PBS ile 6 oyuklu plakanın bir kuyuda parçaları koyun. Dermal tarafı dibe baktığından emin olun. </li><li> 1.5 mi dispase II (5 mg / ml PBS) ile PBS yerine yerleştirin ve 4 ° C / 30 (tam araç için olan) 37 ° C&#39;de min veya O biri için N inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Yavaşça epidermisin kaldırmaya yatan dermis ve diğer forseps düzeltmek için bir forseps kullanarak bozulmamış levha olarak epidermis kaldırın. Bu adımı EAS yapmak için bir Dürbünü kullanıny. Alt yönelik bazal tarafı ile DMEM içine epidermal sayfasını aktarın. Enfeksiyon deneyler için hemen yapraklarını kullanın. Not: özellikle, FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için yeni doğmuş deriden epidermis hazırlanmasını kullanın. Nedeniyle kırılganlık, cryosections veya bütün araç için olan enfekte edilmiş tabakaların hazırlanması daha az uygundur. </li></ol></li><li> Enfeksiyon çalışmaları için yetişkin kuyruk ciltten epidermis hazırlanması <ol><li> Servikal dislokasyon ile 1 ila 3 aylıkken fareler Euthanize. Sırtında uzun gömülü saç folikülleri bozulmamış epidermal yaprak ayrılmasını engelleyen beri yerine arka cilt kuyruk alın. Kurban farelerden alınan kuyruk kesti ve bir neşter ile uzunlamasına onu yarık. </li><li> Kemikten deri soyulabilir ve yaklaşık 5 x 5 mm parçalar halinde bir neşter ile doğrayın. Tek kuyuda 4 adet koyun ve 2.1.5 bölümünde anlatıldığı gibi dispase II inkübasyon devam NOT: yetişkin tail deri cryosections veya tüm bağlar hazırlamak. Seçenek olarak acil kullanım için, kuyruk depolanmış ya da önemli enfeksiyonun etkinliğini kaybetmeden 4 ° C&#39;de yaklaşık 24 saat süre ile nakledilebilir. Kuyrukları 48 saat kadar tutulur ise, epidermal yaprak pek HSV-1 ile enfekte olabilir. </li></ol></li><li> FACS analizi için, epidermisin ayrışma Not: FACS analizi ile yüzey proteini ifade Algılama hücre yüzeyi ile ilgili proteini zarar vermeyen uygun bir hücre ayrışma teknikleri gerektirir. <ol><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ve 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak inkübe edin. </li><li> 3 ml DMEM ekleyerek inkübasyon durdurun. Keratinositler çözülmüş olsun şekilde hafifçe 6-çukurlu plaka içindeki epidermis taşımak için kavisli bir ince forseps kullanılarak keratinositler ayrıştırmaları. Hücre süspansiyonu toplayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayınher zaman taze DMEM kullanarak. NOT: Bu ayrılma işlemi keratinositlerin yüzeyinde adiponektin-1 tespit etmek için uygundur. </li><li> Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında 15 dakika ve 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca enzimsiz hücre ayrışma çözeltisi epidermal yaprak (CDS) inkübe edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı CDS pipetleme keratinositler dışarı floş oda sıcaklığında 15 dakika inkübe başka. </li><li> Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanılarak yıkama adımı 3 kez tekrarlayın. NOT: Bu ayrılma HVEM yüzey ekspresyonunu tespit etmek için uygundur. CDS çözümün dezavantajı daha az hücre rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile daha ayrışmış olmasıdır. Buna ek olarak, rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile enfekte epidermal tabakaların disosiasyon sonra sentezleme gibi ICP0 ifadesi olarak çekirdek ya da sitoplazmik sentezlenmesi FACS ile analiz edilebilir yüzey. </li></ol></li><li> Epidermisin Ayrılma keratinositler veya ex izole etmekyolu RNA <ol><li> 1,5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi içeren çanak tabanına doğru taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak koyun. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. 3 ml DMEM ekleyin ve hafifçe çanak epidermis taşımak için kavisli ince forseps kullanarak keratinositler ayırmak. </li><li> Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanarak bu adımı 3 kez tekrarlayın. RNA veya kültür birincil fare keratinositlere ayıklamak için bu hücre süspansiyonu kullanın. </li></ol></li></ol> HSV-1 ile epidermal Levhaların 3. Enfeksiyon <ol><li> 500 ul DMEM daha az HSV-1 ağırlık suşu 17 11 içeren bir çözelti hazırlanması ve epidermal tabakalar kayan olan virüs çözeltisi orta yerine. Bu zaman noktası, zaman 0 12 olarak tanımlanır. 37 ° C&#39;de 24 oyuklu plakanın bir kuyuda bir epidermal tabakasının enfeksiyonu gerçekleştirin. Virüs titresi hesaplanması tahmini sayısına dayanırepidermal tabaka başına taban tabakadaki hücrelerin (yaklaşık olarak 5 x 5 mm levha başına 2 x 10 5 hücre). </li><li> HSV-1, yaklaşık 100 plak oluşturucu birimler (PFU) / hücre ile enfekte ve sonra 1 saat pi de DMEM virüs içeren ortam yerine NOT: Yenidoğan cilt epidermal yaprak durumunda, yaprak inkübasyon sırasında ayırmak başlar unutmayın. </li></ol> Enfekte hücreler 4. Görselleştirme <ol><li> Epidermal Tüm Mounts 13 <ol><li> % 3.4 formaldehid, 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile epidermal yaprak sabitleyin. PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve oda sıcaklığında 14 1 saat boyunca, TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile bloklayın. </li><li> 15, oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde 1:60 oranında seyreltilen fare anti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) sahip levhalar O / N inkübe edin. Ara filaman ağını görselleştirmek için tavşan poliklonal ile eş zamanlı olarak kuluçkaya antiFare keratin 14 (100 ng / ml). </li><li> Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile 4 ila 5 kez yıkayın. O / N AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml), AF555-konjüge edilmiş anti-tavşan IgG (1 ug / ml) ve DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng inkübe oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde / ml). </li><li> Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile yıka. Bir örnek slayt üstünde bazal tarafı Mount epidermal yaprak, floresan montaj orta embed ve lamelleri ile kaplayın. </li></ol></li><li> Epidermal Cryosections <ol><li> Yetişkin epidermal tabakalar oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit içinde sabitleştirildi, PBS ile 2 kez yıkanmıştır. Dokuda göm sabit levhalar sıvı azot içinde orta ve donma donma. Bir cryomicrotome ile 8-10 mikron bölümleri kesin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Formaldehit ile tekrar bölümler saptamak PBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20 ile blok ile 2 kez yıkanır ve daha sonra m, 60 dakika boyunca lekeAnti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) 15 bloke edici tampon ile yıkanarak 3 kez, ardından bloke tamponu içinde 1:60 seyreltilmiş OUSE. </li><li> Daha sonra oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile blokaj tamponu AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml) ve DAPI (100 ng / ml) ile inkübe edilir ve 3 kez yıkayın. Floresan montaj orta bölümleri göm ve lamelleri ile kaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Koelle, D. M., Corey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex:+insights+on+pathogenesis+and+possible+vaccines.">Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines.</a> Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+Viruses.">Herpes simplex Viruses.</a> Fields Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Syrj&#228;nen, S., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Hukkanen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+establishment+of+lytic+and+nonproductive+infection+by+herpes+simplex+virus+type+1+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).</li><li>Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+and+replication+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+an+organotypic+epithelial+culture+system.">Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system.</a> Virology. 230, 236-243 (1997).</li><li>Hukkanen, V., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Syrj&#228;nen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+infection+has+two+separate+modes+of+spread+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).</li><li>Gescher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+viral+adsorption+and+penetration+by+an+aqueous+extract+from+Rhododendron+ferrugineum+L.+as+antiviral+principle+against+herpes+simplex+virus+type-1.">Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1.</a> Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).</li><li>Petermann, P., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Rac1+and+Cdc42+signaling+during+early+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+keratinocytes.">Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes.</a> J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).</li><li>Everett, R. D., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+IE+protein+Vmw110+causes+redistribution+of+PML.">HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML.</a> EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).</li><li>Chrostek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+is+crucial+for+hair+follicle+integrity+but+is+not+essential+for+maintenance+of+the+epidermis.">Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).</li><li>Petermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+mechanisms+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+into+murine+epidermis:+Involvement+of+nectin-1+and+HVEM+as+cellular+receptors.">Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors.</a> J. Virol. 89, 262-274 (2015).</li><li>McGeoch, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+DNA+sequence+of+the+long+unique+region+in+the+genome+of+herpes+simplex+virus+type+1.">The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1.</a> J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).</li><li>Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+exhibits+a+tropism+for+basal+entry+in+polarized+epithelial+cells.">Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells.</a> J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130, 5241-5255 (2003).</li><li>Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+pathways+of+herpes+simplex+virus+type+1+into+human+keratinocytes+are+dynamin-+and+cholesterol-dependent.">Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent.</a> PLoS One. 6, e25464 (2011).</li><li>Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+form+of+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+is+expressed+in+a+cell+type+dependent+manner.">A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner.</a> Virology. 197, 751-756 (1993).</li><li>Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induces+a+unique+protein+in+mouse+cells+bearing+a+gene+for+resistance+to+influenza+virus.">Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).</li><li>Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cyclodextrins+for+manipulating+cellular+cholesterol+content.">Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content.</a> J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cholesterol+depletion+by+cyclodextrin+on+the+sphingolipid+microdomains+of+the+plasma+membrane.">Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane.</a> Biochem. J. 335, 433-440 (1998).</li><li>Yancey, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+cholesterol+efflux+mediated+by+cyclodextrins:+Demonstration+of+kinetic+pools+and+mechanism+of+efflux.">Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux.</a> J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).</li><li>Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus-1+entry+into+cells+mediated+by+a+novel+member+of+the+TNF/NGF+receptor+family.">Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family.</a> Cell. 87, 427-436 (1996).</li><li>Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+alphaherpesviruses+mediated+by+poliovirus+receptor-related+protein+1+and+poliovirus+receptor.">Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor.</a> Science. 280, 1618-1620 (1998).</li><li>Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+entry+receptors+for+herpes+simplex+virus+and+their+roles+in+disease.">Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease.</a> Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).</li><li>Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+adhesion+molecule+nectin-1+is+critical+for+normal+enamel+formation+in+mice.">The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).</li><li>Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesvirus+entry+mediator+as+a+negative+regulator+of+T+cell-mediated+responses.">The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses.</a> J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Yetişkin C57BL / deri 6 epidermal tabakalar HSV-1 ile enfekte olduğunda daha düşük virüs dozları ilişkili ise, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre, daha az enfekte olmuş hücrelerin ve daha yavaş olan interfolliküler epidermisin bazal katmanın hemen hemen bütün hücrelerin enfeksiyonu gözlemlemek Enfeksiyonun ilerlemesi. Genel olarak, saç köklerinin enfekte hücrelerin değişken sayısını göstermektedir; Gelişmekte olan saç köklerini astar oldukça küçük keratinositler çoğu enfekte ise, yeti?...

Herpes simpleks virüsü (HSV) yaşamı tehdit eden enfeksiyonların hafif komplike deri ve mukoza lezyonları, insanlarda çeşitli hastalıklara yol açabilir. HSV tip 1 (HSV-1), baskın olarak daha çok genital enfeksiyonlar 1 neden HSV tip 2 (HSV-2) ise, orofasyal enfeksiyonlar ve ensefalit ile ilişkilidir. HSV, kültür hücreleri girer enfeksiyon başlatır ve viral döl üreten nasıl anlaşılmasında önemli bir ilerleme olsa da, biz hücresel düzeyde 2&#39;de doku içine viral invazyonu yolunun (ler) hakkında çok az şey biliyoruz. HSV deri ya da mukoza enfeksiyonu, farelerin çalışmaları için, tavşan ve gine domuzları, hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Cilt enfeksiyonu intradermal enjeksiyonu ile veya virüs varlığında cilt çizilmemesi tarafından kurulmuş ve hastalık gelişimi virüs üretimi ile ilişkili olduğu saptandı. Bu yöntemler hastalığın patogenezinde çeşitli yönlerini anlamasına yardım ve antiviral ilaçlar değerlendirmek için kullanılır. Tissu&#39;nun HSV enfeksiyonu araştırmake düzeyi organotipik insan derisi modelleri uygulanmıştır. Enfeksiyon oranı, bu Sal kültürlerinde sınırlıdır gibi, enfeksiyon, viral yayılmayı çok çalışma yapılmış ve antiviral bileşenlerin etkileri sadece sınırlı sayıda 3-6 yayınlanmıştır. Sağlam epitel HSV-1 enfeksiyon esnasında bir rol oynayabilir, hücresel belirleyicilerini karakterize etmek için, sıçangil epidermis 7 ex vivo enfeksiyon çalışmalar için bir protokol kurulmuştur. Cilt yenidoğan veya yetişkin farelerin kuyrukları hazırlandı. HSV-1 virüsü içeren bir ortamda batık bulundu komple deri örnekleri, enfekte olabilir bu yana, biz dispase II muamele ile epidermis, dermis ayrılmış. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal tabakaların kayan sonra, enfekte olmuş hücreler, çeşitli katı İnokulasyonu (pi) 7 de epidermal bazal tabakasında, görüntülenebilir. Viral replikasyon a önce tek tek hücrelerin enfeksiyonunun başlamasını görselleştirmek içinnd virüs üretimi, HSV-1 enfeksiyon sırasında ifade edilen ilk proteinlerden biridir enfekte hücre proteini 0 (ICP0) karşı bir antikorla boyanmıştır. ICP0 hücresel lokalizasyonu, erken enfeksiyon sırasında farklı faz geçer. ICP0 viral gen ifadesinin erken aşamasında, nükleer odaklarda mevcut iken, sitoplazma ICP0 bir yerelleştirme enfeksiyonu 8 müteakip bir faz gösterir. Biz enfeksiyon sırasında çeşitli hücresel faktörlerin potansiyel rolünü test etmek için farklı fare modelleri epidermal yaprak ex vivo enfeksiyon deneyi kullanıldı. Aktin dinamiklerinin önemli bir regülatör olarak Rac1 etkisini gidermek için, biz Rac1 gen 9 bir keratinosit özgü silinmesi ile farelerin epidermis bulaşmış. Bu model epidermal keratinosit katmanları HSV-1 enfeksiyonu verimliliği üzerinde eksik Rac1 sonuçlarını incelemek için bize izin verdi. Yeniden kontrol littermates enfekte epidermis karşılaştırmaRac1 olmaması epidermis 7 bazal tabakasında enfeksiyonun başlaması üzerinde etki gösteren, anlamlı bir fark bozukluk saptanmadı. Daha fazla fare modellerinin kullanımı bize hücresel reseptörler epidermis içine girişini arabuluculuk hangi adrese izin verdi. HSV-1 ile adiponektin-1- ya da HVEM-eksikliği olan farelerde birinden epidermal yaprak bulaşmasını doku içine ilk viral girişi güçlü adiponektin-1 10 varlığına bağlıdır olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, sonuçlar, aynı zamanda HVEM adiponektin-1 10 kadar verimli değildir, sıçangil epidermiste reseptör olarak görev yapabilir göstermektedir. Epidermal katmanlar durumunda enfekte olan hücreler uzamsal dağılımını çözmek için, doku bölümleri ve epidermal bütün tamponla (Şekil 1) ICP0 tanımının görüntülenmesi. Tüm deri cryosections, hiçbir ICP0-ifade eden hücreler (Şekil 1) tespit edilir. Bunun aksine, epidermal tabakaların cryosections sitoplazmik göstermektedirZaten 3 saat pi (Şekil 1) bazal tabakada ICP0 ifade. Daha sonra zamanlarda, viral görüntülenebilir katmanları suprabazal yayılma. Bazal tabakasında enfekte hücrelerin mekansal dağılımı kolayca epidermal bütün bağlar (Şekil 1) takip edilebilir. HSV-1 100 PFU / hücre de enfeksiyon üzerine, interfolliküler epidermisin bazal keratinositlerin yaklaşık olarak% 50 bir çok enfekte hücreleri nükleer ICP0 ifade Bu zaman noktasında 1.5 saat pi de ICP0 ekspresyonunu göstermektedir. Erken gen ekspresyonunun daha sonraki bir aşamaya işaret sitoplazmaya ICP0 bir yerelleştirme 3 saat pi (Şekil 1) hemen hemen bütün hücrelerde bulunur. Ex vivo HSV-1 enfeksiyonu üzerine bulaşmış hücrelerin görselleştirme Bu modlar inhibitörleri veya doku viral girişi ve yayılması / silinmiş mutasyona uğramış hücre bileşenlerinin etkisini araştırmak için güçlü bir tahlil sağlar.

<table><tbody><tr><td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966047</td><td>needed for cultivation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>dispase II powder</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>has to be solved in heated PBS</td></tr><tr><td>enzyme-free cell dissociation solution</td><td>Sigma</td><td>C5914</td><td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>TrypLE select cell dissociation solution</td><td>Life Technologies</td><td>12563-029</td><td>needed for dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>chelex 100 resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td></tr><tr><td>gelatin from cold water fish skin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21429</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (conc.: 0.1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>36670</td><td>used to counterstain the nucleus</td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

Insan ana girmek için, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), mukoza yüzeyleri, deri ya da kornea engeli aşmak gerekir. HSV-1 hedefleri ilk girişi sırasında keratinositler ve nöronların latent enfeksiyon takip eder epitel, bir ilköğretim enfeksiyon oluşturur. Reaktivasyonu sonra, virüsler deri veya mukozal ülserler veziküller olarak görünür mukokutanöz sitelerde belirgin hale gelebilir. HSV-1 deri veya mukoza işgal ve ulaştığı Nasıl onun reseptörleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel düzeyde epidermal doku içine HSV-1 işgali rota araştırmak için, deride primer ve tekrarlayan enfeksiyon siteyi temsil eden fare epidermisin bir ex vivo enfeksiyon modeli kurdu. Tahlil fare deri hazırlanmasını içermektedir. Epidermis dispaz II muamele ile dermis ayrılır. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal yüzer tabaka sonra, doku sabittir ve enfeksiyonunun çeşitli zamanlarda İnokulasyonu de görselleştirilebilirHSV-1-erken proteini ICP0 karşı bir antikor ile enfekte olmuş hücrelerin boyanması. ICP0 sentezleyen hücrelerin 1,5 saat İnokulasyonu zaten bazal keratinosit tabakada gözlenebilir. Uzun enfeksiyon süreleri ile enfekte olan hücreleri enfeksiyon bazal keratinositler sınırlı, ancak virüs dokusunda diğer katmanlarına yayılır olmadığını belirten suprabazal katmanlarında tespit edilir. Çeşitli fare modellerinin epidermal sayfaları kullanarak, enfeksiyon protokolü dokusu içine HSV-1 işgali katkıda hücresel bileşenlerin katılımı belirleyen verir. Ek olarak, analiz, ilk giriş adımları müdahale doku inhibitörleri, hücre-hücre yayılması ve virüs üretimini test etmek için uygundur. Burada, detaylı ex vivo enfeksiyon protokol açıklar ve adiponektin-1- veya HVEM eksik fareler kullanarak sonuçlarını sunmak.

Yöntemin meydan HSV-1 bazal tabakadan nüfuz içine epidermal yaprak hazırlamaktır. Kritik bir adım fare suşu bağlı adapte edilmesi gerekir dispase II tedavi ile dermis epidermis ayrılmasıdır. Dispase II konsantrasyonu 2.5 ile 5 mg / ml, ve 20 ila 45 dakika ile fırınlama süresi aralığında olabilir. Ara filaman protein keratin 14 boyama kolayca bazal epidermal tabaka enfekte veya enfekte olan hücreleri (Şekil 2), sadece çok sınırlı sayıda gösterecektir olmadığını edilip edilem...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

ex-vivo-infection-of-murine-epidermis-with-herpes-simplex-virus-type-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K Görüntüleme.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Video: Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Nörobilim

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a seroprevalence that ranges from 60-90% worldwide, the Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) commonly causes mucocutaneous lesions of the orofacial region which also manifest as lesions and infection-associated blindness. While current antiviral drugs are effective, emergence of resistance and persistence of toxic side-effects necessitates development of novel antivirals against this ubiquitous pathogen. Although in vitro assessment provides some functional data regarding an emerging antiviral, they do not demonstrate the complexity of ocular tissue in vivo. However, in vivo studies are expensive and require trained personnel, especially when working with viral agents. Hence ex vivo models are efficient yet inexpensive steps for antiviral testing. Here we discuss a protocol to study infection by HSV-1 using porcine corneas ex vivo and a method to treat them topically using existing and novel antiviral drugs. We also demonstrate the method to perform a plaque assay using HSV-1. The methods detailed may be used to conduct similar experiments to study infections that resemble the HSV-1 pathogen.

We describe the use of a porcine cornea to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

siRNA-Based Inhibition of Autophagy in Herpes Simplex Virus-Infected Immature Dendritic Cells

Source: D&#252;thorn, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60190">siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a small interfering RNA (siRNA)-based technique to interfere with autophagic flux. A siRNA targeting FIP200 mRNA is introduced into monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) using electroporation, causing the knockdown of FIP200 expression and leading to the inhibition of nuclear lamin disruption via autophagy. Upon adding herpes simplex virus (HSV), the nuclear egress of viral progeny is inhibited due to the absence of lamin disruption via autophagic flux.

Herpes Simpleks Virüsü ile Enfekte İmmatür Dendritik Hücrelerde Otofajinin siRNA Bazlı İnhibisyonu

Monocyte-derived DCs were generated from leukapheresis products of healthy donors. For this, a positive vote from the local ethics committee has been ...

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex vivo enfeksiyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

Herpes Simpleks Virüsü ile Enfekte İmmatür Dendritik Hücrelerde Otofajinin siRNA Bazlı İnhibisyonu

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

Herpes Simpleks Virüsü ile Enfekte İmmatür Dendritik Hücrelerde Otofajinin siRNA Bazlı İnhibisyonu

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex vivo enfeksiyon